Sunum yükleniyor. Lütfen bekleyiniz

Sunum yükleniyor. Lütfen bekleyiniz

GEN MÜHENDİSLİĞİ PRENSİPLERİ GENOM ANALİZLERİ VE GENOMİK.

Benzer bir sunumlar


... konulu sunumlar: "GEN MÜHENDİSLİĞİ PRENSİPLERİ GENOM ANALİZLERİ VE GENOMİK."— Sunum transkripti:

1 GEN MÜHENDİSLİĞİ PRENSİPLERİ GENOM ANALİZLERİ VE GENOMİK

2 GEN: Bir kalıtım birimi. Bir kromozomun belirli. bir kısmını oluşturan nükleotit dizisi GENOM: Bir organizmanın kalıtım materyalinde bulunan genetik şifrelerin tamamını simgeler. Canlıların en temel birimi olan hücrede fizikokimyasal özelliklerin ortaya çıkarılmasında kullanılan genetik talimatların hepsine de genom denilebilir. Her canlının hücrelerinin içine yerleştirilmiş genetik program, o canlının "genom"unu oluşturur

3 İnsan genomu insan genomu İnsan genomu 3200Mb İntergenik DNA 2000Mb Dizilerle ilgili genler 1200Mb Dağılmış tekrarlar 140Mb Diğer intergenik bölgeler 600Mb Mikrosatelitler 90Mb Diğerleri 510 Mb LİNEs 640 Mb SİNEs 420 Mb DNA transpozonlar 90 Mb LTR elementleri 250 Mb

4 20.Yüzyıl Mendel ve bezelyeler ile basladı. Arabidopsis genom projesinin tamamlanması ile sona erdi. 21. yüzyılda hangi çalısmalar genetik bilimi için önem tasıyacak?

5 Birim Tanım Çalışma alanı Gen Genom Genomik mRNA Transkriptom Transkriptomik Protein/Enzim Proteom Proteomik Metabolit /Fenotip Metabolom /Fenom Metabolomik

6

7 Genomik Genomik: Genomların yapısı, içerigi, islevi ve evolüsyonunu kapsayan çalısmalar. İslevsel genomik: Gen ürünlerinin “large-scale” tanımı. Yapısal genomik: Yapısal motiflerin ve tüm yapısının ve bunlarla islev arasındaki iliskinin “high-throughput” tanısı. Karsılastırmalı genomik: Dizi benzerligi ve gen sırasını (sinteni)kullanarak gen islevi ve filogeninin arastırılması. Proteomik: proteom çalışmaları, bir hücrede yapılan tüm proteinler, protein-protein ilişkileri ve protein-küçük molekül iliskileri. Transkriptomik: trankriptom çalışmaları, bir hücre tarafından yapılan tüm RNA molekülleri Metabolomik: genom dizi analiz bilgisini kullanarak bir hücrenin, dokunu veya organizmanın küçük molekülleri sentez edebilme

8 Biyoinformatik: Biyolojinin in silico islemlerle DNA, RNA ve protein dizi verilerini arastıran dalı. Annotasyon: yapısal ve islevsel bilginin islenmemis genomik dizi bilgisinden türetilmesi.

9 Genomik biliminde en sık kullanılan yöntem dizileme “Sequencing” olup,1990’lı yıllarda pek çok organizmanın genom projelerinin baslatılmasıyla genomik biliminin bölümleri olusmustur. lk kez 1972’te Fiers ve ark. tarafından MS2 fajının kılıf proteinini kodlayangenin dizisi belirlenmistir yılında da aynı ekip MS2-RNA fajının tümgenom dizisini tamamlamıslardır. Dizisi tamamlanan ilk DNA genomu ise -X174 fajına aittir yılındaFrederick Sanger tarafından dizi analizi tamamlanmıstır.

10 Dizileme, bir makromolekülün yapısının belirlenmesinde ilk adımdır. 2 temel dizileme yöntemi bulunmaktadır. Maxam-Gilbert Zincir Yıkımı “Chain Cleavage” Sanger Zincir Sonlandırma “Chain Termination” Maxam-Gilbert zincir yıkımı veya kimyasal parçalanma “Chemical Degradation” yöntemi, ortamda bulunan bir zincirin, baza özgükimyasallarla parçalanmasına dayanır (Maxam ve Gilbert, 1977) Sanger zincir sonlandırma ise daha yaygın kullanılmakta olup, dizisi arastırılan DNA parçasının kalıp olarak PCR yapılmasını gerektirir (Sanger ve dig., 1977). Ortamda, kalıp DNA, radyoaktif isaretli primer, dNTP ve 4 çesit ddNTP (Dideoksinukleotid)’lerden biri ve DNA polimeraz bulunarak 4 reaksiyon gerçeklestirilir.

11 Benzer reaksiyonlar ddCTP, ddGTP ve ddTTP için gerçeklestirilir, reaksiyon ürünleri PAGE üzerinde ayrılır ve otoradyografi ile görünür hale getirilir sanger yöntemi ile DNA dizisinin belirlenmesi (Dale ve von Schantz, 2002) 5’ GATCCGATCGAATCGATCC 3 ’ S

12 ddNTP: dNTP’den farkı 3’ ucunda OH- grubu içermemesidir. Zincir sentezi5’-3’ yönde ilerlediginden, ddNTP yeni olusan zincire baglandıgında sentezdurur. Her ddNTP için 4 reaksiyon tamamlandıktan sonra ürünler poliakrilamid jel elektroforezinde birbirinden ayrılır ve otoradyografi uygulandıktan sonra dizi asagıdan yukarıya dogru okunur. Otomatik dizileme teknigi de Sanger yönteminden gelistirilmistir ancak her ddNTP farklı renkte bir boya (Florofor) ile isaretlenir. Reaksiyon ürünleri kapillerden (Poliakrilamid içeren) geçerken floresan sinyal kaydedilir ve özelbir program kullanılarak baz seklinde okunur.

13 Denatürasyon Baglanma Ürünler Otomatik DNA dizileme (Applied Biosystems, 2000)

14 Dizileme ile elde edilen bilginin anlamlı biçime dönüstürülmesinde ise çesitli programlar ve veritabanlarından “Database” yararlanılır. Veritabanı, DNA veya protein dizileme yöntemleri ile elde edilen bilginin saklandıgı depodur. Bilginin arastırıcılar tarafından kullanılması saglanır. Günümüzde en çok yararlanılan veritabanları (Creighton, 1999) Veritabanı Adresi “GenBank” EM BL-EBI “European Bionformatics Institute” DNA Data Bank of Japan Swiss Institute of Bioinformatics Proteomics expasy.hcuge.chwww.ddbj.nig.ac.jp PIR ”Protein Information Resource” www-nbrf.georgetown.edu Protein Research Foundation

15 Dizilerin karsılastırılması ve anlamlı hale çevrilmesi genomik biliminin enönemli bölümlerinden biridir. Sonuçların anlamlı hale getirilmesi ise çesitliprogramlarla saglanır. En çok kullanılan programlar: BLAST “Basic Local Alignment Search Tool” Verilen diziye benzer özellikteki dizilerin veritabanından seçilmesi (nükleik asit veya protein) “Align 2 Sequences” Verilen 2 dizinin karsılastırılması CLUSTAL 2 veya daha fazla dizinin (nükleik asit veya protein) karsılastırılması “Multiple Alignment”

16 İşlevsel Genomik Nedir? slevsel Genomik, yapısal genomik tarafından saglanan bilesenlerin ve bilginin kullanımı ile gen islevinin degerlendirilmesinde, deneysel yaklasımların (genom veya sistem boyunca) gelistirilmesini ve uygulanmasını içermektedir. Genis ölçekte uygulanan deneysel teknolojilerin, elde edilen sonuçlarla istatistiksel veya bilgisayar analizleriyle birlestirilmesiyle tanımlanabilir.

17 Klasik bir gen anlatımı arastırmasında, in vivo’da bir organizmanın gelisimiyle birlikte bir genin anlatımının nasıl degisecegi arastırılırken, modern islevsel genomik yaklasımı, organizmanın gelisimiyle birlikte ayıca 1,000’den 10,000’e kadar degisen genin anlatımının nasıl degistigini incelemektedir.

18 İşlevsel Genomik Amaç: Genomik bilgiye biyolojik bir anlam kazandırma Çesitli sistematik yaklasımlar, bir genomdaki genlerin bir çogu için sorulan basit sorulara cevaplar olusturabilirler – Gen anlatımı ne zaman gerçeklestirilir? – Gen ürününün yerlesimi nerede olur? – Bir gen hangi genlerle etkilesime girer? – Bir gende mutasyon yapılırsa hangi fenotip ile sonuçlanır?

19 Klasik dizi analizi İşlevsel Genomik’in Üç Merkezi Uygulaması: - Genome-wide knock-out - Gen Anlatımı - Genetik Haritalama Çalısmaları

20 Dizileme için Gerekli Olan Teknikler Restriksiyon Enzimleri – DNA’yı parçalara ayırmada Klonlama – DNA’yı 2-200kb’lık bazlık diziler halinde çogaltma Dizileme – Kısa DNA dizisinin okunması. – fluoresan maddeler ve jel-elektroforezi kullanılarak. Dizilerin Birlestirilmesi – parçaların bir araya getirilmesinde kullanılan bilgisayarlı asama.

21 Genom Dizilemesi - Büyük genomlar robotik ve otomasyon gerektirir. Ortak dizilerin birlestirilmesi - ideal olan, kromozom basına bir ortak dizi - standart, her bir nükleotidin 10 kez okunması - Bilgisayar kullanımı ile birlestirme Tüm genom shot-gun dizilemesi - rastgele dizilenen klonların birlestirilmesi - küçük (ör:bakteri) genomlar için uygun

22 WGS: Whole Genome Shotgun sequencing 1. Klon Kitaplıgının Olusturulması 2. Her bir Klonun iki ucunun dizilenmesi 3. Çakısan okumaların kontigler içine birlestirilmesi 4. Kontiglerin super-kontigler içine birlestirilmesi 5. Super kontiglerin genom içine dahil edilmesi 6. Genomun Tamamlanması

23 DNA Dizilenmesinde Otomasyon

24 Dizi analiz cihazı: ABI 3700

25 Kapiler elektroforez cihazı

26 DNA Dizilemesi Çogunlukla dideoksi metodu (zincir sonlandırma metodu) ile yapılır. Dizilemesi yapılacak olan DNA dizilerinin birçok kopyası asagıdaki bilesikler ile karıstırılır. – Primer DNA tek zincirine baglanan kısa dizi (~20bp) – Normal (deoksi) nükleotidler dNTP – dATP, dGTP, dCTP, dGTP – dideoksi nükleotidler ddNTP –ddATP, ddGTP, ddCTP, ddGTP – DNA polimeraz I Enzim

27 DNA Dizilemesinde Zincir Sonlandırma Metodu

28

29 Bir Klonun Okunması 2,4,6,10, 12 ve 40 kb’lik Büyüklüklerdeki parçalardan olusan kitaplıkların elde edilmesi Her bir ayrı klon, her bir kitaplıktan seçilir.

30 Dizilerin Birlestirilmesi Direkt dizi okuma teknigi, 10kb.’a kadar olan bir diziyi okuyabilir. Uzun dizi bilgisi elde edebilmek için, kısa okumaların birbirleriyle birlestirilmelerinde bilgisayara gereksinim duyulur.

31 Kontiklerin Birlestirilmesi Okumaların ucunda dizilerin üst üste çakısması belirlendiginde, iki okuma tek bir dizi seklinde birlestirilebilir

32 Superkontiklerin Olusturulması “ scaffolds” olarak da tanımlanmaktadır.

33 Büyük Genomlar İ nsan Genomu, daha büyüktür ve süperkontiklerin bir sekilde birlestirilmesi gerekir. Bu da genetik haritalama ile yapılmaktadır.

34 Birlestirmeler Sonucunda Genom Üzerinde Yerlestirme Bir dizi etiketi tüm genom boyunca tek olan kısa bir dizidir. Genetik Harita,bir çok dizi etiketini ve onların yerlesimini içermektedir. Böylelikle, etiketlere göre süper kontiklerin genom içinde sıraya dizilmeleri saglanır.

35 Primer Yürüme: Genom Dizilemesinin Sonlandırılmasında Bir Yol Eger bir baz üç okuma ile belirlendiyse kesin olarak tanımlanabilmektedir. Kesin olmayan pozisyonlar da mevcuttur. Süperkontiklerde ve süperkontikler arasında bosluklar vardır. Primer Yürüme bu bölgelerin daha ileri dizilemesinin yapılmasında kullanılabili

36 1. MALDI-TOF Mass Spektrometri ile Dizileme 2. Hibridizasyon ile Dizileme 3. Pirodizileme 4. Atomic-Force Mikroskopisi 5. Tek Molekül Fluoresans Mikroskopisi 6. Nanopor Dizileme Yeni Dizileme Metotları

37 Dizilemede yeni uygulamalar Resequencing Deep Sequencing De Novo Sequencing Transcriptome Analysis Whole Genome Analysis Gene Expression Analysis RNA Analysis Epigenetic Analysis Haplotype Profiling

38 Structural Variation Interaction of DNA Sequences Small RNA Discovery Copy Number Variation Discovery ChiP Seq Comparative Genomics Metagenomics Population Genomics Complex Disease Personal Medicin

39 Dizileme hazırlığı Tüm genom rastgele parçalara ayrılır Parçalar nötralize edilir. Adaptörler eklenir. DNA su yag karısımındaki tutucu boncuklara baglanır. Boncuklara baglı parçalarda PCR yapılır. Bir parçanın binlerce kopyasını içeren boncuklar PicoTiterPlate’te konur. Polimeraz ve luciferaz içeren enzimler eklenir.

40 Dizileme hızı ~25 milyon baz >=% 99 dogrulukta 4 saatte ~230,000 okuma Ortalama okuma uzunlugu 110 baz

41 Dizileme islemi Plate’ler dizileme aygıtına konur. Nucleotidler (A,C,G,T) plate üzerinde seri halinde yıkanır. Tamamlayıcı nukleotid girince, DNA polimeraz ile kalıp DNA uzatılır. Nucleotidlerin eklenmesi ısık saçar ve bu durum CCD kamera ile okunur. Binlerce boncuk ayni anda dizilenir

42 Yapısal genomik “Structural Genomics”, genomda bulunan tüm genlerinbelirlenmesini ve kromozomlardaki yerlerinin saptanmasını amaçladıgından;çogunlukla dizileme yönteminden yararlanır. slevsel genomik “Functional Genomics”, genom projelerinden elde edilen bilginin, genlerin fonksiyonlarının ve birbirleriyle etkilesimlerinin belirlenmesinde kullanılmasına yönelik bir bilim dalıdır. Genlerin islevlerinin fenotipi nasıl etkiledigini anlamaya çalısır.

43 İşlevsel genomik biliminde yöntemler 2 basamakta toplanır. 1- RNA düzeyinde Farklılık Gösterimi “Differential Display”, SubtraktifMelezleme “Subtractive Hybridization” EST “Expressed Sequence Tags,Microarray ve SAGE gibi yöntemler 2- Protein düzeyinde ki Boyutlu Jel Elektroforezi “Two-Dimensional Gel Electrophoresis (2-D)”, Kütle Spektrometresi “Mass spectrometry”, Protein Array gibi yöntemler Belirtilen yöntemlerle elde edilen verilerin, biyolojik açıdan anlamlı bulgularaçevirmek için ise biyoinformatik “Bioinformatics” bilimi gereklidir.

44 Geleneksel Sanger metodu yavas, pahalı, ve kesin degildir. nsan Genom Projesindeki dizileme 15 yıl almıs ve 3 trilyon dolara mal olmustur. Nanopor dizileme daha hızlı, pahalı olmayan, kesin bir yöntemdir. 100 milyon bazın dizilemesi yaklasık bir gün almaktadır, yüksek oranda kesinlik, örnek serilerinin çok zamanlı incelenmeleri sonucunda sağlanmaktadır. Günümüzde; ~25 milyon baz >=% 99 doğrulukta 4 saatte yapılabilmektedir.

45 SABRINIZ İÇİN TEŞEKKÜRLER


"GEN MÜHENDİSLİĞİ PRENSİPLERİ GENOM ANALİZLERİ VE GENOMİK." indir ppt

Benzer bir sunumlar


Google Reklamları