İmmünoassay teknikleri Prof. Dr. Akgün YAMAN Mikrobiyoloji ABD

İmmunoassayTeknikleri Walter ve Coons 1954 indirekt FA (Ag ve Ab tesbiti). 1960  Radioizotopla işaretli Ag ve Ab kullanımı izledi. 1970’lerde  kantitatif Ag ve Ab saptanmasında enzimle işaretli Ab kullanılmaya başlandı.

FIA Floresans: Florokrom veya florofor boyaların UV sınırları içinde ışık enerjisini emdikten sonra bu enerjiyi farklı dalga boyuna çevirebilme yeteneğidir. Bu özellikten yararlanarak floresans veren boyalarla Ab veya Ag işaretlenerek Ag veya Ab.lerin saptanması mümkündür.

FIA Problem: Zeminde oluşan floresans Ag-Ab kompleksinin floresansı ile ve örnekten veya katı fazdan çevreye yayılan ışınla çatışabilir (interferens)  Bu FITC’ın eksite edici veya yansıtıcı dalga boylarının çok dar bir aralıkta olmasından kaynaklanır.

Diğer bir problem -Kimyasal birleşme sonunda floresanda azalma olabilir. -FITC’ın eksitasyon kaynağı ile sürekli karşılaşması sonucu floresansın solması veya sinyalde tümden azalma.

Time-Resolved FIA Conjugat olarak Lantanid Şeladları kullanılır. Avantajları: -Yüksek floresans yoğunluğa sahiptir. -Florasan sinyali zemindeki floresansından ayırt edilebilir. -Ag veya Ab.ye bağlandığında; Ag ve Ab.nin özelliğini olumsuz yönde etkilemediği gibi bu kimyasal birleşmeden Lantanid’de etkilenmez. -Uzun floresan ömrü vardır.

Time-Resolved FIA Avantajı: Yukarıdaki nedenlerden dolayı, sensitivitesi ve spesivitesi Dezavantajı: Özel bir alete ihtiyaç var.

IFAT Floresan boya ile işaretlenmiş antikorlarla, özgül antijenlerin birleşmesi ve bu kompleksin floresan mikroskopta görüntülenmesi esasına dayanır

İmmünofloresan Yöntem:  Bakteri, virus, mantar, parazit gibi antijenlerin  Antijenlere karşı oluşan antikorların  Tümör antijenlerinin aranmasında  Otoimmün hastalıkların tanısında

İmmunofloresan Antikor Tekniğinde Genel Kurallar  Preparatların hazırlanması  Preparatların tespiti (materyal)  Preparatların floresanlı antikor ile boyanması  Preparatların lamel ile örtülmesi  Preparatların floresan mikroskop ile incelenmesi

IFAT ana prensip Sekonder antikor Primer antikor Antijen

Floresan boyalar  Fluorescein isothiocyanate (FITC)  Rhodamine B isothiocyanate  Auramine-rodamine  Lissamine rodamine B Bu boyalar; 0.001sn de 1ng boya 1 foton ışığın ısısını emerek dalga boyunu yükselterek yansıtır

IFAT  Direkt IFA  İndirekt IFA

Direkt IFA Floresan işaretli Antijen + antikor Floresan ile işaretli

FITC ile işaretlenmiş Ab Direkt IFA FITC ile işaretlenmiş Ab Aranan Ag İmmünofloresans

Direkt IFA Boğaz sürüntüsü Floresan Floresan ile A Grubu Streptococci işaretli antikor Floresan Streptococci

Direkt IFA Kullanım alanları: Enfekte beyin dokusunda kuduz virusuna ait antijenler Dışkıda EPEC, V.cholera Nazofarinks salgısında A grubu -hemolitik streptokoklar Legionella pneumonia, Listeria monositogenes

İndirekt IFA Antijen + Antikor + Floresan ile işaretli anti-globulin Floresan işaretli anti-globulin

FITC ile işaretlenmiş anti-globulin Ab İndirekt IFA Ag- Ab kompleksi Antijen Antikor FITC ile işaretlenmiş anti-globulin Ab İmmünfloresans

İndirekt IFA Antikor Floresans Floresans negatif pozitif (Ag/Ab bağlanması) (Ag/Ab bağlanmamış) Floresan işaretli Anti-globulin Floresans negatif Floresans pozitif

İndirekt IFA Floresan işaretli anti-globulin T.pallidum Hasta serumunda spesifik Ab Ag/Ab bağlanması Floresan spiroket

İndirekt IFA Kullanım alanları:  Otoantikorlar  Böbrek dokusu ve deri içerisinde immünkompleks birikimleri  Tümör ve transplantasyon antijenleri

IF-Antikor Arama 1-Direkt Sandöviç Yöntemi Ag.bağlı Serum FITC-Ag. 2-İndirekt Yöntem Ag FITC-Antihuman Ig

IF-Antikor Arama 3-Yarışmacı (kompetitif) Ab.testi Ag Kl. örnek (serum) + Konjuge Ab. Sinyaldeki azalma

IF-Antikor Arama 4-Belli izotipteki Ab.leri yakalama (Capture) mü zinciri (Fc kısmına spesifik Ab.bağlanır). Kl. örnek (serum)-IgM Saflaştırılmış MO. Ag. Floresan Enzim Radioizotop

IF-Antijen Arama 1-Direkt Yöntem Kl. örnek FITC-Ab. 2-İndirekt Yöntem İşaretsiz Ab. FITC-Antihuman globulin

IF-Antijen Arama 3-Ag.Yakalama (Sandöviç) Testi Ab. Kl. örnek FITC-Ab.

Enterococcus

Stereptococcus pneumonia

N. meningitidis

Legionella pneumonia

Yersinia enterocolitica

Burkholderia pseudomallei

Kuduz virusu

Sars virusu

Cytomegalovirus

C. neoformans

Alternaria alternata

Dezavantajları Avantajları  Kısa sürede sonuç  Direkt IFA - Duyarlılık yüksek - Özgüllük yüksek  Numune kalitesi önemli  Deneyimli personel  Yöntem pahalı - Floresan mikroskop - Kitler  İndirekt IFA - Duyarlılık düşük - Özgüllük düşük

Enzim Linked İmmunosorbent Assay ELISA Enzim Linked İmmunosorbent Assay Spesifik ag- ab bağlanmasını göstermek amacıyla enzim enzime spesifik substratın kullanılarak, bir renk oluşması esasına dayanır.

TARİHÇE ELİSA sistemleri 1960 yıllarında radioİmmunoassay yöntemlerine alternatif aranırken bulunmuştur. RİA ilk kez 1960 yılında Rosalyn Sussman ve Solamon Berson tarafından bilimsel bir dergide yayınlanmıştır.

Elisa Spesifik Ab. kullanılarak örnekteki Ag.nin miktarını Spesifik Ag kullanılarak örnekteki Ab.in miktarını ölçebiliriz.

ELISA Nasıl Çalışır? ELISA testinin çeşitli tipleri vardır, en temel çeşiti solid bir yüzeyin Ab.la kaplanması temeline dayanmaktadır. Diğer bir çeşidi ise solid bir yüzeyin Ag.le kaplanması temeline dayanmaktadır.

ELISA RIA’da I125, izotopları Kısa ömürlü Radyoaktivite içermesi (toplum ve çevre sağlığı) IF teknikleri RİA’dan daha yaygın kullanılmakta. İyi eğitilmiş eleman gereksinimi Sonuçların yorumlanması subjektif Otomatize edememe

Elisa-Avantajları Ucuz Basit Radyasyon tehlikesi yok Fazla sayıda örnek çalışılabilir Ag veya Ab tespiti Kalitatif ve kantitatif sonuçlar Spesifik Ig gruplarının tayini Avidite ölçümü Özgüllük ve duyarlılığı yüksektir Otomasyona bağlı kolaylık

EIA’deki Problemler Ag saptamak üzere oluşturulan EIA örneklerin uygunluğunu değerlendirmez. Düşük yoğunluktaki Ag.i saptama yeteneği sınırlıdır. Özgül IgM yanıtı aranırken (IF.’da olduğu gibi) klinik örnek IgG’den temizlenmeli ve RF-IgM çatışması da giderilmelidir.

Gerekli materyaller Kontroller (pozitif ve negatif ) Test edilecek örnek Ag Ab Elisa plakları Yıkama solüsyonu Enzim işaretli Ag veya Ab Enzim- substrat ELISA okuyucu (spektrofotometre)

Antijen +Antikor+ Enzim + Kromojen substrat PRENSİP Antijen +Antikor+ Enzim + Kromojen substrat

 ENZİMLER VE KAYNAKLARI Alkalen fosfataz E.coli Peroksidaz Yaban turbu Glikoz oksidaz A.niger Beta galaktosidaz E.coli

ENZİM ve SUBSTRATLAR Alkaline phosphatase p-nitrophenylphosphate (pNPP) - Sarı Peroxidase o-phenylenediamine (OPD) – Portakal

Konjugat Antikor aramak için; anti-(human) Ig-enzim IgG / A / M / E Antijen aramak için; enzim-konjuge antikor

Substrat Orthophenylene diamine Tetramethyl hydrochloride (OPD) benzidine (TMB) Horse radish peroxidase (HRP) Turuncu, 490 nm Sarı, 450 nm Spektrofotometre

ELISA

Elisada katı faz olarak Mikrotitrasyon plakları Plastik boncuklar Ferröz boncuklar Nitroselüloz membran

ELISA

ELISA

EIA- Ag. Arama Sandöviç yöntemi Ab. Kl. örnek Enzim-Ab. Substrat

EIA- Ab. Arama -Sandöviç yöntemi Ag. Hasta serumu Enzim-Antiglobulin Substrat

Yarışmacı ELISA Yarışmacı ELISA genellikle Ag varlığını göstermek amacıyla kullanılır. Ag.e spesifik ab. Enzimle işaretli Ag ve test edilecek Ag (klinik örnek) Yıkama Substrat Renk  Spektrofotometre absorbans Sonuç: Substratın hidroliz miktarı örnekteki Ag miktarı ile ters orantılıdır.

ELISA Enzimle işaretlenmiş antikorlar Örneğin: Peroksidaz, alkalen fosfataz ve beta galaktozidaz sıklıkla kullanılır. Antijen veya antikor, kuyucuklara yapıştırılır Yıkama basamakları Enzime özel substrat eklenir. Oluşan renk belirli dalga boylarında kolorimetrik olarak ölçülür Sonuç niceliksel veya hesaplanacak kesim noktasına (cut off) göre niteliksel olarak rapor edilir. 62

1. Solid faz antijen ya da antikor ile kaplanır. Analit = antikor Analit = antigen Inkübasyon ve yıkama

2. Örnek eklenir. Inkübasyon, yıkama Analit = antikor Analit = antigen

3.Konjugat eklenir. İnkübasyon, yıkama. E E E E Analit = antikor Analit = antigen

4. Substrat eklenir. 6. Stoplanır ve renk değişimi ölçülür. ENZİM OD Konsantrasyon

Direkt Eliza (sandviç yöntemi ) ile Antijen Arama Solid faz antikor, İnceleme materyelindeki antijen, Antijen varsa antikora yapışır.Yıkama ile gitmez Enzim işaretli antikor Antijen yapışmış ise o da yapışır Kromojen substrat renk oluşur.

Tek Basamaklı Sandviç Yöntemi İle Antijen Arama Direkt yöntemden tek farkı 1 ve 2. basamakların birleştirilerek zaman kazanılması.

İndirekt Eliza İle Antijen Arama Solid faz antikor Materyalde aranmakta olan antijen Değişik hayvan kökenli özgül antikor Antijen varsa üçü yapışır ve yıkama ile gitmez Değişik hayvan globülinine karşı enzim işaretli antikor O da yapışır yıkama ile gitmez Kromojen substrat ve renk oluşumu

Katı Faz Sandviç Yöntemiyle Antikor Arama (İndirekt Yöntem) Solid faz bilinen antijenle kaplanır Hasta serumu ilave edilir Yıkanır. Enzim konjuge insan antiglobulini ilave edilir O da bağlanır ve yıkama ile gitmez Kromojen substrat Renk oluşur.

İndirekt Yöntem

COMPETITIVE ELISA YIKA Substrat ilave et SPEKTROFOTOMETREDE OKU enzim işaretli Bilinmeyen antijen YIKA Substrat ilave et SPEKTROFOTOMETREDE OKU

Enzim konjuge antikor ve COMPETITIVE ELISA Solid faza antijen bağlı Enzim konjuge antikor ve örnek serumu ilave et YIKA Substratı ilave et Spektrofotometrede oku POZİTİF NEGATİF

5) YAKALAMALI (CAPTURE)ELISA:  Enfeksiyoz etkene yönelik, Sıklıkla;  Enfeksiyoz etkene yönelik,  Spesifik IgM ve IgG saptama testidir 1)Spesifik Ag saptama  Katı faza poliklonal veya M.ab’lar konulur  Poli Ab’ler,  M Ab’lere göre  Farklı Ag epitoplarını bağladığı için güvenilirdir 93 93

Sinyal zayıf veya yok: Güçlü reaksiyon Kit reagenleri hatalı Yıkama çok güçlü olabilir. Substrat ve konjugat inaktif olabilir. İnkubasyon süresi yetersiz olabilir (10-30 dakika) Enzim inhibe edilmiş olabilir (sodyum azid-peroksidaz) Güçlü reaksiyon Kros reaksiyonlar-Antijen kaynaklı- Non-spesifik reaksiyonlar-antikor kaynaklı- Konjuge antikor yoğunluğu Yıkama hatası İnkubasyon ısısı ( 37 C ‘yi aşma)

AFİNİTE AVİDİTE Afinite - Avidite

Antijen ve antikor arasıdaki birleşme; Hidrofobik etkileşim, Hidrojen bağları, Elektrostatik bağlar ve Van der Waals bağları gibi nonkovalen bağlarla gerçekleşmektedir.

Afinite Bir Ab molekülünün Ag.in tek bir epitopuna bağlanma gücü. Kd

Antikor afinitesi [Ag.Ab] Kd=Afinite = [Ag]x[Ab] [Ag] ve [Ab] serbest haldeki , [ Ag . Ab ] immun kompleks konsantrasyonlarıdır.

Afinite maturasyonu sekonder immün yanıtta oluşan Ab.ın afinitesi, primer yanıtta oluşan Ab.ın afinitesinden daha yüksektir. Düşük Kd yüksek afiniteyi gösterir. Kd : 10-6 - 10-9 PİY Kd : 10-8 - 10-11 SİY IgM cevabında afinite maturasyonu olmadığı için bu durum; Ab yapımında IgM’den IgG’ye izotip dönüşümü ile beraber gelişir.

Afinite maturasyonu Afinite maturasyonunun derecesi Ag konsantrasyonuna bağlıdır. Yüksek Ag dozu düşük Ag dozuna göre daha zayıf afinite maturasyonuna neden olur. Düşük Ag dozlarında sadece yüksek afiniteli Ab reseptörü taşıyan B hücreleri uyarılmakta ve yüksek afiniteli Ab üreten klonlar gelişmektedir.

Afinite maturasyonu B hücreleri, Ag.lere karşı spesifitelerini genellikle değiştirmemelerine rağmen; bir klon tarafından üretilen Ab.ın afinitesi, immünglobulinlerin değişken bölge genlerini etkileyen bir somatik hipermutasyonla değişebilir. Yeni yavru hücreler bu mutasyonları takiben yüksek afiniteli klonlar oluştururlar. Antikor oluşturan hücrelerde meydana gelen bu somatik mutasyonlar yüksek afiniteli antikor oluşumunda önemlidirler.

Çok sayıda antijenik determinant Antikordaki en az iki bağlanma bölgesi Multivalan bağlanma Pentamerik IgM in multivalan bir Ag.ye aviditesi IgG ye göre daha yüksek olabilir.

Avidite Ab.nin paratopları ile Ag.lerin epitopları arasındaki birleşmenin toplam gücü.

Avidite olgunlaşması Avidite olgunlaşmasının derecesi Ag dozu ile orantılıdır. Düşük doz Ag daha çabuk olgunlaşmaya neden olmaktadır. Dolayısıyla düşük aviditeli Ab.lar, yüksek Ag düzeylerinin bulunduğu enfeksiyonun ilk evresinde üretilmektedir.

Neden Avidite Testleri ?? Bazen akut bakteri , virus ve parazit enfeksiyonlarında IgM tipi Ab.lar beklenenden daha erken kaybolmakta veya düşük titrelerde aylar - yıllar boyunca saptanabililir düzeyde kalmaktadır.

Neden Avidite Testleri ?? Bu nedenle primer enfeksiyon, re-enfeksiyon veya re-aktivasyon ayırımında IgM testleri yetersiz kalmaktadırlar. Bu yüzden bunların ayırtedilmesinde IgG avidite testleri kullanılmaya başlanmıştır.

IgG Avidite Testleri Primer enfeksiyon sonrası oluşmaya başlayan spesifik IgG Ab.ın aviditeleri, takip eden haftalar ve aylarda immun yanıtın maturasyonu ile giderek artış gösterir.

primer immun yanıtda erken dönemde düşük aviditeli geç dönemde yüksek aviditeli IgG Ab.ları oluşur. Reaktivasyon/reenfeksiyon da da yüksek aviditeli Ab.lar tabloya hakimdir.

IgG Avidite Testleri Tek bir serum örneğinde IgG aviditesi hesaplanarak enfeksiyon hastalıklarının tanısına yardımcı olunmaktadır.

Spesifik IgG avidite saptama yöntemleri Aglütinasyon RİA KBD ELİSA Elektroforez

ELISA IgG Avidite TORCH İlk kez Hedman tarafından 1988 yılında Rubellanın akut-kronik enfeksiyonunun ayırımı için kullanılan yöntem, yine Hedman tarafından 1989 yılında Toksoplazmozun akut-kronik infeksiyonunun ayırımında kullanılmıştır.

Avidite Testleri Avidite testlerinde, antijen ve antikor arasındaki bağlar protein denatüre edici maddelere maruz bırakılarak, bu bağların gücü incelenir. Antikor aviditesi arttıkça, antijen-antikor kompleksleri ortamda bulunan protein denatüre edici maddelere karsı daha stabil olmaktadır.

Denatüre Edici Maddeler dietilamin guanidin hidroklorid potasyum tiyosiyonat

Avidite Testleri Eğer antijen ile antikor arasındaki bağlar daha yeni oluşmuşsa, denatüre edici maddelere çok dayanamamakta, bağlar kopmakta ve düşük avidite değerleri ortaya çıkmaktadır.

Avidite hasta serumlarının denatüre edici madde içeren ve içermeyen solüsyonlarla paralel olarak incelenmesi gerekmektedir. Avidite index : denatüre edici enzim / Fizyolojik Buffer CMV için > 0,2 kronik enf. OD 450nm Toxo için > 0,3 kronik enf. Altındaki değerler yeni geçirilmiş enf.

Avidite Testlerinin Klinikte Kullanımı Toksoplazma CMV (Cytomegalovirus) EBV (Epstein-Barr Virus) Rubella çeşitli enfeksiyonlarda, bazı aşı sonrası immun yanıtın değerlendirilmesinde spesifik ıgG antikorlarının matürasyonu incelenmektedir.

IgG Avidite Testlerinin Önemi Gebelikte konjenital enfeksiyonlara neden olan toxoplasma, cytomegalovirus (CMV) ve rubella serolojisinde primer infeksiyon ile reinfeksiyon veya reaktivasyon ayırımını yapabilmek için avidite testleri çok yararlıdır.

IgG Avidite Testlerinin Önemi Gebelikte bu enfeksiyonların ciddi konjenital anomalilere yol açtığından, gebeliğin devamı veya sonlandırılması kararı açısından hayati önem taşımaktadır.

IgG Avidite Testlerinin Önemi Ayrıca yalancı IgM pozitifliği ve stabil IgG titresi ile IgM varlığı yorumu zorlaştırır. Dolayısıyla akut enfeksiyonun tanısında önemli sorunlar ortaya çıkmaktadır. IgG ve IgM’ in birlikte pozitif olduğu olgularda akut veya geçirilmiş enfeksiyonu belirleyebilmek için IgG Avidite testi kullanılır.

IgG Avidite Testi Enfeksiyonun erken döneminde oluşan düşük aviditeli IgG’ lerin geç dönemdeki yüksek aviditeli IgG.den ayrımını sağlar. Avidite testlerinde en iyi sonuç, yüksek aviditeli antikor saptandığında alınmaktadır. Yüksek aviditeli antikorların saptanması, son üç –beş ay içerisinde akut enfeksiyon geçirmediğini göstermektedir.çünkü düşük aviditeli antikorlar akut enfeksiyondan aylar sonra saptanabilmektedir

Çeşitli çalışmalarda pnömokok, meningokok, H Çeşitli çalışmalarda pnömokok, meningokok, H.influenzae ve tetanoz aşılarından sonra oluşan antikor yanıtını izlemede avidite testlerinin yararlılığı vurgulanmaktadır. Avidite testi HIV infeksiyonunda, virüsün bulaş zamanının belirlenmesinde kullanılmakta; bu sayede erken teşhis ve tedavi şansı yakalanmaktadır.

IgG Avidite Testi Organ trasplantasyonlu veya immun süpresif hastalarda CMV EBV Toksoplazmoz HHV6 primer veya rekürren enfeksiyonların ayrımında kullanılmaktadır.

IgG Avidite Testi Avidite testlerinin özgüllüğü ve duyarllılığı %100 değildir Henüz tam bir standardizasyon sağlanamamıştır.