İki Boyutlu Jel Elektroforezi Two Dimensional Gel Electrophoresis (2D-GE)

Introduction to Proteomics TEORİ İzoelektrik nokta: Proteinin net yükünün 0 olduğu pH değeri. Proteinler izoelektrik noktalarının altındaki pH’larda pozitif (+) yüklüdürler ve elektriki alanda katoda (- yüklü elektroda) göç ederler. İzolektrik noktalarının üzerindeki pH’larda negatif (-) yüklüdürler ve anoda (+ yüklü elektroda) göç ederler. Introduction to Proteomics 20-24 October 2008, İstanbul

Proteinler izoelektrik noktalarının altındaki pH’larda pozitif (+) yüklüdürler ve elektriki alanda katoda (- yüklü elektroda) göç ederler. İzolektrik noktalarının üzerindeki pH’larda negatif (-) yüklüdürler ve anoda (+ yüklü elektroda) göç ederler. İzoelektrik noktasında protein yüksüzdür. Anoda ya da katoda göç etmez.

(2D-GE) (O’Farrell, 1975) Amaç: Tüm gen ürünlerini ayırmak Binlerce proteini aynı anda ayırma yeteneğine sahip tek yöntem İlk boyut: İzoelektrik odaklama (Isoelectric focusing, IF): Proteinler pH gradienti oluşturulmuş bir destek üzerinde, izoelektrik noktalarına (yüklerine) göre ayrışırlar. İkinci boyut: SDS_PAGE İzoelektrik noktalarına göre ayrılmış proteinler denatüre jelde molekül ağırlıklarına göre ayrışırlar. O' Farrell PH (1975) High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem 250: 4007-4021

2D-GE

İlk Boyut İzoelekrik noktalara göre ayırım 3 farklı yaklaşımla gerçekleştirilir: I. Taşıyıcı amfolitlerle izoelektrik odaklama («carrier ampholyte isoelectric focucing», CA-IEF) II. Dengesiz pH jel elektroforezi («non-equilibrium pH gradient electrophoresis, NEPHGE) III. İmmobilize pH gradient elektroforezi («immobilized pH gradient electrophoresis», IPGE)

CA-IEF Önce ticari olarak satılan amfolit ya da amfolin® (düşük molekül ağırlıklı sentetik poliaminopoli karboksilli asitler) karışımları (farklı pI değerlerine sahip) jelde elektroforezle ayrılır. Daha sonra protein karışımı uygulanır ve elektrik akımı geçirilir. Her protein net yükünün 0 olduğu pH bölgesine doğru göç eder ve orada odaklanır.

Elektrik uygulandığında taşıyıcı amfolitler katoddan anoda doğru pI düşecek şekilde yerleşirler. Her bir amfolit kendi pI değerine eşdeğer lokal bir pH ortamı yaratır ve böylece jelde boyunca bir pH gradienti (derecelenmesi) oluşur. Bir protein karışımı jel yüzeyine uygulandığında her bir protein kendi izoelektrik noktasına karşılık gelen pH bölgesine kadar elektrik akımının etkisiyle yürür. Bu noktaya ulaştığında net yükü 0 olacağından sabit duruma geçer. Difüzyon ile bu bölgeden anoda doğru azıcık uzaklaşacak olsa, + yük kazanacağından tekrar katoda çekilir veya katoda doğru difüzlenecek olsa – yük kazanır ve anoda çekilir, böylece pI bölgesinde hapsolur ya da «ODAKLANIR».

NEPHGE Dengesiz pH jel elektroforezi (Nonequilibrium pH gel electrophoresis, NEPHGE) İzoelektrik noktaları çok yüksek (pI 7.5-11) olan çok bazik proteinler için geliştirilmiş bir tekniktir. Bu proteinleri standart IEF ile ayrıştırmak zordur, çünkü IEF jellerindeki üre tamponlama etkisi nedeniyle pH gradientinin bazik değerlere (pH 7.3-7.6’nın üzerine) ulaşmasını engeller. Ayrıca, zamanla jelin özellikle iki ucundaki gradient bozulur ve katoda doğru çekilme (cathodic drift) denilen bir olay nedeniyle çok bazik proteinler jelden çıkar. NEPHGE sırasında, proteinler izoelektrik noktalarında tam olarak odaklanmazlar. Jel boyunca yüklerine göre farklı hızlarda hareket ederler. Bu nedenle jel boyunca yayılma şekli, uygulanan elektriğin voltajına ve süresine bağlıdır. Bu nedenle tekrarlanabilir ayırımlar elde etmek için elektriksel parametreleri düşük ve her seferinde aynı tutmak gerekir. See for detail Nonequilibrium pH Gel Electrophoresis (NEPHGE) by Lopez, M. F. in The Protein Protocols Handbook, 2nd Edition Edited by: J. M. Walker © Humana Press Inc., Totowa, NJ

SORUNLAR Tekrarlı deneylerde farklı sonuçlar! pH gradienti sabit değil Zamanla katoda doğru kayar (‘cathodic drift’)

ÇÖZÜM IEF için İmmobilize pH gradientlerini (IPG) kullanmak (Bjellqvist et al. 1982). IPG’lerde pH gradienti, akrilamit matriks ile birlikte polimerize olan (ko-polimerize), ‘Immobilin’ denilen sınırlı sayıda (6-8) kimyasal tarafından oluşturulur. Bjellqvist B, Ek K, Righetti PG, Gianazza E, Görg A, Westermeier R, Postel, W (1982) Isoelectric focusing in immobilized pH gradients: Principle, methodology and some applications. J Biochem Biophys Methods 6: 317-339

IPGE : Immobilize pH gradient elektroforezi

Ticari olarak hazırlanmış IPG DryStrip’leri kullanımı: Ticari olarak hazırlanmış IPG DryStrip’leri kullanımı: Tekrarlı deneylerde farklı sonuçları ortadan kaldırır. pI rezolusyonu artar (0.01 pH ünitesi) Uygulama basitleşir.

Immobiline® akrilamido tamponları POLİMERİZASYON SIRASINDA akrilamid matriksi içinde immobilize olur. Böylece pH gradienti de sabitlenir.

Materyaller ve Aletler ReadyStrip IPG Strips

Rehidrasyon/Dengeleme Tepsisi

PROTEAN IEF Hücresi (BIO-RAD)

Güç Kaynağı

PROTEAN II xi Elektroforez Aleti (BIO-RAD)

(ReadyPrepTM 2-D Starter Kit, BIO-RAD, 163-2105) Kit Bileşenleri (Kit Constituents) İçerik (Content) Rehidrasyon/Örnek Tamponu (“ReadyPrep Rehydration/Sample Buffer”) 8 M Üre %2 CHAPS 50 mM DTT %2 (w/v) Bio-Lyte ® 3/10 amfolit Bromofenol mavisi (eser miktarda) Dengeleme Tamponu I (“Equilibration Buffer I”) 6 M Üre %2 SDS (sodyum dodesil sülfat) 0.375 M Tris-HCl (pH 8.8) %20 Gliserol %2 (w/v) DTT Dengeleme Tamponu II (“Equilibration Buffer II”) %2 SDS %2.5 (w/v) İyodoasetamid Kapatma çözeltisi (“Overlaying Solution”) %0.5 Agaroz 25 mM Tris 192 mM Glisin %0.1 SDS Bromofenol mavisi (trace-eser)

Uygulama: Birinci Boyut Şerit uzunluğu 7 cm 11 cm 17 cm Örnek hacmi 125 μl 185 μl 300 μl Protein Yükleme Miktarı 169 μg 250 μg 405 μg Rehidrasyon sırasında örnek uygulama Uygun hacimde örnek tepsideki kanala pipetle uygulanır.

Uygulama : İlk Boyut Şerit örneğin üzerine yerleştirilir. “+” Ve “pH 4-7” yazısı tepsinin solunda ve okunabilir olmalıdır. Pens yardımıyla şeritin arkasındaki tabaka kaldırılır.

Uygulama: Birinci Boyut Her bir şeritin üzeri 2 to 3 ml mineral yağ ile kaplanır (rehidrasyon sırasında evaporasyonu önlemek için) Tepsi plastik kapakla örtülür ve 1 gece (11-16 saat) oda sıcaklığında bekletilir (IPG şeritlerinin rehidrate olması ve protein örneklerin yüklenmesi için)

Rehidrasyondan sonra örneklerin uygulanabileceği düzenekler de mevcuttur (Örnek kapları kullanılır)

Uygulama: Birinci Boyut Odaklama tepsisindeki kanalların her iki ucundaki elektrot tellerinin üzerine pens yardımıyla kağıt fitiller yerleştirilir. Elektrot fitilleri su ile ıslatılır.

Uygulama: Birinci Boyut Şeritler Odaklama tepsisinin oluklarına yerleştirilir. Mineral yağ uzaklaştırılır

Uygulama: Birinci Boyut Odaklama tepsisi PROTEAN IEF hücresine yerleştirilir, kapak kapatılır ve sistem ayarlanarak çalıştırılır. 7 cm Voltage Time Volt-Hours Ramp Step 1 250 20 min ----- Linear Step 2 4,000 2 hr ----- Linear Step 3 4,000 ----- 10,000 V-hr Rapid Total 5 hr 14,000 V-hr 11 cm Step 1 250 20 min ----- Linear Step 2 8,000 2.5 hr ----- Linear Step 3 8,000 ----- 20,000 V-hr Rapid Total 5.3 hr ~30,000 V-hr 17 cm Step 1 250 20 min ----- Linear Step 2 10,000 2.5 hr ----- Linear Step 3 10,000 ----- 40,000 V-hr Rapid Total 7 hr ~50,000 V-hr

BOYAMA Kolloidal Coomassie Blue Gümüş Boyama Sypro Ruby Çinko/Bakır (Zinc/Copper) Negatif Boyama

SONUÇ

Pratikte proteomik çalışmalar 3 alanda yürütülür: Ekspresyon («abundance») proteomiği (Klasik proteomik) AMAÇ: Belli koşullarda altında protein ekspresyonlarını karşılaştırmak İşlevsel proteomik («cell-mapping or cellular proteomics») AMAÇ: protein-protein interaksiyonlarını göstermek (hücreiçi sinyalleşmeyi ve protein işlevini oluşturan kompleks ağların çerçevesini ortaya koymak için) Yapısal proteomik AMAÇ: 3 boyutlu yapıyı aydınlatmak

KALSİK PROTEOMİK ALZHEIMER HASTASI KONTROL