MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II: PROTEİNLERİN İZOLASYONU VE ANALİZİ Doç.Dr.Evren ÖNAY UÇAR 1.Ders

MOLEKÜLER BİYOLOJİDE ANA KURAL ve TEMEL ÇALIŞMA ALANLARI (N. Arda) Gen dizisi  transkriptler   primer protein ürünleri   fonksiyonel proteinler (DNA) (mRNA) Transkripsiyonel kontrol Translasyonel Translasyon sonrası kontrol (post-translasyonel modifikasyonlar) Moleküler etkileşimler Dış etkenler DNA RNA PROTEİN MOLEKÜLLER ARASI ETKİLEŞİM Nasıl? Neden? Nükleik asitlerle ilgili teknikler Proteinlerle ilgili teknikler Protein fonksiyon analizleri Ör. Metabolik işleyiş, enzim aktivitesi, etkileşimler Nükleotid dizisinin belirlenmesi mRNA analizleri Protein yapı analizleri

Bir bilmecenin parçaları ! OMİK VERİLER : Bir bilmecenin parçaları !

transkripsiyon translasyon modifikasyon-organizasyon DNA RNA PROTEİN ÖZETLE: transkripsiyon translasyon modifikasyon-organizasyon DNA RNA PROTEİN HÜCRESEL İŞLEVLER ANA HEDEF : Hücrenin moleküler organizasyonunu, dolayısıyla canlılığın moleküler temellerini anlamak !!!

DOĞRU İŞ GÖREN BİR PROTEİN TEORİK YAKLAŞIM: Nükleotid dizisi Amino asit dizisi UYGUN 3 BOYUTLU YAPIDA UYGUN ZAMANDA UYGUN YERDE UYGUN MİKTARDA DOĞRU İŞ GÖREN BİR PROTEİN Genlerle proteinler arasında bire bir bir ilişki yoktur! Çünkü: DNA P1 P2 P3 P4 P5

AKTİF BİR PROTEİN OLUŞURKEN 400’DEN FAZLA KİMYASAL MODİFİKASYONUN GERÇEKLEŞEBİLECEĞİ ÖNGÖRÜLMEKTEDİR. İNSANDA: 20.500 GEN 250.000 – 500.000 PROTEİN

Nasıl iş görür ? SORULAR: Nerede ve/ya hangi proteinler var ? Ne kadar var? Yapısı nedir ? Ne gibi özellikleri var? Nasıl iş görür ? Hangi moleküllerle etkileşir?

LABORATUVAR ORTAMI

LABORATUVARDA KULLANDIĞIMIZ KİMYASALLAR Dünyada en az 65 milyon çeşit kimyasal bileşik üretiliyor ve değişik saflık derecelerinde piyasaya sürülüyor.... Kalitesine ve miktarına göre farklı fiyatlara satılıyor.

Hemen hepsi ithal ve “Molecular biology-grade”, yani kalitesi yüksek Hemen hepsi ithal ve “Molecular biology-grade”, yani kalitesi yüksek. Bunun için de çok pahalı!!!!

Kimyasalların bazıları (özellikle ENZİMLER) soğutucularda (+4oC ve -20 veya -80oC derin dondurucularda) saklanmalıdır.

SIVI AZOT TANKLARI

KAR-BUZ MAKİNASI

LABORATUVAR ARAÇ-GEREÇLERİ

Cam pipetler Pipet kutusu Pipet standı Puar

Mikropipetler

(L düzeyinde sıvı transferi yapabilen cam şırıngalar) Hamilton şırıngalar (L düzeyinde sıvı transferi yapabilen cam şırıngalar)

TEMEL ALET VE EKİPMANLAR TERAZİ pH-metre

ISITICILI MANYETİK KARIŞTIRICI SU BANYOSU ISITICILI MANYETİK KARIŞTIRICI VORTEX KARIŞTIRICI BALON ISITICI

SAF SU – DEİYONİZE SU CİHAZLARI

HAVAN VE HAVAN ELİ

KARIŞTIRICI HOMOJENİZATÖR (“Waring Blender”)

MİLLİ HOMOJENİZATÖR (“ultra turrax)

PİSTONLU HOMOJENİZATÖR

FRANSIZ BASINÇ HÜCRESİ

BALİSTİK HOMOJENİZATÖR

ULTRASONİKATÖR

FİLTRASYON DÜZENEKLERİ

MEMBRANLI FİLTRASYON

SANTRİFÜJLER

Vakumlu santrifüj (KONSANTRATÖR)

SPEKTROFOTOMETRE – MULTI(MICRO)PLATE READER (ÇOK KUYUCUKLU OKUYUCU)

DİĞER ÖZEL ALETLER Otoklav Yatay ve dikey elektroforez cihazları Kuru hava sterilizatörü Laminar flow – Steril çalışma kabinleri Ultrasonik banyolar Vakum pompaları Balon ısıtıcıları Distilasyon düzenekleri Evaporatör-Döner buharlaştırıcı Yatay ve dikey elektroforez cihazları Güç kaynakları Blotlama sistemleri Jel kurutma sistemleri Protein saflaştırma sistemleri Jel görüntüleme ve analiz sistemleri Mikroskoplar İklim kabinleri Çalkalamalı etüvler Etüvler

BİYOLOJİK MATERYALLER: MİKROORGANİZMALAR

HAYVANSAL ÖRNEKLER

HAYVAN DOKU VE HÜCRE KÜLTÜRLERİ

BİTKİLER VE BİTKİ DOKU KÜLTÜRLERİ

PROTEİN İZOLASYONU Bir proteinin nasıl izole edileceğine, hangi yöntemle ve ne derece saflaştırılacağına karar verirken göz önünde bulundurulan kriterler: AMAÇ; MATERYALİN VE ÇALIŞILACAK PROTEİNİN TİPİ VE MİKTARI; İŞLEMLERİN SÜRESİ VE MALİYETİ; ELDEKİ OLANAKLAR

HER DURUMDA Protein denatürasyonundan ve inaktivasyondan korunmak için çalışmanın her aşamasında pH ve SICAKLIK kontrol altında tutulmalıdır! Sıcaklığın olumsuz etkisi, işlemlerin SOĞUKTA (genelde 4oC’da) gerçekleştirilmesiyle önlenir. pH ise bu moleküllerin fizikokimyasal gereksinimleri doğrultusunda hazırlanmış tampon çözeltilerin kullanımı ile istenen değerde tutulur. Çalışma pH sı tamponun pKa’sına yakın olmalıdır.

TAMPON SEÇİMİNDE DİKKAT EDİLMESİ GEREKEN KURALLAR: Çalışma pH’sı, Tamponun anyonik veya katyonik karakterde olması, İyonik kuvvet ve sıcaklık etkisiyle pH değişimi, Kimyasal etkinlik, Biyolojik etkinlik, Diğer bileşenlerle etkileşim, Biyolojik membranların geçirgenliği, Toksisite, 280 nm ve altındaki dalga boylarında absorbsiyon, Maliyet, Çözünürlük

Ortam pH’sının 7 ve 7’ye yakın değerlerde olduğu koşulda en geniş çapta kullanılan tamponlar tris ve fosfat tamponlarıdır. Ek bilgi için Bkz. MBKY Kitabı Ek 9, 10, 11

İYONİK KUVVET ci = iyonun molar konsantrasyonu Bir tamponda yer alan iyonların derişimi ve yükü de protein çalışmalarında önem taşır. Fizyolojik iyonik kuvvet: 0.15-0.2 arasında! ci = iyonun molar konsantrasyonu zi = iyonun yükü (işareti dikkate alınmaz)

Ekstraksiyon Tamponunda bulunan diğer bileşenler: Proteaz inhibitörleri: Ör. Fenilmetilsülfonilflorür, PMSF Parçalama sırasında açığa çıkan Proteazlardan kjorunmak için EDTA gibi Kelatörler: Metal iyonlarını bağlamak için, çalışılan proteinin stabilitesini artırmak için (metalloproteazların etkisini azaltmak için 2-Merkaptoetanol (2-ME), Ditiotreitrol (DTT) gibi tiol bileşikleri: Bitkilerle çalışırken ortaya çıkan fenol oksidazların olumsuz etkisini azaltmak için Polivinilpolipirolidon (PVPP): Bitkilerle çalışırken ortaya çıkan fenolik maddeleri bağlaması için Kofaktörler ve diğer katkı maddeleri: Enzimleri stabilize etmek için Deterjanlar: Membran proteinlerinin çözünmesi için Streptomisin sülfat: Nükleik asitleri çöktürmek için

PARÇALAMA SIRASINDA MEYDANA GELEBİLECEK OLUMSUZLUKLAR. * Isı oluşması (Soğutma yapılır.) * Proteazların açığa çıkması (Proteaz inhibitörleri, Ör. Fenilmetilsülfonilflorür, PMSF kullanılır.) * Nükleik asit kontaminasyonu (Çöktürme ile uzaklaştırılır.) * Aşırı köpük oluşumu (Anti-köpük ajanlar, mekanik yöntemlerle uzaklaştırılır.) * Ağır metal toksisitesi (Besiyerinde kullanılan yan ürünlerden ileri gelir. Çöktürülerek uzaklaştırılır)

PARÇALAMA (HOMOJENİZASYON) YÖNTEMLERİ: Çalışılacak molekül grubunu içeren doku veya hücrelerin çeper ve zar yapılarını parçalama işlemi Fiziksel yöntemler Mekanik işlemler Ultrasonikasyon Ozmotik şok Dondurma-çözme Kimyasal yöntemler Çözücülerin kullanılması Enzimlerin kullanılması

ALETLİ HOMOJENİZASYON FİZİKSEL YÖNTEMLER Mekanik İşlemler: ALETLİ HOMOJENİZASYON

Mekanik İşlemler: OZMOTİK ŞOK Hücrelerin yüksek ozmotik basınçlı (hipertonik) bir çözeltiden (ör. %20’lik sukroz) düşük ozmotik basınçlı (hipotonik) bir çözeltiye (ör. suya) alınmasıyla suyun hücreleri patlatılması. Hücre duvarı (çeperi) bulunmayan ya da yok edilmiş hücrelere uygun bir yöntem.

Soğuk-Sıcak-Soğuk-Sıcak..... Mekanik İşlemler: DONDURMA-ÇÖZME Soğuk-Sıcak-Soğuk-Sıcak.....

Çözücülerin Kullanılması KİMYASAL YÖNTEMLER Çözücülerin Kullanılması Organik çözücüler Deterjanlar, Bazik çözeltilerle...

Enzimlerin Kullanılması Zimoliyaz gibi enzimlerle... Kimyasal İşlemler: Enzimlerin Kullanılması Lizozim, Tripsin, Proteinaz K, Zimoliyaz gibi enzimlerle...

Çeşitli materyallere uygulanabilecek bazı parçalama yöntemleri Teknik Materyal tipi Nazik Ozmotik şok Eritrositler Enzim uygulaması Bakteriler, mayalar Deterjan uygulaması Doku kültürü hücreleri Havan veya pistonlu homojenizatör Karaciğer vb yumuşak dokular Diğer aletlerle parçalama Kas vb. Dokular Orta şiddette Milli homojenizatörle par. Hayvansal ve bitkisel dokular Kum, alumina vb. ile ezme Bitkisel dokular, bakteriler Sert Fransız basınç hücresi Bitkisel dokular, bakteriler Ultrasonikasyon Hücre süspansiyonları Balistik parçalama Hücre süspansiyonları

Parçalama (homojenizasyon) yöntemleri uygulanarak doku veya hücrelerin çeper ve zar yapıları yok edilir. Ele geçen ve çalışılacak molekül grubunu içeren karışıma HOMOJENAT denir.

Parçalamanın etkinliğini ölçmek için çeşitli analitik yöntemlere başvurulur.

AYIRMA VE SAFLAŞTIRMA Üzerinde çalışılacak molekül grubunu homojenattaki diğer moleküllerden ayırmak ve saf şekilde elde etmek Preparatif veya Analitik amaçlı yapılabilir.

SÜZME (FİLTRASYON)

VAKUMLU FİLTRASYON

Moleküler biyolojide en çok kullanılan filtre edici materyaller: Müslin (tülbent veya gazlı bez) Filtre kağıdı (bkz. MBKY kitabı Ek 15, s. 324) Sinterli cam huni Membran filtreler (bkz. MBKY kitabı Ek 16, s. 324)

Membran filtreler veya ”membranlar” özgül por çaplarına sahip polimer filmlerden oluşur. Porlardan geçemeyecek büyüklükteki partiküller ve mikroorganizmalar için fiziksel bir bariyer oluşturur ve bunları zarın yüzeyinde tutarlar.

MEMBRANLI FİLTRASYON

ULTRAFİLTRASYON Moleküllerin boyut, biçim ve/veya yüklerine göre ayrılmasını sağlar.

Centricon tipi ultrafiltrasyon tüpü (vakumdan yararlanılır) Kapan hücresi (basınçtan yararlanılır)

NMWC Nominal Molecular Weight Cut-off Membrana özgü bir değerdir NMWC Nominal Molecular Weight Cut-off Membrana özgü bir değerdir. Membrandan geçemeyen bir molekülün ağırlığına eş değerdir.

DİYALİZ

LİYOFİLİZASYON

SANTRİFÜJLEME Santrifüj kullanılarak yüksek hızda döndürülen moleküllerin, oluşan merkezkaç kuvvetinin etkisiyle farklı şekilde çökmesini sağlayan teknik

Değişik tipte rotorlar Açılan kova tipinde rotor Sabit açılı rotor Dik tipte rotor

Santrifüjleme sonunda Üst faz (sıvı faz) “süpernatant” Alt faz (çökelti) “pellet”

“Santrifüj kuvveti” F = m x 2 x r m = çöken partikülün kütlesi  = açısal hız r = partikülün dönüm eksenine uzaklığı

“Relative Centrifugal Force” Santrifüj hızı ile ilgili bir ifade (g değeri) RCF = 1.119 x 10-5 x rpm2 x r rpm = dönüm sayısı (devir/dakika) r = partikülün dönüm eksenine uzaklığı (cm)

Homojenattaki zar (membran) parçalarını, parçalanmamış doku ve hücreleri uzaklaştırmak amacıyla uygulanan ÖN AYIRMA işlemlerinden sonra ele geçen sıvıya HAM ÖZÜT (CRUDE EXTRACT) adı verilir.