Mikrobiyoloji Laboratuvarı Ders 2 Arş. Gör. Ayşenur YAZICI Erzurum Teknik Üniversitesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü 2017

Mikrobiyoloji Çalışma Alanları Birçok mikrobiyolojik proseste, çalışma malzemelerinin, besiyerlerinin ve stok kültürlerin çevrede bulunan mikroorganizmaların oluşturacağı kontaminasyondan korunması gerekmektedir. Bu bakımdan aseptik teknikler, çalışmanın güvenilirliği ve doğruluğu açısından önem taşımaktadır.

Laboratuvar dizaynı

Laboratuvar dizaynı

Bakteri ve Fungus çalışma alanlarının temizliği için gerekli olan malzemeler Dezenfektan solüsyonları olarak %70’lik Etil Alkol, %4’lük Çamaşır suyu kullanılır. Bünzen beki ve UV strerilizatörleri çalışma ortamının havasını temizler.

Çalışma ortamı %70’lik EtOH ile temizlenmelidir Çalışma ortamı %70’lik EtOH ile temizlenmelidir. Kültürlerle çalışırken veya inkübatör dışında kültürler varken kesinlikle yeme ve içme yapılmamalıdır. Birçok mikroorganizma yüksek sıcaklığa, kurutmaya ve kaynatmaya dirençli sporları üretirler. Bu sporlar yüksek basınç ve sıcaklık koşullarında belirli bir süre tutularak ortamdan uzaklaştırılabilir. Bu işlemi düdüklü tencere mantığı ile çalışan otoklav adlı cihaz otomatik olarak yapmaktadır.

Sterilizasyon ve Dezenfeksiyon

Tarihçe Mikroorganizmaların varlığı henüz bilinmemesine rağmen yazılı insanlık tarihinin ilk başlarından beri insanlar, hastalıklara karşı koymak amacı ile dezenfeksiyon ve sterilizasyon işlemlerini uygulamışlardır.

Tarihçe Eski Mısırlılar, enfeksiyöz maddeleri sterilize ve mumyaları dezenfekte etmek için ateşi kullanmışlardır.

Tarihçe Yunanlılar binalarını dezenfekte etmek için kükürt yakarlarken, Yahudiler cüzzamlı hastaları izole edip geride kalan bütün eşyaları yakmışlardır.

Tarihçe 16.yüzyılda veba salgınında da ölenlerin vücutları, topluca yakılarak ortadan kaldırılmıştır.

Tarihçe Dezenfeksiyon amacıyla kimyasal maddelerin kullanımı ve sterilizasyon amacı ile ışığın kullanımı 19. asırda Robert Koch, Louis pasteur ve Joseph Lister sayesinde olmuştur.

Sterilizasyon Herhangi bir cismin veya maddenin, birlikte bulunduğu tüm mikroorganizmaların her türlü canlı şekillerinden, tamamen temizlenmesi işlemidir. Sterilizasyon kesin bir ifadedir. Bir nesne veya ortam ya sterildir ya da değildir, az steril veya çok steril gibi bir ifadeler yanlıştır.

Sterilizasyon Sterilite Güvenilirlik Düzeyi (Sterility Assurance Level) Sterilizasyondan sonra ortamda canlı mikroorganizma bulunma ihtimalidir. Günümüzde kabul edilebilir sterilite güvenilirlik düzeyi; ortamdaki bakteri sporlarını 1/1.000.000 (log 10-6 - % 99.9999) azaltan sterilite güvenilirlik düzeyidir. Bu tanım sterilizasyon işleminin pratikte ölçülebilir, kontrol edilebilir olmasını sağlamıştır.

Dezenfeksiyon Mikrobiyal kontaminasyonun kabul edilebilir güvenlik sınırlarına çekildiği, bakteriyel sporların büyük bir kısmının etkilenmediği, gerçek anlamda yalnızca patojen mikroorganizmaları bulundukları cansız ortamdan uzaklaştırma işlemidir Dezenfektan Dezenfeksiyon işleminde kullanılan kimyasal maddelerdir

Dekontaminasyon Nesnelerden veya canlı dokulardan patojen mikroorganizmaların temizlik, dezenfeksiyon, sterilizasyon ve/veya antisepti ile uzaklaştırma işlemidir

Antisepsi Patojen mikroorganizmaları öldürmek veya çoğalmalarını önlemek için vücut yüzeyine yerel olarak kimyasal maddelerin uygulanmasıdır. Antiseptik Mikroorganizmalara uygulandığında üremelerini önleyerek veya onları öldürerek zararsız hale getiren,özellikle canlı dokulara uygulanabilen maddelerdir.

Sterilizasyon Yöntemleri I-YÜKSEK ISI İLE STERİLİZASYON 1-Kuru ısı 2-Kızıl dereceye kadar ısıtma veya yakma 3-Alevden geçirme 4-Nemli ısı A-Sıcak su - Kaynatma - Tindalizasyon B-Buharlı ısı - Basınçlı buhar - Basınçsız buhar II-SÜZME (FİLTRE) İLE STERİLİZASYON III-KİMYASAL MADDELERLE STERİLİZASYON 1-Sıvı ortama kimyasal maddeler ekleme A-Timol B-Kloroform 2-Gaz uygulama A-Etilen oksit B-Beta propiolakton IV-IŞINLARLA STERİLİZASYON 1- Ultraviyole 2- X ve gama ışınları

Sterilizasyon Yöntemleri Isı ile sterilizasyon Sterilizasyon Yöntemleri En sık kullanılan sterilizasyon yöntemidir. Yüksek ısı ile, mikroorganizmaların proteinleri denatüre olur. Basit, ucuz ve hızlı sonuç alınır. Hem çalışanlar hem de doğa açısından toksik atık oluşturmaz

Sterilizasyon Yöntemleri Isı ile sterilizasyon Sterilizasyon Yöntemleri Isı Derecesi: Isı derecesi arttıkça sterilizasyon işleminin süresi kısalır pH: Nötr ortamda sterilizasyon süresi uzar. Asit ve alkali ortamlarda ise kısalır. Ortamın Nemi: Nem oranı arttıkça gerekli ısı derecesi ve etki süresi kısalır. Mikroorganizma içindeki su oranı arttıkça protein koagülasyonu çabuklaşacağından sterilizasyon kolaylaşır (Bakteri sporları içinde su az olduğundan sterilizasyona daha dayanıklıdır).

Sterilizasyon Yöntemleri Isı ile sterilizasyon çeşitleri Sterilizasyon Yöntemleri Basınçsız buharla sterilizasyon Su buharı ile sterilizasyon Basınçlı Buharla Sterilizasyon A) Nemli ısı ile sterilizasyon Kaynatma Sıcak su ile sterilizasyon Tindalizasyon Pastör fırını B) Kuru ısı ile sterilizasyon Yakma ve alevden geçirme

Sterilizasyon Yöntemleri A) Nemli ısı ile sterilizasyon Isı ile sterilizasyon çeşitleri Sterilizasyon Yöntemleri Su buharı ile sterilizasyon a) Basınçsız buharla sterilizasyon Arnold kazanı = Koch kazanı. Doymuş ve akım halindeki basınçsız su buharı ortamında 100 oC de en az 30 dakikada yapılan sterilizasyon. Yüksek ısıya dayanıksız maddelerin sterilizasyonu bu yöntemle yapılır.

Sterilizasyon Yöntemleri A) Nemli ısı ile sterilizasyon Isı ile sterilizasyon çeşitleri Sterilizasyon Yöntemleri Su buharı ile sterilizasyon b) Basınçlı buharla sterilizasyon Buharla doymuş bir ortamda, basınç altında ve 100 oC nin üzerindeki ısılarda yapılan sterilizasyondur. İlk otoklav 1879 da Charles Chamberland tarafından geliştirilmiştir.

Otoklava malzeme yerleştirilirken nelere dikkat edilmeli ? Buhar geçirgenliğine sahip malzeme ile paketleme yapılmalı. Eşyalar çok sıkışık olarak yerleştirilmemeli, aralarında buhar geçişine ve dolanımına uygun boşluk bulunmalı. Malzeme otoklava girmeden önce temizlenip kurutulmalı, sonra paketlenmeli. Buhar girişini ve vakumlamayı engelleyecek büyüklükte paketleme yapılmamalı. Kullanılan buharın kalitesi çok iyi olmalı ve içerisinde sıvı halde su bulunmamalı. Sıvıların sterilizasyonunda, çözeltiler bulundukları kabın % 80 ine kadar doldurulmalı. Sterilizasyon sırasında otoklav içinde kesinlikle hava kalmamalı. Bu, ısının yükselmesini ve havanın bulunduğu kısımdaki malzemeye (genellikle cihazın alt kısmı) buharın girmesini engeller (hava yastığı).

Otoklav kazaları 45 ton ağırlığında bir otoklav (çap 4 m, uzunluk 26 m) 4500 m uzağa fırladı 40 kg TNT eşdeğeri patlama

Otoklav kazaları

Otoklav kazaları

Sterilizasyon Yöntemleri A) Nemli ısı ile sterilizasyon Isı ile sterilizasyon çeşitleri Sterilizasyon Yöntemleri Sıcak su ile sterilizasyon a) Kaynatma 100 oC de 5-10 dk kaynatma ile dezenfeksiyon, 30 dakika kaynatma ile sterilizasyon sağlanabilir . Musluk suyu kireçli olabileceğinden, damıtık su tercih edilmeli. SS, DCA, TCBS, Selenit F, Tetratiyonatlı buyyon gibi bazı besiyerlerinin sterilizasyonunda da kullanılır. 100C’de 5-10 dk da penset, makas, bisturi gibi maddelerin dezenfeksiyonu

b) Tindalizasyon Benmari denilen sterilizasyon aleti içerisinde yapılır. Steril edilecek malzeme 56 - 100 oC'de üç gün süreyle, 30-60 dakika tutularak yapılır. Her tindalizasyon işleminden sonra 1 gece oda ısısında bekletilir. Bu bekleme sırasında ortamda bulunan sporlu bakteriler açılarak, vejetatif hale geçerler. İlk günkü işlemde ortamdaki sporsuz bakteriler ölürler. İkinci günkü işlemde açılan sporlu bakterilerin vejetatif şekilleri ölürler. Üçüncü günkü işlemde ise ortamda kalmış olan sporlardan oluşabilen vejetatif bakteriler ölürler.

Sterilizasyon Yöntemleri B) Kuru sıcak hava ile sterilizasyon Isı ile sterilizasyon çeşitleri Sterilizasyon Yöntemleri Pastör fırını Avantajları kurulması ve bakımı kolaydır. Metal aletlerde aşınmaya (neden olmaz tek bir parametre (ısı) ile kontrol edilebilir Dezavantajları ısıya duyarlı malzemelerin sterilizasyonunda kullanılamaz yüksek ısı ve uzun süreye gereksinim gösterir. Sporlar kuru ısıya nemli ısıdan daha dirençli.

Sterilizasyon Yöntemleri Süzme ile filtrasyon Sterilizasyon Yöntemleri Süzme mekanizmalarına göre; a) adsorbsiyonla mikroorganizmaları tutan süzgeçler (Berkfeld, Chamberland, Seitz gibi) Bakteri yüzeyi ile, filtrenin elektrik yükünde farklılık nedeniyle, süzme işlemi sırasında bakteriler filtrenin deliklerine yapışarak adsorbe olurlar. Bu sayede süzüntüye geçemezler. b) mikroorganizmaları mekanik olarak tutan süzgeçler (HEPA filtreler) Filtrenin delikleri bakterilerden küçük olduğu için bakterileri tutarlar. Bakteriler filtrenin üzerinde kaldığı için, süzüntü steril hale gelir.

Sterilizasyon Yöntemleri Süzme ile filtrasyon Sterilizasyon Yöntemleri Filtre gözenek çapları bazı büyük protein moleküllerinin geçebileceği boyutlarla küçük virüs partiküllerinin geçebileceği boyutlara kadar farklı genişliktedir Gözenek çapları; tüm bakteriler için 0.2 µm maya hücreleri için 3 µm virüsler için 0.2 µm Filtrelerin periyodik olarak kontrolü yapılmalı, temizlik ve değişim işlemleri aksatılmamalıdır

Sterilizasyon Yöntemleri Süzme ile filtrasyon Sterilizasyon Yöntemleri Mikrobiyolojide filtrelerin kullanım alanları; çözeltilerin ve havanın sterilizasyonu farklı büyüklükteki mikroorganizmaların birbirinden ayrılması toksin, antijen, ve enzimlerin hücrelerden arındırılması çözeltilerin saflaştırılması

Sterilizasyon Yöntemleri Işınlama ile sterilizasyon Sterilizasyon Yöntemleri Isı ve diğer yöntemlerle steril edilemeyen ortamların sterilizasyonu Kullanım alanları sınırlı Çevreye de etkili olduklarından sınırlı olarak ve önlem alınarak uygulanabilir.

Sterilizasyon Yöntemleri Işınlama ile sterilizasyon Sterilizasyon Yöntemleri İyonize edici radyasyon X ışınları, gama ışınları, beta ışınları - mikroorganizmların nükleik asitlerine etki ederler. Uygulama alanları sınırlı, maliyeti yüksek ve insan sağlığı yönünden tehlikeli (mutajenik) Daha çok oda ve alet dezenfeksiyonunda kullanılır.

Sterilizasyon Yöntemleri Işınlama ile sterilizasyon Sterilizasyon Yöntemleri b. UV ışınları (mor ötesi ışınlar) Dezenfeksiyon için gerekli dalga boyu 253.4 nm İyonize ışınların aksine radyasyon enerjileri ve penetrasyon güçleri azdır Bu nedenle daha çok hava, su ve yüzey sterilizasyonunda kullanılır Mikroorganizmaların DNA yapılarını kırar, ya replikasyon inhibe olur ya da mutasyon

Sterilizasyon Yöntemleri Işınlama ile sterilizasyon Sterilizasyon Yöntemleri b. UV ışınları (mor ötesi ışınlar) UV lambaları ve UV sterilizatörleri UV stalizatör su içindeki mikroorganizmaların %99.99’nu yok eder Ameliyathaneler, doku kültürü yapılan odalar, antibiyotiklerin hazırlandığı odalar, mikoloji laboratuvarında kullanılırlar.

Sterilizasyon Yöntemleri Kimyasal maddeler ile dezenfeksiyon ve sterilizasyon Sterilizasyon Yöntemleri Dezenfeksiyon, sterilizasyondan sporisid aktivitesinin olmaması ile ayrılır. Dezenfektanlardan farklı olarak endosporlara da etkili olan sterilanların kullanıma girmesiyle günümüzde dezenfeksiyon terimi, mikrobiyal kontaminasyonu minimal düzeye düşürmekten, sterilizasyona kadar uzanan geniş bir kavramı içine alır.

Sterilizasyon Yöntemleri Kimyasal maddeler ile sterilizasyon ve dezenfeksiyon Sterilizasyon Yöntemleri Yüksek seviyeli dezenfektanlar Bakteri sporları hariç mikroorganizmaların tümünü 20 dakikada, 6-10 saatte bakteri sporlarını da öldürdüğünden, yüksek seviyeli dezenfektan olarak değerlendirilir.

Sterilizasyon Yöntemleri Kimyasal maddeler ile sterilizasyon ve dezenfeksiyon Sterilizasyon Yöntemleri Orta seviyeli dezenfektanlar Bakteri sporları hariç Tüberküloz basili ve diğer mikroorganizmalara yaklaşık 10 dakikada etkili dezenfektanlar

Sterilizasyon Yöntemleri Kimyasal maddeler ile sterilizasyon ve dezenfeksiyon Sterilizasyon Yöntemleri Düşük seviyeli dezenfektanlar Vejetatif bak.lerin çoğunu, bazı mantarları ve yaklaşık 10 dk’da bazı virusları öldürebilen dezenfektanlar Bakteri sporları ve Tbc basiline etkili değil

Sterilizasyon Yöntemleri Kimyasal maddeler ile sterilizasyon (soğuk sterlizasyon) Sterilizasyon Yöntemleri ETİLEN OKSİT (EO) HİDROJEN PEROKSİT PERASETİK ASİT OZON KLORİN DİOKSİT (ClO2) DÜŞÜK ISILI BUHAR ve FORMALDEHİT

DİRENÇLİ STERİLİZASYON Yüksek Düzey Orta Düzey Düşük Düzey DUYARLI Prionlar Bakteriyel Sporlar B. subtilis Mikobakteriler Mycobacterium tuberculosis Yüksek Düzey Lipid içermeyen veya küçük viruslar Rhinovirus, Coxsackie virus Orta Düzey Mantarlar Candida sp. Düşük Düzey Vejetatif bakteriler P. aeruginosa, S. aureus Lipid içeren veya orta büyüklükteki viruslar HBV, Herpes simplex virus, HIV DUYARLI mikroorganizmaların dezenfektanlara direnci ve dezenfeksiyon düzeyi