BİDEB-2229   Biyoloji Öğretmenlerine Proje Danışmanlığı Eğitimi Çalıştayı AZİZ COMET Grubu

PROJENİN ADI SİLİSYUM DİOKSİT NANOPARTİKÜLLERİNİN İNSAN LENFOSİT HÜCRELERİNDEKİ GENOTOKSİK ETKİSİ

PROJE EKİBİ Selim AYDAŞ – Pursaklar Fen Lisesi / ANKARA Abdullah Baki BAKAR – Şırnak Lisesi/ ŞIRNAK Emel HALLAÇ – Adıyaman Anadolu Lisesi / ADIYAMAN

PROJE DANIŞMANI Doç. Dr. Aziz ASLAN

PROJENİN AMACI Yiyecek ve içeceklerde gıda katkısı olarak, elektronik cihazlarda, cam eşyalarda ve farmasötik olarak ilaç tabletlerinde yaygın olarak kullanılan Silisyum dioksit (SiO2)’in, insan periferal lenfosit kan hücrelerinde DNA hasarına neden olup olmadığını belirlemektir.

HİPOTEZ SİLİSYUM DİOKSİT NANOPARTİKÜLLERİNİN İNSAN LENFOSİT HÜCRELERİNDE GENOTOKSİK ETKİSİ VARDIR.

NANOPARTİKÜLLER Nanopartiküller (NP) 100 nm den küçük boyutlarda, elektron tutucu özellikteki bileşikler olarak tanımlanmaktadır (Oberdörster ve ark., 2005). Bu partiküllerin farklı büyüklüklerdeki eşşiz özelliklerinden dolayı gerçekleşen teknolojik hızlı ilerlemeler nanoteknoloji alanlarının oluşmasını sağlamıştır.

NANOTEKNOLOJİ; Günümüzde güneş kremleri, kozmetik, kompozitler, killer, tekstil, yüzey kaplamaları gibi endüstriyel alanlarda yaygın olarak kullanılmaktadır. http://www.zaman.com.tr/ekonomi_leke-tutmayan-gomlek-urettik-deterjancilar-biraz-uzulecek_837844.html

Boyalar, doğada düzenleyici olarak, yakıt hücrelerinde, ekranlar, bataryalar, katalizörler, yağlayıcılar, manyetik malzemeler vb. alanlarda araştırmalar devam etmektedir (Kayır ve Baççıl, 2010). http://nanoteknolojinedir.com/?p=1693

Her yeni buluşun kendi içinde barındırdığı olumsuz etkilerde olabilmektedir. NP’lerin insanın yaşam kalitesini artırmasının yanında olumsuz bazı etkilere neden olduğu yapılan bazı araştırmalarla ortaya konulmuştur (Dreher, 2004).

Bu araştırmalar bu tip maddelerin özellikle kalıtsal madde üzerinde hasarlara neden olduğunu göstermektedir. Bu nedenle NP’lerin genetik materyal üzerinde nasıl bir etkiye sahip olduğu önemli bir araştırma konusudur.

Silisyum dioksit Nanopartikülü yiyecek ve içeceklerde gıda katkısı olarak, elektronik cihazlarda, cam eşyalarda ve farmasötik olarak ilaç tabletlerinde yaygın olarak kullanılmaktadır.

SiO2 NP’lerinin akciğer toksisitesine neden olduğu belirtilmiş olmasına rağmen mekanizması henüz anlaşılmamıştır.

Bazı son araştırmalarda da yine benzer şekilde NP’lerin hücresel birikim gösterdiği ve/veya sitotoksik olduğu söylenmektedir (Hauck ve ark., 2008; Milena ve ark., 2009).

Bu çalışmada Silika olarak da bilinen Silisyum dioksit (SiO2) NP’ünün insan periferal lenfosit kan hücrelerine etkisi araştırılmıştır.

MATERYAL ve METOT Bu çalışma Akdeniz Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Genetik Laboratuarında yapılmıştır.

Etik Kurul raporu alınarak İnsan kan örneği temin edilmiştir.

SiO2 gibi bileşiklerin neden olduğu DNA hasarının tespit edilmesinde güvenilir ve hassas bir teknik olan COMET testi kullanılmıştır.

Comet yönteminin temel prensibi kimyasal ve fiziksel nedenlerle oluşan genotoksik ve sitotoksik ajanların canlı hücreleri üzerindeki etkilerini, hücrelerin DNA’larını tek tek inceleyerek tespit etmektir (Dikilitaş ve Koçyiğit, 2010).

İnsan periferal lenfositlerinde meydana gelen DNA hasarı kuyruklu yıldız görünümünde olduğu için bu yönteme “COMET” adı verilmiştir.

Konsantrasyon (µg/mL) KONTROL GRUBU DENEY GRUBU Saf Su Negatif (5 mM EMS) Pozitif SiO2 Nanopartikülü - 6 nm 1 Deney 1 10 Deney 2 100 Deney 3 SiO2 Nanopartikülü - 30 nm Deney 4 Deney 5 Deney 6

Deney loş ışıkta gerçekleştirildi.

Kan ve PBS’nin buzun içerisinde bekletilmesi.

Lenfositlerin Kandan Ayrılması İçin Ayıraç İlavesi

Santrifüj Aşaması

Lenfositlerin Santrifüj Sonrası Üste Çıkması (pembe katman)

Alınan lenfositlerin Kimyasallar ile karıştırılması ve İnkübasyon Aşaması

Santrifüj Aşaması

2 tabakalı NMA’ lı Lam Üzerine LMA - lenfosit Tabakası Oluşturulması ve Son Katman (sandvich)

Lising Solüsyonu ve Şale Aşaması

Elektroforez Tankı Alışma Aşaması

Elektroforez Tankı Yürüme Aşaması

Nötralizasyon solüsyonu ve şale 3 Kez

Etidyum bromür ile boyanıp Floresans mikroskopta sayım (100 Hücre DNA’ sı)

Bilgisayar Comet programı ile lenfosit hücrelerinin DNA yapılarının bilgileri tespiti Lenfositlerin DNA bilgilerinden kuyruk yoğunluğu ve kuyruk momenti verileri alınarak student’s t testi ile karşılaştırılarak p<0.05 anlamlılık düzeyinde karşılaştırıldı.

Sonuçlar ve Tartışma Silisyum dioksit konsantrasyonları (6 ve 30 nm) uygulanan insan periferal lenfosit hücrelerinin DNA’larında meydana gelen kuyruk yoğunluğu ve momenti Tablo I’de verilmiştir.

Tablo 1. KOMET Testinde İki Farklı Nanoboyuttaki (6 ve 30 nm) Silisyum Dioksit (SiO2) Nanopartikülünün İnsan Periferal Lenfosit Hücrelerindeki Genotoksik Etkileri. Konsantrasyon (µg/mL) Kuyruk Yoğunluğu (%) a Kuyruk Momenti (µm) a Negatif Kontrol Saf Su 3.54 ± 1.03 1.37 ± 0.67 Pozitif Kontrol (5 mM EMS) 12.20 ± 2.17 3.91 ± 1.02 SiO2 Nanopartikülü - 6 nm 1 5.23 ± 1.24 1.82 ± 0.69 10 5.31 ± 0.84 1.47 ± 0.24 100 2.27 ± 0.67 0.57 ± 0.18 SiO2 Nanopartikülü - 30 nm 6.57 ± 1.21 2.28 ± 0.57 4.59 ± 0.68 1.08 ± 0.17 3.67 ± 0.57 0.94 ± 0.15

Negatif Kontrol grupları ile diğer grupların DNA’larında meydana gelen kuyruk yoğunlukları ile momentleri arasında uygulana paired samples t-testi sonuçları Tablo II’ de verilmiştir.

Paired-samples t-testi sonuçları Karşılaştırılan Gruplar Kuyruk Yoğunluğu Anlamlılık Düzeyi (p< 0.05) Kuyruk Momenti Anlamlılık Düzeyi (p< 0.05) Saf Su- EMS 0.001 0.044 Saf Su- Deney 1 0.211 0.615 Saf Su- Deney 2 0.196 0.897 Saf Su- Deney 3 0.310 0.255 Saf Su- Deney 4 0.060 0.303 Saf Su- Deney 5 0.408 0.681 Saf Su- Deney 6 0.917 0.532

Çıkan sonuçların saf suya göre anlamlılık düzeyleri, 0 Çıkan sonuçların saf suya göre anlamlılık düzeyleri, 0.05’in altında çıkmıştır.

Comet yöntemi sonucunda oluşan hasarlı ve hasarsız DNA fotoğrafları

Tek hücre jel elektroforez yöntemi ile farklı seviyelerde hasara uğramış DNA’ların görüntüleri. a-b: Hasarsız, c-d-e: Hasarlı DNA   e c d b a

c d e

Yapılan bilimsel çalışmalar farklı boyutlardaki Nanopartiküllerin farklı sonuçların ortaya çıkmasına sebep olduğunu göstermiştir. Bu çalışmada kullanılan 6 ve 30 nm boyutundaki SiO2 nanopartiküllerinin insan lenfosit hücrelerinde hasara neden olmamıştır.

benzer bir çalışmada normal boyuttaki alüminyum oksit (Al2O3) nanopartiküllerinin tek başına sıçanların periferal kan hücrelerinde in vivo koşullarda COMET ve mikronükleus (MN) testlerinde herhangi bir genotoksik etkiye neden olmadığı halde alüminyum oksit NP’lerin iki farklı partikül boyutunun (Al2O3-30 nm ve Al2O3-40 nm), DNA’daki tek iplik kırıklıklarını ve MN oluşum frekansını indükleyebildikleri gösterilmiştir (Balasubramanyam ve ark., 2009).

Son yıllarda COMET testi ile yapılan çalışmalarda SiO2 NP’nün 20-400 nm arasındaki partikül boyutlarında herhangi bir genotoksik aktiviteye rastlanmamıştır (Jin ve ark., 2007; Wang ve ark., 2007a, b; Barnes ve ark., 2008; Lee ve ark., 2009).

Son Söz Malzemelerinde 6 ve 30 nm boyutundakji SiO2 Nanopartükülü bulunduran firmaların ürünleri insan sağlığını olumsuz etkilememektedir..

KAYNAKLAR BALASUBRAMANYAM A., Sailaja N., Mahboob M., Rahman M.F., Hussain S.M., Grover P., In vivo genotoxicity assessment of aluminium oxide nanomaterials in rat peripheral blood cells using the comet assay and micronucleus test, Mutagenesis, 24, 245-51, (2009).   BARNES C.A., Elsaesser A., Arkusz J., Smok A., Palus J., Lesniak A., Salvati A, Hanrahan JP, Jong WH, Dziubałtowska E, Stepnik M, Rydzyński K, McKerr G, Lynch I, Dawson KA, Howard CV., Reproducible comet assay of amorphous silica nanoparticles detects no genotoxicity, Nano Lett., 8, 3069-74, (2008). DİKİLİTAŞ, M., Koçyiğit, A., Canlılarda “Tek Hücre Jel Elektroforez” Yöntemi İle Dna Hasar Analizi (Teknik Not): Comet Analiz Yöntemi, HR.Ü.Z.F. Dergsi, 14(2), 77-89 (2010) DREHER, K.L., Health and Environmental Impact of Nanotechnology: Toxicological Assessment of Manufactured Nanoparticles, Toxicology Sciences, 77, 3-5 (2004). GAZZANO E., Turci F., Foresti E., Putzu M.G., Aldieri E., Silvagno F., Lesci I.G., Tomatis M., Riganti C., Romano C., Fubini B., Roveri N., Ghigo D., Iron-Loaded Synthetic Chrysotile:  A New Model Solid for Studying the Role of Iron in Asbestos Toxicity, Chem. Res. Toxicol., 20, 380-7, (2007). HAUCK T.S., Ghazani A.A., Chan W.C., Assessing the effect of surface chemistry on gold nanorod uptake, toxicity, and gene expression in mammalian cells, Small, 4, 153-9, (2008). JIN Y., Kannan S., Wu M., Zhao J.X., Toxicity of luminescent silica nanoparticles to living cells, Chem. Res. Toxicol., 20, 1126-33, (2007).

KAYIR Y. Z. , Baççıl, E. G. , 15. “Nanoteknoloji Nedir KAYIR Y.Z., Baççıl, E.G., 15. “Nanoteknoloji Nedir?”, Uluslar arası Metalurji ve Malzeme Kongresi, http://www.metalurjist.gen.tr/docs/makale4.pdf, 03.02.2013.   LEE S.W., Kim S.M., Choi J., Genotoxicity and ecotoxicity assays using the freshwater crustacean Daphnia magna and the larva of the aquatic midge Chironomus riparius to screen the ecological risks of nanoparticle exposure, Environ. Toxicol. Pharmacol., 28, 86- 91, (2009). MILENA R.V., Luisa D.C., Han Z., Efficient Energy Transfer between Silicon Nanoparticles and a Ru-Polypyridine Complex, J. Phys. Chem. C., 113, 2235-3340, (2009). OBERDORSTER G., Oberdoerster E., Oberdoerster J., Nanotoxicology: an emerging discipline evolving from studies of ultrafine particles, Environ. Health Perspect., 113, 823- 39, (2005). SINGH N.P., McCoy M.T., Tice R.R., Schneider E.L., A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells, Exp. Cell Res., 175, 184-91, (1988). WANG J.J., Sanderson B.J.S., Wang H., Cytotoxicity and genotoxicity of ultrafine crystalline SiO2 particulate in cultured human lymphoblastoid cells, Environ. Mol. Mutagen., 48, 151-7, (2007a). WANG J.J., Wang H., Sanderson B.J.S., Ultrafine quartz-induced damage in human lymphoblastoid cells in vitro using three genetic damage end-points, Toxicol. Mech. Methods., 17, 223-32, (2007b).

TEŞEKKÜR Bize bu projede destek olan Akdeniz Üniversitesine, fon sağlayan TÜBİTAK’a, projeyi yürüten Prof. Dr. Semra MİRİCİ ve ekibine, çalışmalarımızda bize danışmanlık yapan Doç. Dr. Aziz ASLAN’a, Akdeniz Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Genetik Laboratuarını bizim kullanımımıza açan Prof. Dr. Bülent KAYA’ya, Laboratuarda bizden yardımlarını esirgemeyen Araş.Gör. Dr. Eşref DEMİR’ e ve Araş.Gör. Fatma TURNA’ ya,

Bu stresli proje yolunda bizi çocukluğumuza döndürerek dinlendiren Tülin TÜMTÜRK YILMAZ hocamıza Bizi otel ve üniversite arasında taşıyan Gülnaz ALKAN’ a Bizi Dinlediğiniz İçin Tüm Değerli Öğretmen Arkadaşlarımıza da TEŞEKKÜR EDERİZ….