SUBTRAKTİF MELEZLEME.

... konulu sunumlar: "SUBTRAKTİF MELEZLEME."— Sunum transkripti:

1 SUBTRAKTİF MELEZLEME

2 Bastırma Eksiltici Melezleştirme (Subtraktif Melezleme) Nedir
Bastırma Eksiltici Melezleştirme (Subtraktif Melezleme) Nedir ?? Bastırma eksiltici melezleştirme de (subtraktif melezleme) başarıyla Vibrio türleri de dahil olmak üzere bir bakteri çeşitli gerginlik-ya da türe özel DNA dizilerini tanımlamak için kullanılmıştır

3 - Farklı anlatımı yapılan
- Farklı dağılım gösteren nükleik asitlerin (RNA/DNA) belirlenmesinde kullanılan bir yöntemdir - Farklı anlatımı yapılan - Farklı koşullarda bulunan - İki veya daha fazla kaynakta farklı olarak düzenlenen

4 Farklı hücreler, farklı populasyonlar veya hücre tipleri, farklı dokular,
hastalık ve gelişim süreçleri İlk kez Davis ve ark. tarafından 1984 yılında T-lenfositlere özgü transkriptlerin analizinde geliştirilmiştir

5 TEMEL AŞAMALAR Nükleik asit problarının hazırlanışı, Probların hibridizasyonu, Eşleşmeyen cDNA’ların klonlanması ve subtraktif kitaplık oluşturulması

6 Kitaplığın taranması için prob hazırlanması ve işaretlenmesi,
Klonların analizi Hedef koşul için ss-cDNA ya da ds-cDNA, kontrol için poly A bağlı RNA, ss-cDNA ya da ds-cDNA kullanılabilir. Genellikle hedef koşul için ss-cDNA ve kontrol için de poly A bağlı RNA kullanılır.

7 Bu yöntem uygulanırken kullanılan prosedürler hemen hemen aynıdır.
Bazı durumlarda subtraktif cDNA kitaplığı, cDNA lara adaptör moleküllerin eklenmesi ve daha sonra bir vektöre ligasyon ile gerçekleştirilir. Bir örnekte mevcut olan (=tester), fakat diğerinde olmayan transkriptler (=driver) araştırılır.

8

9

10 Örneğin; driver hastalıklı hücrelerden türevlensin, öyle ki bu tür hücrelerde anlatımı yapılmayan genlerin tanımlanması yapılacaktır. İlk aşamada her iki örnekten de mRNA’lardan cDNA kopyaları elde edilir. Driver’den elde edilen örnek biotin ile işaretlenir

11 Biotinin streptavidine ilgisi yüksek olduğundan, biotin içeren tüm moleküller kolaylıkla ayrılabilir. İkinci aşama, biotin işaretli driver cDNA ile tester cDNA moleküllerinin karıştırılması, denatüre edilmesi ve karışımdaki moleküllerin tekrar birleştirilmesini içerir. Çıkarılan tester transkriptler daha sonra bir gen kitaplığının taranmasında prob olarak kullanılabilir. Yöntemin en önemli dezavantajı göreceli olarak çok miktarlarda mRNA’ya ihtiyaç duyulmasıdır

12 Eşleşmeyen ss-cDNA’lar öncelikle ds- cDNA’ya çevrilmelidir.
ss-cDNA’lara primer bağlanması için 5’ ucuna terminal deoksitransferaz enzimiyle bilinen bir dizi eklenir. ds-cDNA eldesi ve bunların çoğaltılması için de taq DNA polimeraz kullanılır

13 Not :cDNA mRNA‘ dan elde edilir
ds-DNA’ları vektöre sokabilmek için çoğaltmada kullanılan primerler aynı zamanda enzim kesim bölgeleri içerir. Vektör olarak plazmidler ya da lambda tabanlı vektörler Not :cDNA mRNA‘ dan elde edilir

14

15

16

17 SORULAR cDNA aşamalarını yazınız ? cDNA eldesinde biyotinin kullanım amacı nedir? Subtraktif melezlemede amaç nedir?

18 Dilek Tutulmaz Esra içen Dinlediğiniz İçin Teşekkürler 