Sinaptik Vezikül Ekzositozu Doç. Dr. Güvem Gümüş Akay Ank. Üniv. Disiplinlerarası Sinirbilim Doktora Programı/ Sinapsların Moleküler Nörobiyolojisi

Sinaptik Veziküller NT salınımında merkezi rol oynayan ~ 40nm çapındaki organellerdir. Her presinaptik aksonal buton NT ile doldurulmuş yüzlerce sinaptik vezikül içerir.

Ekzositoz sırasında Aksiyon potansiyeli presinaptik membranı depolarize ettiği zaman Ca2+ kanalları açılır Ca2+ nöron içerisine doğru giriş yapar İçeri giren Ca2+ , sinaptik vezikül ekzositozunu tetikleyerek NT’lerin sinaptik yarığa salınmasına neden olur. Bu tetikleme Ca2+‘un sinaptotagmin’e bağlanması ile gerçekleşir.

Ekzositozdan sonra Veziküller endozitozla hücre içerisine alınır ve geridöşüme uğratılarak tekrar NT ile doldurulurlar.

Vezikül Geridönüşümü Çok sayıda paralel yolakla meydana gelebilir: «Kiss-and-Run» «Kiss-and-Stay» «Endozomal aracılı»

Sinaptik Veziküler Küçük hacimleri nedeni ile sınırlı sayıda protein içeriğine sahiptirler. Vezikül bileşenlerinin tam olarak fonksiyonları aydınlatılmayı beklemekle birlikte, pekçok vezikül bileşeni 3 temel işleve sahiptir. NT’lerin alınması ve depolanması Vezikül ekzositozu Vezikül endositozu ve geridönüşümü

Vezikül bileşenlerinin, vezikül biyogenezinde de rol oynadığı düşünülmekle birlikte; veziküllerin nasıl yapıldığı ve büyüklüklerini neyin belirlediği tam olarak net değil.

Membran Füzyonu Ökaryotik hücreler için evrensel bir süreçtir. Membranöz organellerin oluşturulması ve füzyonu yaşamsal pekçok sürecin temelini oluşturur. Hücrelerin kompartmanlar şeklinde organize edilmesi  sinaptik iletim, fertilizasyon, immün yanıt vb…

SNARE proteinleri sinaptik vezikül füzyonuna aracılık eder

SNARE proteinlerinin keşfi Clostridial botulinum ve tetanoz toksinleri Güçlü nörotoksinler Presinaptik uca girer ve son derece özgül proteazlar olarak davranarak aksonal buton morfolojisini değiştirmeden membran füzyonunu engellerler

SNARE proteinleri Snaptobrevin/VAMP (R-SNARE) SNAP-25 Sintaksin-I Bu 3 protein membran füzyon makinesinin temel bileşenleridir.

Clostridial nörotoksin çalışmalarından önce gerçekleştirilen in vitro füzyon çalışmaları sırasında «NSF» adı verilen ve membran trafiğinde önemli rol oynayan bir protein tanımlanmıştır NSF= N-ethylmaleimide Sensitive Factor

Nörotoxin verileri ışığında staptobrevin, SNAP-25 ve sintaksin proteinlerinin tanımlanmasının hemen ardından bu 3 proteinin birbirleriyle kompleks oluşturduğu ve bir ATPaz olan NSF’nin bu kompleksi bileşenlerine ayırdığı gözlendi. Bunedenle komlekse SNARE adı verildi Soluble NSF-Attachment protein Receptor

Hipotez Trans-SNARE kompleksleri veziküller ve plazma membranı arasında köprü vazifesi görerek veziküllerin membrana yönelip kenetlenmesi için spesifikliği belirlemektedir.

SNARE kompleksi Yapı olarak son derece stabil Snaptobrevin ve sintaksinin transmembran domainlerine komşu olan helikal bölgelerinin paralel düzenlenmesi ile oluşur

SNARE kompleksinin kurulumu enerji açığa çıkarır ki bu enerji membranların füzyonu sırasında membranlarını birbirine yaklaştırıcı güç olarak kullanılır.

trans-SNARE kompleksi SNARE kompleksi parelel 4 heliks demeti içerir Hipotez değil

SNARE proteinleri ve Füzyon «Kurulma ve Ayrılma Döngüsü» şeklinde iş görürler SNARE kompleksinin oluşması: Füzyon için gerekli gücü sağlamak SNARE kompleksinin ayrılması: Bir sonraki füzyonda kullanılmak üzere SNARE proteinlerinin hazır olmasını sağlamak

SNARE Döngüsü Amino-uç  Karboksi-uç Füzyona uğrayacak membranlar arası boşlukta köprü oluşturan trans-SNARE komplekslerinin fermuar gibi kapanması ile başlar Fermuarın tam kapanması membranda füzyon-porunun açılmasına neden olur

SNARE Döngüsü Porun açılmasından sonra, iki membran tamemen birbiri üzerine çakışmış hale gelir trans-SNARE kompleksleri, cis-SNARE komplekslerine dönüştürülür. cis-SNARE kompleksleri daha sonra NSF ve SNAPler tarafından monomerlerine ayrılır.

SNARE Döngüsü Bu döngüde NSF, SNARE proteinlerini «enerji ile yükler» Reaktif SNARE proteinlerinin enerjisi, SNARE kompleksinin kurulumu yoluyla füzyon işleminde kullanılır.

SNARE Kompleksinin Kurulumundaki Özgüllük SNARE proteinleri karakteristik aa dizisine sahiptir 6 adet heptad tekrarı içeren 60-70 aa uzunluğunda Pek çok SNARE proteini 1 adet SNARE motifine sahiptir. SNAP25’de ise 2 adet SNARE motifi bulunmaktadır.

SNARE proteinlerinde bulunan SNARE motifleri, SNARE kompleksinin 4-heliks sarmal bobin (coiled coil) yapısını oluştururlar

SNARE Proteinleri SNARE proteinleri içerisinde en basit yapıya sahip olan Sinaptobrevindir SNAP-25de 2 adet SNARE motifi ve bir bağlayıcı bölge bulunur. Bu bölgenin palmitoilasyonu ile membrana tutunur Sintaksin ise en kompleks yapıya sahip SNARE proteinidir Korunmuş amino-terminal bölgesi, buna komşu kendiliğinden katlanan Habc domaini, SNARE motifi ve TM çapa domaini içerir

Sintaksin Genel olarak bakıldığında membrana tutunma domaini ve SNARE motifleri proteinin yaklaşık 1/3’ini oluşturur. Proteinin büyük bir kısmı ise «non-SNARE» dizilerden oluşmaktadır.

Kompleksteki 4-heliks demeti temel olarak hidrofobik etkileşimler sonucu oluşturulur

SNARE Motifleri Protein dizi analizleri sonucunda SNARE motiflerinin 4 grup şeklinde sınıflandırılabileceği görülmüştür. Qa-SNARE Qb-SNARE Qc-SNARE R-SNARE

R-SNARE: Transport vezikülü  v-SNARE Q-SNAREs: Alıcı membran  t-SNARE

SM Proteinleri Membran füzyonunda SNARE proteinlerinin son derece önemli partneridirler Biri veya diğerinin olmadığı koşullarda füzyon meydana gelmez Yaklaşık 600 aa uzunluğunda evrimsel olarak korunmuş proteinlerdir. Yay şeklinde tokaya benzer

SM Proteinleri Sintaksin’lerin amino-ucundaki korunmuş dizi SM proteinleri ile bağlanır

SM Proteinleri Bu bağlanma SNARE kompleksinin oluşmasına engel değildir. Bağlanma bölgesi SNARE motiflerini içermez

Sinaptik Ekzositoz için SNARE proteinleri neden SM proteinlerine ihtiyaç duyuyor?

Net bir yanıtı yok. SNARE kompleksinin paketlenmesinde rol oynayabileceği düşünülüyor. «Bu bağlanmanın SNARE komplekslerini uzaysal organizasyonunu sağlıyor ve füzyone olan membranlar arasındaki boşluğun içine doğru kaymalarını engelleyerek kompleksin oluşmasına yardımcı oluyor olabilir» «Füzyon sırasında doğrudan fosfolipid karışmasını katalizliyor olabilir»

SM Proteinleri Primer fonksiyonları füzyonu regüle etmek değil, yönetmek Delesyonları füzyonu ortadan kaldırıyor Ca2+, fosforilasyon ve diğer ikincil mesajcılar gibi klasik sinyal iletim mekanizmaları ile düzenlenmiyorlar

SNARE- ve SM-protein kompleksleri Veziküllerin hedef membranlara tutunmasını stabilize ederek «kenetlenme»de rol oynarlar Vezikül yönlendirilmesi sırasında, ekzositozdan önce meydana gelmektedir.

SNARE Şaperonları: CSP- α ve Sinükleinler: Herbir NT salınma olayı, SNARE kopmlekslerinin kurulması ve bu komplekslerin NSF ve SNAPler aracılıyla ayrılması süreçlerini içermektedir. Belirli bir zaman anında pre-sinaptik uçta yüzlerce katlanmamış veya kısmen katlanmış SNARE-protein molekülleri bulunur. Bu katlanmamış veya kısmen katlanmış proteinler spesifik olmayan etkileşimlere veya yanlış katlanma olaylarına yatkın SNARE motiflerine sahiptir. Bu nedenle nöronlarda bu katastrofiyi engelleyecek, yani SNARE proteinlerini işlevsel konformasyonlarında tutacak ve SNARE-kompleks oluşumunu destekleyecek en azından iki şaperon sistemi bulunmaktadır.

CSP- α, Hsp70 ve SGT Sinükleinler Her ikisi de nörodejenerasyon ile ilişkili Yanlış katlanmış ve/veya anormal yapılanma gösteren SNARE proteinlerinin varlığı nöronal sağ kalıma engel olmaktadır.

CSP- α Evrimsel olarak korunmuş sinaptik vezikül proteinidir Şaperonlara özgü DNA-J domain içerir. DNA-K domain içeren Hsp-70 ve tetratrikopeptid tekrar proteini SGT ile kompleks oluşturduğunda, deneysel olarak Denatüre edilmiş proteinlerin katlanmasına aracılık ettiği SNAP-25’lerin agregasyonunu engellediği gösterilmiştir.

Farede CSP-α delseyonu NT salınmasına hemen etkisi görülmüyor SNAP-25lerin ubiquitin aracılı degredasyonunu artıyor 2-3 aylıkken nörodejenerasyon nedeni ile ölüyor

Sinükleinler α-, β- ve Ɣ-sinükleinlerden oluşan bir protein ailesi α -sinüklein mutasyonları veya aşırı ifadesi Parkinson hastalığı ile ilişkili Pek çok nörodeneratif hastalıkta gözlenen Lewy cisimcikleri alfa-sinüklein içeriyor

Sinükleinler Negatif yüklü fosfolipidlere bağlanan küçük proteinlerdir. CSP-α KO farelerde orta seviyede ekspresyonları bile letal nörodejenerasyonu engelleyebiliyor. Tüm sinüklein izoformalarının delete olduğu farelerde Letalite gözlenmiyor 1 yaştan sonra yaşa-bağlı nörojenerasyon gözleniyor

α-sinüklein normal olarak SNARE-kompleksinin kurulumuna aracılık eder. Ancak bu genin duplikasyonu veya triplikasyonunun gözlendiği hastalarda, alfa-sinüklein’in aşırı ifadesi neden nörodejenerasyona neden oluyor?

Artmış SNARE-şaperonlanması füzyon dengesini bozacağı için zararlı olabilir α-sinükleinin yanlış katlanması nörodejenerasyona neden oluyor olabilir.

SNARE/SM Protein Füzyon Makinesinin Aktif Zona Montajı Sinaptik ekzositoz sırasında sinaptik veziküller proteince son derece zengin aktif zona kenetlenir ve füzyon gerçekleşir. Aktif zonda en az 4 anahtar protein bileşeni bulunmaktadır Munc13’ler RIM’ler RIM-BP’ler Alfa-riprinler Piccolo/Bassoon, ELKS(CAST)

Bu aktif zon proteinleri bütün sinaps türlerinde mevcut CASK, Velis, Mints , endositik iskele proteinleri (intersektin, sindapin, amfifisin,…) Bu aktif zon proteinleri bütün sinaps türlerinde mevcut Eksitatör/inibitör Nöromusküler junction Ribbon sinapslar

Aktif zon Pre-sinaptik uçların birbiri ile örtüşen 3 temel fonksiyonuna aracılık eder 1. Sinaptik veziküller, Ca2+ kanalları ve diğer pre-sinaptik bileşenleri tek bir kompleks şeklinde fiziksel olarak birbirine bağlamak Hızlı sinaptik iletim için tüm bileşenlerin kolokalizasyonunu gereklidir.

Aktif zon 2. Pre-sinaptik reseptörleri organize ederek NT salınımının pre-sinaptik modülasonuna olanak sağlamak. 3. Kısa- ve uzun-süreli plastik plastisitenin pek çok formuna aracılık etmek.

Munc13’ler ve RIM’ler Yapısı en iyi tanımlanmış ve fonksiyonları en iyi anlaşılmış aktif zon proteinleridir Multidomain protein yapısındadırlar

Munc13 Çok sayıda promotor’dan eksprese olan çok sayıda izoformu söz konusudur Munc13 izoformlarında Amino- ucunda C2A domaini bulunur. Ca2+ bağlamaz ve homodimerizasyonda rol oynar Ca2+ bağlayan bir merkezi C2B domaini Yönetici MUN domaini Ca2+ bağlamayan C2C domaini yapısında bulunan diğer domainlerdir.

Munc13 Sinaptik vezkülün hazırlanması ve yönlendirilmesi için gereklidir Ca2+ ve RIM tarafından sıkı düzenlenmesi söz konusudur Büyük bir olasılıkla SNARE ve/veya SM proteinleri ile etkileşerek vezikülü yönlendirmektedir

RIM Proteinleri Munc13lerle karşılaştırıldığında domain yapıları daha karmaşıktır İzoformaları söz konusudur α-RIM’ler en baskın olan izoformdur

RIM Proteinleri Amino ucunda bulunan iki bölge ile bir yandan GTP-bağlama proteini olan Rab3 ile diğer yandan da Munc13’ün C2A domaini ile etkileşir. Eğer RIM varsa Munc13 homodimer oluşturmak yerine RIM ile Munc13/RIM heterodimerini oluşturur.

RIM Proteinleri Merkezi PDZ domaini ile ELKS proteinlerine ve Ca2+ kanallarına bağlanır İki adet Ca2+ bağlamayan C2A ve C2B domainleri bulunur Bu domainler arasında yer alan kısa Prolince zengin dizi ile RIM-BP’lere bağlanır İkinci C domaini ile de alfa- liprine bağlanır Diğer aktif zon proteinleri ile bağlantıyı sağlayan merkezi bir proteindir.

RIM Proteinlerinin İşlevleri Munc13’ün «priming» aktivitesini düzenlemek. Ca2+ kanallarını aktif zona bağlamak Doğrudan: Ca2+ kanallarına PDZ domainleri aracılığı ile bağlanırlar Dolaylı yoldan: RIM-BP aracılığı ile bağlanırlar

RIM Proteinlerinin İşlevleri RIM proteinlerinin delesyonları pre-sinaptik membranda Ca2+ kanallarının kaybolmasına Aksiyon potansiyeli ile indüklenmiş Ca2+ girişinin engellemesine neden olur

ÖZET Sinaptik ekzositoz hiyerarşik olarak organize olmuş bir grup protein aracılığı ile gerçekleşir. SNARE ve SM proteinleri bu organizasyonun çekirdeğini oluşturur İşlevselliği için NSF, SNAPler ve spesifik SNARE şaperon proteinleri rol oynar Diğer aktif zon proteinleri tarafından düzenlenir.