Sunum yükleniyor. Lütfen bekleyiniz

Sunum yükleniyor. Lütfen bekleyiniz

SEROLOJİK TANI YÖNTEMLERİ Yrd. Doç. Dr. İbrahim Halil KILIÇ.

Benzer bir sunumlar


... konulu sunumlar: "SEROLOJİK TANI YÖNTEMLERİ Yrd. Doç. Dr. İbrahim Halil KILIÇ."— Sunum transkripti:

1 SEROLOJİK TANI YÖNTEMLERİ Yrd. Doç. Dr. İbrahim Halil KILIÇ

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11 AGLUTİNASYON VE HEMAGLÜTİNASYON TESTLERİ

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26 PRESİPİTASYON İLE PRESİPİTASYON İLE SEROLOJİK YÖNTEMLER

27 PRESİPİTASYON… Suda erimiş durumda bulunan antijenlerin, elektrolitli ortamda kendilerine özgü immünoglobülinler (antikorlar) ile birleşmeleri sonucunda önce bulanıklık sonra ince granüllü bir çökme ile sonuçlanan olaya presipitasyon denir. Presipitasyondan hem enfeksiyon hastalıklarında tanı koymak hem de mikroorganizmaların identifikasyonu amacıyla yararlanılır.

28 Presipitasyon ile serolojik tanı yöntemlerini şu gruplara ayırabiliriz: a.Halkalı presipitasyon deneyi b.Immünodifüzyon yöntemleri c.Elektro-İmmüno difüzyon tekniğine bağlı presipitasyonlar d.Türbidimetrik ve nefelometrik yöntemler

29 A) HALKALI PRESİPİTASYON DENEYİ Bir sıvıda belirli bir antikora özgül antijenin bulunup bulunmadığı veya besin maddelerinde bulunan yabancı proteinlerin, kuşkulu lekelerin insan ya da hayvan kanı olup olmadığının anlaşılmasında kullanılabilir. İnce bir tüpte uygun antijen ve antikor içeren sıvıların, birbirlerine karışmayacak ve üst üste bir tabaka oluşturacak biçimde konulmaları sonucunda, iki sıvının birleşme yerinde bulanık bir halkanın oluşması temeline dayanır.

30

31 Halkalı presipitasyon deneyine örnek verecek olursak; → Neisseria meningitidis, Haemophylus influenzae, Streptococcus pneumoniae menenjitlerinde, bu mikroorganizmalara karşı elde edilmiş bağışık tavşan serumları ile beyin omurilik sıvısının karşılaştırılması sonucunda oluşabilen presipitasyon halkasına bakarak tanı konulabilir. Halkalı presipitasyon yöntemi streptokok ve pnömokokların tiplendirilmelerinde de kullanılabilir.

32 B) İMMÜNODİFÜZYON YÖNTEMLERİ Bu yöntemler, antijen ve antikorun agaroz jel ortamında difüze olarak karşılaşması ve uygun oranlarda karşılaştıkları bölgede bulanık presipitasyon çizgileri, bandları oluşturmalarına dayanır. İmmünodifüzyon yöntemi Çift yönlü difüzyon (ouchterlony) Tek yönlü difüzyon (mancini)

33 ÇİFT YÖNLÜ DİFÜZYON (OUCHTERLONY) Jel içinde çukurlar açılır, ortadakine bilinen antiserum, kenardakilere ise antijen aranan hasta serumu dilusyonları (ya da tam tersi) damlatılır. Etüvde bir gece inkübe edilir ve presipitasyon bantları değerlendirilir. Bu yöntemde hem antijen hem de antikor molekülleri jel içinde yayılarak (özgüllük varsa) optimum konsantrasyonlarda karşılaştıkları yerde presipitasyon bandı oluştururlar. Aspergilloz, histoplasmoz, blastomikoz antijenlerinin belirlenmesinde kullanılır.

34

35 TEK YÖNLÜ DİFÜZYON (MANCİNİ) Bu yöntemde antikor jel içine eklenmiştir. Jelde açılan çukurlara araştırılacak antijeni içeren serum damlatılır. Etüvde bir gece inkübasyondan sonra presipitasyon zonları değerlendirilir. Burada sadece antijenler yayılır ve jel içinde bulunan antikor ile optimum konsantrasyonlarda karşılaştıkları yerde presipitasyon halkası oluşturur. Oluşan halkanın çapı antijen konsantrasyonu ile doğru orantılıdır.

36 Ag Ab in gel Ag Concentration Diameter 2 ouchterlony mancini

37 C) ELEKTRO- İMMÜNODİFÜZYON YÖNTEMLERİ Bu yöntemlerde antijen ve antikor moleküllerinin agaroz jeldeki hareketleri elektrik akımı kullanılarak kolaylaştırılmış ve hızlandırılmıştır. Birçok bakteriyel antijen negatif yüklüdür, buna karşın antikor molekülleri nötral özelliktedir. Dolayısıyla hafif alkalen buffer içeren agaroz içinde antijenler anoda, antikorlar ise buffer akımıyla katoda doğru göç ederler. Moleküllerin uygun oranlarda karşılaştıkları bölgelerde presipitin bantları veya arkları oluşur. Bu yöntemlerin duyarlılıkları aglütinasyon testlerine göre düşük, uygulamaları zahmetli ve pahalıdır.

38

39 Elektroimmüno difüzyon tekniğinin 2 çeşidinden bahsedilebilir: 1)Basit, tek yönlü immünodifüzyon (Laurell tekniği) : Roket elektroforezi de denilen bu yöntemde daha çok titresi bilinmeyen bir antijenin titresini, titresi bilinen aynı türdeki bir antijen ile karşılaştırarak ölçmek amaçlanır. 2)Karşıt immünoelektroforez (counter immuno electrophoresis = CIE) : Ag. ve Ak. elektrik akımı ile zıt yönlere göç eder. Ag. ve Ak. zıt yüklere sahip olduğunda kullanılır.

40 İnsan serumunda hepatit B yüzeysel antijeni, beyin-omurilik suyunda N. meningitidis, S. pneumoniae, H. influenzae, Cryptpcoccus neoformans ve B grubu streptokok antijenlerinin araştırılmasında kullanılmaktadır. Ag Ab - +

41 LAURELL TEKNİĞİ

42 D) TÜRBİDİMETRİK ve NEFELOMETRİK YÖNTEMLER Bu yöntemler, sıvı ortam içinde karşılaştırılan ve birleşerek bulanıklık oluşturan antikor- antijen komplekslerinin içinden geçen ışık şiddetine göre kantitatif olarak ölçüldüğü otomatize yöntemlerdir. 3 tiptir: → Transmissive sensörler → Scatter sensörler → Oran sensörleri

43 1- Transmissive Sensörler; bir ışık kaynağı ve ışığın şiddetine duyarlı bir sensörden oluşur. Sensör ışığı direkt olarak görecek şekildedir. İncelenecek örnek ışık kaynağı ve sensör arasına konur. Bulanıklık arttıkça sensörün çıkış sinyali monoton azalma gösterir. Bunlar yüksek bulanıklık düzeylerinde ölçüm yapmak için kullanılır, düşük bulanıklık düzeylerine duyarlılıkları azdır. 2- Scatter Sensörler; bir ışık kaynağı ve ışığın şiddetine belirli bir açıyla yerleştirilmiş fotoelektrik sensör bulunur. Fotoelektrik sensör ışık kaynağını direkt olarak görmez, örneğin içinden geçen ışın demetinden saçılan ışığı ölçer. Bulanıklık arttıkça fotoelektrik sensörün sinyal düzeyinde monoton artış gözlenir. Bu tip sensörlerin düşük bulanıklık düzeylerine duyarlılık yüksektir. 3- Oran Sensörleri: en iyi performansa sahip olan tiptir. Bir ışık kaynağı, bir transmassive ve bir de scattering sensörden oluşur. Örneğin bulanıklığına bağlı olarak artış gösteren çıkış sinyali, her iki sensörün sinyallerinin oranlanmasıyla elde edilir. Bu sistemler daha fazla elektriksel ve optik bileşen içerdiklerinden maliyeti daha fazladır.

44

45 NÖTRALİZASYON ve FLOKÜLASYON TESTİ

46 46 Nötralizasyon yöntemi Vücuda giren infeksiyöz ajanlarına karşı oluşan ve bunların infektivitesini veya infeksiyon yapma yeteneğini ortadan kaldıran antikorlar meydana gelir ki bu antikorlara nötralizasyon antikorları adı verilir ve böyle olguya nötralizasyon adı verilir. Test sadece viruslara özgü olmayıp toksin ve enzimler için de uygulanabilir. Nötralizan antikorların ortaya konmasında hücre kültürleri ve embriyolu yumurtalardan fazlaca yararlanılır. Hücrelerde CPE yapan veya embriyolu yumurtalarda ölümler oluşturan viruslar, kendine karşı oluşmuş antiviral antikorla oda ısısında dk. tutulduktan sonra, canlı sistemlere ekildiğinde hücrelerde CPE'ler ve embriyolarda ölümler görülmez (nötralizasyon pozitif) veya bu olgularda, antikorun miktarına göre değişik derecede azalmalar görülür.

47 Virüslere karşı nötralizan antikorların saptanmasında canlı hücre sistemleri kullanılır. Yöntemde antikor varlığı araştırılacak olan hasta serumu sulandırılır ve her bir sulandırım standart miktarda karıştırılarak pleyt çukurlarında hazırlanmış tek tabakalı hücre kültürlerine inoküle edilir. Serumda nötralizan antikor varlığında virüs reseptörleri bloke edeceğinden hücre kültürlerinde sitopatik etki (CPE) ortaya çıkmaz.

48

49 49 Aşağıdaki örnekte CPE oluşumu 4 nolu çukurda tamamen önlenmişken 5 nolu çukurda CPE pozitifliği %50 dir. CPE nin önlendiği en yüksek hasta serumu sulandırımı, o serumun titresini verir.

50 Deney yapılmadan önce virüsü titre etmek gerekir. %50 son noktalar Reed Muench metoduna göre hesaplanır. İnokulasyon yapılan hayvan veya yumurta veya doku kültürünün %50sini infekte eden virüs miktarı ID 50 Hayvanların %50sini öldüren virüs miktarı LD 50, Hayvanların %50 sinde paralizi meydana getiren virüs miktarı PD 50, Ekim yapılan doku kültürlerinin %50 sinde CPE oluşturan virüs miktarı ise TCID 50 ile gösterilir.

51 LD50 titresinin = %50 ölüm oranının üstündeki ilk + Nisbi uzaklık negatif logaritması sulandırımın neg logaritması Örneğin kuduz virüsünün LD 50 titresini hesaplamaya çalışırsak; Hesaplamada Reed ve Muench yöntemi kullanılır. Bu amaçla virüslerin 10- 1, 10- 2, şeklinde sulandırımları yapılır. H er dilüsyondan 10 fareye beyin içi yolla 0,03 ml virüs inoküle edilir ve 14 gün süreyle gözlenir. İlk 3 gün içerisinde ölenler nonspesifik ölümlerdir. 4. günden itibaren ölen ve paralizi olan fareler not edilir. 14 günün sonunda bir cetvel hazırlanır ve burada her dilüsyon için toplam ölü ve canlı kalanlar hesaplanarak yüzde oranlı (%) kaydedilir.

52 Toplam ölümler hesaplanırken ölü sayıları aşağıdan yukarıya, canlı sayıları yukarıdan aşağıya toplanır. Burada izlenen yol: 10- 5, sulandırımda ölen 10- 4, te de nasıl olsa ölür, de canlı kalan te de nasıl olsa canlı kalır düşüncesidir. Bunlar kaydedildikten sonra aşağıdaki formüle göre LD 50 hesaplanır. LD 50 = %50nin üstündeki ölüm /%50nin üstündeki ölüm-%50nin altındaki ölüm Bulunan sayı % 50'nin hemen üzerinde ölüm gösteren virüs süspansiyonunun sulandırım oranına eklenir. Bu durumda % 50' nin üzerinde ölüm olan virüs sulandırımı 10-3 olduğu için,10(-3)+(-0,5) = 10-3,5. Yani bu durumda LD 50 = 10-3,5 dir.

53 LD 50 nin hesaplanması Virüs sulandır ımı İnoküle edilen hayvan ÖlüCanlıToplam Ölü Toplam Canlı Toplam Oranı % oranı / / / / /215

54 Deney hayvanlarında nötralizasyon testi Deney hayvanı olarak genellikle fareler kullanılır. Örneğin bir kuduz aşısı ile aşılanmış şahıslarda oluşan nötralizan antikorların araştırılması için farelerde yapılan nötralizasyon testine kısaca değinecek olursak, aşılı kimselerden alınan serum steril tuzlu su ile ¼ oranında sulandırılır. Üzerine daha önce %50 ölüm dozu tespit edilmiş sabit virüsün 200 LD 50 dozunu bulunduran virüs sulandırımından aynı miktar ilave edilerek karışım bir saat 37˚C de inkübe edilir.

55 Her serum -virüs karışımı ortalama 12 gr ağırlığındaki 4-5 haftalık 10 fareye beyin içi yolla 0,03ml olarak inoküle edilir. İnokülasyon esnasında farelerin bayıltılması gerekir. Farelerin gözlemi 4. günden itibaren başlar ve hergün düzenli olarak kaydedilir. İkinci hafta sonunda elde edilen bulgulara göre serumlarda bulunan antikor tespit edilir. Ters kantitatif olarakta yapılabilir. Burada 8-10 farenin canlı kalması serumda antikor bulunduğunu gösterir.

56 Doku kültürlerinde nötralizasyon testi Nötralizasyon testi bugün daha ziyade doku kültürlerinde yapılmaktadır. Buradaki prensip spesifik virüs antikorlarının virüsün yapacağı CPE yi nötralize etmesidir. Testte çift serum ile çalışılır ve üzerlerine eşit miktarda virüs sulandırımı ilave edilip oda ısısında 1 saat bırakılır. Sonra bu serum-virüs karışımlarının her bir dilüsyonundan 2-4 kültür tüpüne 0.1 er ml inoküle edilir. İnokülasyon yapılan tüpler etüve konur ve hergün kontrol edilerek CPE meydana gelip gelmediği araştırılır. Her deneyde negatif ve pozitif kontrol serumları ile doku kültürü kontrolleride kullanılmalıdır. Negatif serum-virüs karışımı inoküle edilen tüpte CPE nin görülmesiyle test sona ermiş olur. CPE nin görülmediği en yüksek serum sulandırımı nötralizasyon titresi olarak kabul edilir.

57

58

59 Embriyonlu yumurtada nötralizasyon deneyleri: Embriyonlu yumurtada nötralizasyon deneyi influenza, kabakulak, çiçek ve herpervirüsleri ile yapılır. İnfluenza ve kabakulak virüsü ile yapılan nötralizasyon testi allantoik keseye inokülasyonla yapılır ve hemaglütinasyon testi ile kontrol edilir. Çiçek ve herpes virüsleri ile nötralizasyon testi koryoallantoik zara inokülasyonla ve kontroluda burada oluşan poksların sayımıyla yapılır.

60

61 Metabolik inhibisyon testi Bu testde bir cins nötralizasyon testidir. Bu teste de virüs-serum karışımı oda ısısında 1 saat tutulduktan sonra genellikle mikrotitrasyon plağında bilinen miktardaki hücre süspansiyonlarına ilave edilir. Eğer virüs serum tarafından nötralize edilmişse bu godelerdeki hücreler kontrol godelerdeki gibi üremelerine devam edeceklerdir ve meydana gelen metabolizma ürünleri ortamı asit yapacağından besiyerinin rengi değişecektir. Besiyerinde indikatör olarak fenol kırmızısı bulunduğundan,bu indikatör asit ortamda sarı renk alır ve besiyeri sarı renkte görülür.

62 Virüs, serum tarafından nötralize edilmemişse hücrelerde nekroz yapacağından hücreler ölür, metabolizma ürünleri oluşmaz ve ortam değişmeyeceğinden besiyeri kırmızı renkte kalır (pH da fenol kırmızısı kırmızı renktedir). Bu sebeple mikroskopla muayeneye gerek kalmadan plaktaki renklere bakılarak karar verilir.

63 FLOKULASYON Kahn testi, sifiliz hastalığının aranmasın­da kullanılan wasserman ve VDRL (Venergl Diseases Research Laboratories test) gibi bir laboratuvar testidir. İlk defa Reuben Leon Kahn tarafından kullanılan en önemli flokulasyon testlerinden biridir. Bu testlerde hasta olup olmadığı araştırılacak olan kimsenin kan serumu, sifilize göre özel şekilde hazırlanmış organ ekstreleri ile karıştırılmakta ve flokulasyon yani bir çeşit çökelti meydana gelip gelmediği araştırılmaktadır. Kahn testinde bu esasa göre hazırlanmış Kahn antijeni kullanılır. Kahn antijeni ile karıştırılan hasta serumunda dakika sonra yumak şeklinde bir çökelme yani flokulasyon meydana gelirse sifiliz hastalığı var demektir.

64

65

66 İŞARETLİ KATI FAZ YÖNTEMLERİ ELİSA

67 İŞARETLİ KATI FAZ YÖNTEMLERİ Tek bir serum örneğinde istenilen antikor tipinin (IgG, IgM, IgA, total) veya hasta örneğinde bulunan antijenlerin kısa zamanda saptanmasını sağlar.

68 Antijen veya antikor katı ortamda hareketsiz Üzerine serum/örnek eklenir İşaretli konjugat (antikor) bağlanması – Enzim  ELISA – Radyoaktif madde  RIA (Radioimmuno assay) – Floresanlı boya  IFA (İmmünofloresans yöntemi) – Biolüminesan madde  Kemilüminesans Birleşmenin ölçümü

69 Mekanizma: reaktiflerden birisinin (antijen veya antikor) katı bir faza bağlanarak hareketsizleştirilmesi ve daha sonra özgül birleşmenin işaretli bir reaktif kullanılarak gösterilmesidir. İşaretli reaktifler genellikle insan Ig’lerine karşı hayvanda hazırlanmış ve işaretlenmiş anti- insan IgG, IgM molekülleri ya da araştırılacak olan antijene özgül işaretli antikor molekülleridir.

70 Katı Faz Ag Katı faza bağlı ag Hasta serumunda IgG İşaretli Anti-insan IgG Katı Faz Ag Katı faza bağlı ak Klinik örnekte ag İşaretli özgül IgG Klinik Örnekte Antijen Tespiti Hasta Serumunda Antikor Tespiti

71 ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Ag-Ak reaksiyon sonucu katı faza bağlanan enzim işaretli reaktiflerden yararlanılır. Değerlendirmeler; enzim ile substratının oluşturacakları renk reaksiyonuna göre yapilir. Beliren renkli reaksiyon ürünlerinin miktarı enzim işaretli reaktiflerin ve dolayısıyla katı faza bağlanan Ag ve Ak’un miktarını belirler EIA (enzyme immunoassay)

72 Avantajları Geniş enfeksiyon tanı parametreleri ticari olarak kolayca temin edilebilir, Yöntem otomasyona uyarlanabilir ve bu sayede çok sayıda örnek kısa sürede çalışılır, Sonuçlar kalitatif ya da kantitatif olarak değerlendirilebilir.

73 Ag.ile kaplı çukur Enzime özgül subst rat Hasta serumu Özgül bağlanma Enzim işaretli konju gat Renk değişimi

74 Spektrofotometrik değerlendirme

75 Yarışmasız (non-competitive) Yöntem Ag’e özgül antikorlar çukurlara bağlıdır. Örnek çukurlara eklenir. Ag varsa özgül olarak antikorla birleşir. İnkübasyon ve 3 kez yıkama yapılır. Ag’e özgül ve enzimle işaretli antikor eklenir. Yıkamadan sonra substrat eklenir. Durdurma solüsyonu eklenir. Reaksiyon durdurulur. Spektrofotometre – Absorbans değeri Direk / İndirek

76 Ç ukura bağlı özgül IgG

77

78 Varsa örnekteki Ag ’ nin IgG ’ ye bağlanması

79

80 İşaretli anti - IgG antikoru

81 Ag ’ e özgül işaretli IgG

82

83 Substrat ilavesi

84 Renk değişimi

85 Ç ukura bağlı özgül Ag

86

87 Varsa örnekteki IgG ’ nin Ag ’ e bağlanması

88

89 Ag ’ e özgül işaretsiz IgG

90 İşaretli anti - IgG antikoru

91

92

93 Substrat ilavesi

94 Renk değişimi

95 Yarışmalı (competitive) Yöntem Mikropleyt çukurlarına özgül antikor bağlıdır. Örnek ile aynı anda enzimle işaretli Ag eklenir. Örnekteki Ag’ler ile işaretli Ag’ler antikora bağlanmak için kompetisyona girerler. İnkübasyon ve yıkamadan sonra substrat eklenir. Meydana gelen renk değişikliği hasta örneğindeki Ag miktarı ile ters orantılıdır. Ne kadar az Ag varsa antikorla birleşen işaretli Ag miktarı o kadar fazla olacaktır. Spektrofotometre

96 IgM Yakalama (Capture) Yöntemi Özellikle etkene özgül IgM antikorlarının araştırılmasında yalancı pozitiflik ve negatiflikleri ortadan kaldırmak amacıyla uygulanır. Anti-insan IgM antikorları bağlanmış çukurlara serum eklenir ve inkübe edilir. Tüm IgM’ler yakalanır. Yıkamadan sonra çukurlara özgül Ag eklenir. Ag yakalanmış ve hareketsizleştirilmiş IgM’lerden özgül olanlara bağlanır. Yıkama yapılır ve Ag’e özgül enzimle işaretli IgG eklenir. İnkübasyon ve yıkamadan sonra substrat eklenir. Renk değişikliği IgM miktarı ile doğru orantılıdır. Spektrofotometre

97 Sonuçların değerlendirilmesi Kalitatif Sonuç Cut-off değerine göre pozitif / negatif olarak değerlendirilir Genelde Ag, bazen IgM varlığının belirlenmesinde değerlidir. IgG düzeyi ve takibinde işe yaramazlar. Semi-Kantitatif Sonuç Serum OD / cut-off OD Antikor konsantrasyonunun ölçülmesinde değersizdir, antikor düzeyinin takibinde kullanılır. Kantitatif Sonuç Konsantrasyonu bilinen “standart serum” kullanılır. Standart serum sayısı ne kadar fazlaysa ölçüm aralığı o kadar geniş olur.

98

99 Bu test, hasta serumunda etkene özgül antikor titrelerinin belirlenmesinde, özgül antijen-antikor birleşmesi sonucu komplemanın aktive edilmesi esasına dayanan klasik bir yöntemdir. Öncelikle hasta serumları 56°C’de 30 dk tutularak insan komplemanı ortadan kaldırılır. Daha sonra hasta serumlarının seri sulandırımları hazırlanarak üzerine önce bilinen antijen ve sonra da kompleman (1 günlük erkek kobay serumu) eklenir.

100 Bir gece 4°C’de bekletilir. Bu sürede hasta serumunda özgül antikor varsa ve kompleks komplemanı bağlayacaktır. Ertesi gün tüm çukurlara indikatör olarak hazır antijen antikor kompleksi yani hemolitik sistem eklenir. Hasta serumunda özgül antikor varlığında kompleman fikse edilmiş olduğundan hemolitik sistem üzerine bir etkide bulunmaz, buna karşın özgül antikor yoksa kompleman serbest olduğundan hemolitik sisteme etki ederek eritrositleri parçalar.

101 Antikor (sıklıkla) ve antijen saptayabilen yarı kantitatif bir yöntemdir Test birbirinden farklı üç komponent içerir  Test sistemi  Hasta serumu (inaktif/aranan Ab)  Antijen (bilinen)  KOMPLEMAN(kobay veya tavşan serum)  İndikatör sistemi (hemolitik sistem)  Koyun eritrositleri  Koyun eritrositlerine karşı Ab

102

103

104

105

106

107

108 DEĞERLENDİRME; Hasta serumunda Ab varsa  Ag ve Ab birleşecek (klasik yol)  C, Ag ve Ab’ye bağlanacak  Ortamda C kalmayacağı için  Hemolitik sisteme bağlanamayacak  Hemoliz olmayacak  Bazı viral, riketsiyal ve fungal hastalıkların tanısında  1990’lı yıllarda Sifiliz için KOLMER Kompleman komponentlerindeki düzey ölçümüyle; AMAÇLANAN;  SLE benzeri klinik tabloların tanısında  C2 yetersizliği yardımcı olur  Yineleyen bakteri enfeksiyonlarının tanısında  C3 yetersizliği yardımcı olur  Radyal immun difüzyon  RIA

109 Antijen + Kompleman Kompleman antijene bağlanmaz. Kompleman + Antikor Kompleman antikora bağlanmaz. Antijen + Uygun antikor + Kompleman Kompleman birbirlerine bağlanmış olan uygun antijen antikor bileşiğine bağlanır.

110

111

112

113

114 1. ve 2. sıra akut ve iyileşme dönemindeki hastalardan alınan serum örnekleri (2 kat serum dilüsyonu yapılmıştır.) Serum dilüsyonu

115 Hastalık Tanısı Amacı ile Kompleman Birleşmesi Deneyleri İstenilen antijene karşı, hasta serumunda antikor araştırılarak hastalık tanısı konur. En çok kullanılan yöntemler Kolmer tekniği ve Wasserman tekniğidir.

116 Kompleman Birleşmesi Deneyinde Genel İlkeler 1. Kullanılmakta olan antijenlere göre deneyler makro ve mikro yöntemlerle uygulanmaktadır. Viral antijenler çok pahalı ve elde edilmeleri güç olduğundan özellikle bunlarda mikro yöntemlerle çalışılır. Makro yöntemlerde deneye konulan tüm ayıraç ve maddeler için 0.1, 0.2, 0.25, 0.5ml gibi birim hacimler ve daha çok 0.25ml hacimler kullanılır. Mikro yöntemlerde ise 0.025, 0.050ml ve daha çok 0.025ml hacimler kullanılır.

117 2. Makro ve mikro yöntem kullanılacağına göre deney 10 x 75 mm, 12 x 75 mm boyutlarındaki tüplerde, büyük çukurlu ya da mikro titrasyon apareyinin U çukurlu plastik tablalarında yürütülür.

118 3. Hasta serumları: Hastalardan aç karnına alınan serumların, berrak, hemolizsiz olmaları ve bakterilerle kontamine olmamaları gerekir. Serumların deney gününde 56 0 C’de 30dk da tutularak inaktive edilmeleri ve soğukta bekletilmeleri gerekir. Deney gününde tekrar 10dk inaktive edilmeleri gereklidir. Serumlar kullanılacak yönteme göre fizyolojik tuzlu su ya da gerekli sulandırıcılarla sulandırılır.

119 4. Kompleman taze kobay serumu da olsa stoklanmış ya da ticaretten elde edilen liyofilize kompleman da olsa kullanım anına kadar soğukta (+4 0 C’de) tutulmalıdır. Çalışma buz parçaları bulunan bir kap içerisinde yapılmalıdır. Deney gününde kompleman mutlaka titre edilmeli ve titresine uygun olarak kullanılmalıdır.

120 5. Antijen en az bir kez, pozitif seruma karşı titre edilmeli ve ona göre kullanılmalıdır. 6. Hemolitik sistem tirajının da deney gününde yapılması ve ona uygun titrajlarda kullanılması gereklidir. Hemoilitik serumlar tavşanların koyun eritrositleri ile bağışıklanmaları suretiyle üretilebilir.

121 Koyun Eritrositlerinin Hazırlanması 1. Koyun kanı hayvanın vena jugularisinden (Kafadan kalbe kan taşıyan, kafanın iki yanında bulunan büyük toplardamar) içinde (%10) sodyum sitrat eriyiğinden, alınacak kan hacminin 1/10’u kadar bulunan ya da içerisinde boncuk olan bir şişeye alınır. Kan ile sitrat eriyiği karışıncaya kadar, boncuklu şişede kan defibrine oluncaya kadar çevirme hareketleri ile karıştırılarak pıhtılaşması önlenir.

122 2. Koyun eritrositlerinin yıkanması: Taze defibirine ya da stoklanmış kandan bir miktar alınır. Arada bulunabilecek olan pıhtıların ayrılması için steril çift katlı gazlı bezden süzülür. Süzüntü, steril, sivri dipli ve bölüntülü santrifüj tüplerine konur. Üzerine steril fizyolojik tuzlu su konur. Alt üst edilerek karıştırılır. Santrifüjde 300 rpm’de 10dk santrifüjlenir.

123 3. Tüpleri horizontal çeviren santrifüj kullanılmalıdır. Üstteki sıvı atılır. Yeniden tuzlu su konulup karıştırıldıktan sonra yine çevrilir ve bu işlem üç kez tekrarlanır. Sonuncu kez üstteki sıvı berrak olmalıdır.

124 3. Fizyolojik su ile süspansiyonu yapılır. 4. Koyun eritrositleri stoklanabilir. Kompleman birleşmesi deneyinde kullanılacak koyun eritrositleri kullanım gününden 5 gün önce alınmış ve buzdolabında saklanmış olmaları daha uygun sonuçlar vermelerine neden olur.

125 Kompleman En standart ve iyi etkili kompleman, kobay serumlarında bulunduğundan KBD. de kompleman olarak bu hayvanların taze serumu kullanılır.

126 Kompleman 1.Kompleman deney hayvanlarından çalışma gününde taze olarak elde edilebileceği gibi stok ya da ticaretten elde edilen liyofilize kompleman da kullanılabilir. 2.Kompleman çalışma anına kadar buz üzerinde soğukta beklenir. 3.Koyun eritrositlerine hemolitik etki gösteren kobay serumları bir gece +4 ile +10 derecelerde bekletilir.

127 Komplemanın Stoklanması 1.Dondurularak saklanan kobay serumları bir hafta etkinliğini kaybetmeden stoklanabilir. 2.Rhamy – Sonnerschein yöntemi ile sodyum asetat, borik asit ile karıştırılarak 3-5 hafta saklanabilir. 3.Sodyum klorür ile saklama 10ml kobay serumuna 1g saf NACI eklenerek 3-4 hafta sakalanır. 4.Liyofilizasyon (dondurarak kurutma) ile uzun süre saklanabilir.

128 Kompleman Birleşmesi Deneylerinde Gerekli Şeyler 1.Hasta serumu 2.Koyun eritrositleri süspansiyonu 3.Serum hemolitik (hemolizin) 4.Kompleman 5.Antijen 6.Sulandırıcı sıvı 7.Serolojik tüpler, pipetler

129 Serum hemolitiğin sulandırılması ve titrasyonu 14 adet serolojik tüp alınır. Ayrı bir tüpe 9.9 ml sulandırıcı ve 0.1 ml hemolitik serum karıştırılarak 1:100’lük sulandırım elde edilir. Dizideki 1 ve 2.ci tüplere 0.5’er ml diğer tüplere sırasıyla 0.5, 0.7, 0.9, 1.1, 1.3, 1.5, 1.7, 1.9, 2.3, 2.9, 0.5, 0.5 ml sulandırıcı eklenir. Birinci tüpe 1:100’lük hemolitik serum sulandırımından 0.5 ml konur, karıştırılır bunlardan ikinci tüpe aktarılır, karıştırılır ve pipet atılır. Burada H. serum 1:200 ve 1:400 sulanmıştır.

130 Serum hemolitiğin sulandırılması ve titrasyonu Üçüncü tüpten 12.ci tüpe kadar tüm tüplere ayrı pipetlerle 0.1’er ml 1:100 sulanmış H. Serum konur ve her pipet ait olduğu tüp içine bırakılır.buraya kadar serum hemolitik 3.cü tüpte 1:600 ve sırasıyla 1:800, 1:1000, 1:1200, 1:1600, 1:1800, 1:2000, 1:2400, 1:3000 oranlarında sulandırılmıştır. 13.cü tüpe, 1:2000’lik sulandırımdan 0.5 ml eklenerek 1:4000’lik ve 14.cü tüpe 1:3000’lik sulandırımdan 0.5ml aktarılarak 1:6000’lüik sulandırım elde edilir.

131 Standart yöntemde hemolitik serumun titrasyonu deneyi Serum hemolitiğin her sulandırımından 0.25 ml ayrı tüplere konur. Bir saat 37 0 C’lik su banyosunda bekletilir.

132 Sonuçların okunması ve değerlendirilmesi Kontrol tüplerinde; 16. tüpte kompleman konulmadığından hemoliz olmaz. 15. tüp kompleman kontrolü hemolitik serum olmadığından hemoliz yok. 17. tüp pozitif hemolitik serum kontrolü Titrasyon tüpleri; tam erime gösteren en dilüe serumdaki serum hemolitik sulandırımına bir minimal hemolitik doz (MHD) ya da bir hemolitik ünite adı verilir. Esas deneyde 3 MHD

133 Kolmer Yöntemi Kolmer yöntemi ile standart kompleman yöntemin uygulamaları aynıdır. Bazı farklar ise şunlardır; 1.Sulandırıcı olarak tuzlu su yerine 0.1 mg magnezyum sülfat içeren tuzlu su kullanılır. 2.Komplemanın 1:10 sulandırımından 1 birim hacim (o.25 ml) kullanılırken kolmerde 1:30 sulandırımda 2 birim hacim (0.50 ml) kullanılır.

134 3. Koyun eritrositlerinin %3’lük süspansiyonu kullanılmaktadır. 4. Birinci evreden sonra orijinal kolmer yönteminde; hasta serumları + antijen + kompleman karışımları bir gece (15-18 saat) buzdolabında sonra 10dk oda sıcaklığında bekletilir. 5. Değerlendirme ve diğer uygulamalar temelde aynıdır.

135

136


"SEROLOJİK TANI YÖNTEMLERİ Yrd. Doç. Dr. İbrahim Halil KILIÇ." indir ppt

Benzer bir sunumlar


Google Reklamları