2 Giriş İnfluenza virüsü Orthomyxoviridae ailesinin yegane üyesidir ve her yıl mevsimsel grip salgını, nadiren de pandemi yapar. Hem epidemisi hem pandemisi, ciddi mortalite ve morbidite nedeni olmakta ve her yıl önemli ekonomik kayıplara neden olmaktadır. Kilbourne 2006, Taubenberger & Morens 2006 Doç. Dr. Yeşim Uncu

Bu nedenle her yıl, yıllık surveyans çalışmaları ile influenza virüsünün monitorize edilmesi ve dolaşımdaki virüsün tipinin belirlenmesi ve antiviral tedaviye dirençli tiplerinin izlenmesi çok önemlidir. Doç. Dr. Yeşim Uncu

İnfluenzadan korunmada major rol aşılamanın olsa da, antiviral tedavi virüsün idaresinde önemli bir rol oynamaktadır. M2 inhibitörleri ( amantadin ve rimantadin ) 25 yıldan beri antiviral tedavide yer almaktadırlar. – Hücre içinde virüsün kılıf çıkarma evresinde etkilidirler. – Yalnızca influenza A’ya etkilidirler. Doç. Dr. Yeşim Uncu

M2 inhibitörlerinin influenza A’ya seçici etkili olmaları ve sık rezistan gelişmesi nedeni ile nöraminidaz inhibitörleri ( NAIs; oseltamivir ve zanamivir ) hem influenza A hem de influenza B’nin tedavisinde geliştirilmişlerdir. – Yeni oluşan virüsün konak hücresinden ayrılma aşamasına etkildirler. Böylece yeni oluşan hücrelerin enfekte olması engellenir ve enfeksiyonun solunum yollarında yayılması durdurulur. Doç. Dr. Yeşim Uncu

Oseltamivir 2003 yılından beri tüm dünyada kullanılmaktadır ve yeni pandemide savunmada çok önemli bir rol oynayacağına inanılmaktadır. Bu nedenle ilaç depolaması bu pandemi hazırlıkları içinde yer almaktadır. Mc Kimm-Breshkin et al. 2003, Monto et al Doç. Dr. Yeşim Uncu

Oseltamivir rezistansına yönelik izlemler yapılmakta ve 2007’nin son çeyreğine kadar nispeten yavaş bir dirençten söz edilmektedir. Ancak 25 Ocak 2008’de Norveç’ten WHO’ne bildirilen bir raporda belirgin oseltamivir rezistansından bahsedilmektedir. Nöraminidaz genindeki (N1) tek bir aminoasit değişikliği ile ortaya çıkan H275Y suşunda direnç oluşturduğu gözlenmiştir. Doç. Dr. Yeşim Uncu

Amaç Bu çalışma; Türkiye’de iki influenza referans laboratuarı tarafından sezonundaki influenza yayılım hızını, yayılan influenza tiplerini ve alt gruplarını ve A/H1N1’e karşı gelişen oseltamivir direncini belirlemeye yönelik yürütülmüştür. Doç. Dr. Yeşim Uncu

Gereç ve Yöntem Türkiye’nin batıdaki 5 bölgesinden (Antalya, Bursa, Edirne, İstanbul ve İzmir) ve tüm ülke genelinden gönüllü sağlık merkezlerinden toplam 524 burun sürüntüsü toplanmıştır. Örnekler; Kasım Nisan 2008 tarihleri arasında birinci basamak sağlık kuruluşlarına influenza benzeri bulgularla başvuran hastalardan alınmış ve ticari transport ortamı* içinde laboratuara gönderilmişlerdir. *(ViroCult, Medical Wire & Equipment CO, Corsham England) Doç. Dr. Yeşim Uncu

İmmün-yakalama ELISA Tüm örnekler MDCK hücre kültüründe 3 gün bekletilerek ELISA yöntemi ile influenza A-B tiplerinin ayrımı yapılmıştır. Kullanılan tüm ELISA reaktifleri DSÖ’nün önerdiği ve NIC Laboratuarları (Lyon, Fransa) tarafından satışı yapılan reaktiflerdir. Doç. Dr. Yeşim Uncu

Moleküler alt tip ve antigenik özellik 111 influenza A tipinin 80 tanesi salgının pik dönemi olan Aralık-Ocak döneminde izole edilmiştir. Bu 80 örneğin 40 tanesinden (%50) rastgele örnekleme ile MDCK hücre kültüründe moleküler alt tip için üretim yapılmıştır. Hemaglütinin inhibisyonu (HAI) ile antijenik özellikleri belirlenmiştir. A/New Caledonia/20/99 A/France/571/2006 A/Solomon Islands/3/2006 A/France/641/2007 Doç. Dr. Yeşim Uncu

RNA atılım ve PT-PCR Alt-tipleme MDCK hücre kültüründe 3 gün bekleyen örnekler yüksek derecede saflaştırılmış viral RNA izolasyon kiti ile viral RNA ürününü elde etmek için kullanılıyor. N1, N2, H1 ve H3 için ve diğer alt-tipler için başka modifiye yöntemler de kullanılmış. Doç. Dr. Yeşim Uncu

Sıralama, Filogenetik ve İkincil Protein Yapı Analizi PT-PCR ürünleri ticari bir kit ile saflaştırılıyor. Sıralama REFGEN Biyoteknoloji (Ankara) tarafından yapılıyor. H1N1 virüsün N1 segmenti (1,431nt) kısmen oseltamivir direnci gösteren kritik bölgeye ( nt segmenti arasındaki 495nt kısmı) aitti. Sonuç sıralama CLC Main Workbench yazılımında analiz edildi. Oseltamivir direnci ve duyarlı referansları NCBI Gen Bankasından alınmıştır. – Ulaşım numaraları: FJ403561, FJ403582, FJ403583, EU914908, FJ403568, EU887035, EU516289, EU516290, FJ403579, FJ403578, FJ403581, FJ Doç. Dr. Yeşim Uncu

Sonuçlar İmmün-yakalama ELISA kullanarak incelenen 524 örneğin 163’ü (%31) influenza (+) idi; – 111’i (%68) influenza A – 52’si (%31) influenza B Doç. Dr. Yeşim Uncu

Doç. Dr. Yeşim Uncu Infleunza A Infleunza B

PT-PCR subtiplemesi ile 40 influenza A’nın hepsi H1N1 idi ve 10 influenza B ise antijenik olarak HAI ile karakterize idi. – A/H1N1’lerin hepsi A/Solomon Islands/3/2006 ile ilişkili idi. – B/Florida/4/2006 referans türü ile ilişkiliydi. 40 A/H1N1’nin 30 tanesi 201 ile 365.aminoasit arasında sıralanmıştı ve 30 A/H1N1’in 6’sında (%20) H275Y (N2 numaralandırmasına göre H274 Y) vardı. Doç. Dr. Yeşim Uncu

NCBI Gen Bankası tarafından yayınlanan oseltamivir dirençli suşların aminoasit ve nukleotid dizilimi Doç. Dr. Yeşim Uncu

Topolojik filogenetik analiz sonucuna göre Gen Bankasının yayınladığı suşlar ile Oseltamivir dirençli suşlar çok yakın ilişkiliydi. Doç. Dr. Yeşim Uncu

Hem duyarlı hem dirençli suşların tümüne CLC Main Workbench yazılımı kullanılarak sekonder protein yapı analizi yapılmıştır. – H275Y mutasyonunda duyarlı suşların Beta yapısındaki 276.pozisyondaki amino acid aminoacidlere genişletilmiştir. Hem duyarlı hem de dirençli suşlardaki H275Y dışındaki tüm amino acid yer değiştirmelerinin proteinin alfa sarmalının ya da Beta zincirinin yapısında herhangi bir değişikliğe yol açmamıştır. Bununla birlikte tüm duyarlı suşlarda amino acidlerinden oluşan beta yapı yeni oluşan D354G’de kaybolmaktadır. Doç. Dr. Yeşim Uncu

İleri analizler ile hem H275Y hem de D354G mutasyonlarının antijenik indeksinde azalma olduğu gösterilmiştir. Florometrik nöraminidaz aktivite incelemesi ile Oseltamivir’e azalan duyarlılık H275Y mutasyonundaki tüm suşlarda gözlenmiştir ve aynı analizde tüm suşların Zanamivir’e karşı duyarlı oldukları gözlenmiştir. Doç. Dr. Yeşim Uncu

Tartışma Bu araştırmada izolasyon hızı (%31) Avrupa ve ABD’den daha yüksek tespit edilmiştir. Bunun nedeni muhtemelen surveyans öncesi doktorlara influenza vaka tanımı ve örnek alınması ile ilgili iyi bir bilgilendirme yapılmasındandır. Doç. Dr. Yeşim Uncu

Türkiye’de laboratuarda doğrulanan tanılara göre influenza aktivitesi 48.haftada başlamış ve 17.hafta sonunda bitmiştir. 5.haftaya kadar influenza A baskın iken 8.haftada B tipi başlamış ve 11.haftadan itibaren B tipi egemen duruma geçmiştir ve mevsimin sonuna dek devam etmiştir. Doç. Dr. Yeşim Uncu

Bu bulgular Kanada ve Avrupa’dan gelen raporlarla uyumlu ancak Asya ile uyumlu değildir ki, Asya’da egemen olan tip B dir (CDC 2008). Türkiye’de mevsiminde bütünü ile hakim olan influenza A dır. Influenza B %9.9 ile mevsimine göre (%3.1) daha belirgin hale gelmiştir. Influenza B aktivitesinde ilkbahara doğru bir kayış gözlemlenmiştir. Doç. Dr. Yeşim Uncu

Tüm influenza A’lar H1N1 dir. Önceki 2 yılda ise egemen olan subtip H3N2 idi. Doç. Dr. Yeşim Uncu

ABD’de mevsimin başlangıcında egemen olan H1N1 idi. Ancak Ocak’tan sonra H3N2 egemen duruma geçmiş ve mevsiminde de devam etmiştir. Kanada ve Avrupa’da egemen olan H1N1 di. Türkiye’deki H3N2’den H1N1’e shift muhtemelen Avrupa ile olan yakın ilişki ve gidiş gelişlerdir. Doç. Dr. Yeşim Uncu

Tüm H1N1’ler antijenik olarak A/Solomon Islands/3/2006 ile ilişkiliydi ki, influenza kuzey yarımküre aşılarının bileşenindeki H1N1 komponenti idi. Ancak aşılardaki B bileşeni ’de egemen olan B/Florida/4/2006 dan farklı idi. Doç. Dr. Yeşim Uncu

Ocak 2008’de Norveç DSÖ’ne artan influenza direnci (oseltamivir) rapor etmiştir. O tarihe kadar toplumda düşük oseltamivir direnci bildirilmekteydi. Dünya Influenza Surveyans Ağı (Global Influenza Surveillance Network) Japonya veya Avrupa’dan gelen suşlarda oseltamivir direnci göstermemiştir, ABD’den gelen suşlarda ise <%1 oran saptamışlardır ( sezonunda). Ancak Ocak 2008’den sonra bir çok ülke artan direnç rapor etmiştir. Doç. Dr. Yeşim Uncu

Oseltamivir Türkiye’de 2004’ten beri bulunmaktadır ve influenza salgını sırasında satışlar iki katına katlamıştır. Bununla birlikte oseltamivir Türkiye’de çok yaygın kullanılmamaktadır. Doç. Dr. Yeşim Uncu

Bu rapor Türkiye’den yayınlanan ve H1N1’de oseltamivir direncini tanımlayan aynı zamanda %20 oranında H275Y mutasyonunu gösteren ilk rapordur. Ancak burada unutulammalıdır ki, %20 oran 30 suşun incelenmesi ile elde edilen bir orandır. Tüm suşlar incelenememiştir. Daha önceki yayınlarda bahsedilen D354G mutasyonu buradaki H275Y mutasyonu olan tüm suşlarda gözlenmiştir ancak oseltamivir hassas olan suşların hiç birinde gözlenmemiştir. Doç. Dr. Yeşim Uncu

Herlocher ve ark. H275Y mutasyonu gösteren oseltamivir dirençli suşlar, vahşi suşlara göre daha yavaş yayılmakta ve enfektif olması için konağın 100 kat fazla virüse maruz kalması gerekmektedir. Bouvier ve ark ise oseltamivir dirençli mutasyonların virüsün aerosol yayılımının azaldığını Gine domuzlarında göstermiştir. Doç. Dr. Yeşim Uncu

Bu çalışmanın epidemiyolojik veri analizleri sonucu, oseltamivir dirençli ve hassas suşların yaptığı hastalık tablosu arasında herhangi bir fark göstermemiştir. Hastaların hiç biri aşılı değildi ve hiç oseltamivir alan yoktu. Yaş aralığı 2.5 ile 57 yaş arasında değişmekteydi. MDCK hücre kültüründe üretilmeleri esnasında dirençli zincirler hassas olanlara göre 3-4 gün geç ürediler. Doç. Dr. Yeşim Uncu

Nörominidaz Inhibitör Duyarlılık Ağı 1999 yılında kurulmuş ve NAIs lerine direncin ortaya çıkışını takip etmektedir. Meşhur pandemi için bir çok ülke oseltamiviri pandemi hazırlık planlarının arasına katmıştır ve bu nedenle direncin düzenli olarak monitorizasyonu oldukça önemlidir. Bu sayede Dünya genelinde influenza kontrol altına alınabilecektir. Doç. Dr. Yeşim Uncu