ENZİM TEKNOLOJİSİ

ENDÜSTRİYEL ENZİMLER ENZİM KULLANIM ALANI MİKROORGANİZMA α-amilaz Maltoz ve dektrinin yıkılması Bacillus subtilis Leke çıkarıcı Aspergillus oryzae Unun zenginleştirilmesi B. licheniformis Glukoz şurubu β-glucanaz β-glukanın parçalanması yoluyla A. oryzae biranın berraklaştırılması. B.subtilis Katalaz İçeceklerin buzulmasını önlemek için A. Niger Selülaz Deterjan katkı maddesi Penicillum spp. Atıkların değerlendirilmesi Glukoz izomeraz Glukoz Fruktoz Aspergillus spp. Streptomycetes spp.

Glukoz oksidaz Biyosensor A.niger Laktaz Laktoz Glukoz+Galaktoz Kluyveromyces laktis (Peynir altı suyu) laktozsus gıda üretimi Lipaz Deterjan katkı maddesi Gıda Mühendisliği ile oluşturulan Peynir Endüstrisi A. oryzae Pektinaz Meyve suyu ekstraksiyonu Erwinia spp Şarap ve meyve suyu berraklaştırılması . Proteaz Deterjan katkı maddesi B. Subtilis Deri Endüstrisi, et ekstraksiyonu Renin Peynir Endüstrisi Kluyveromyces lactis Mucor spp. Sukraz (invertaz) Şekerleme Endüstrisi Saccharomyces spp.

Mikrobiyal Enzim üretimi: Mikrobiyal yolla enzim üretiminin ilk aşaması uygun katalitik özgüllük ve istenilen fiziksel özellikleri taşıyan mikroorganizmanın seçimi ile başlar. Mikroorganizma düzeyindeki modifikasyonlar genellikle hücre başına üretilen enzim miktarının artırılmasına yöneliktir. Ayrıca kültür ortamı ve fermentasyon koşulları da enzim üretim maliyetini düşürmeye yönelik olan önemli parametrelerdendir. Suş seçiminde uygun fiziksel özellikler taşıyan enzimlerin seçimi genellikle bir organizmanın optimum üreme koşulları ile enzim özellikleri arasında pozitif korelasyonun varlığı esasına dayanır. Örneğin üreme sıcaklığı ile hücredışı proteazların stabilitesi arasında pozitif bir ilişki vardır. Hücreiçi enzimler üzerine çevresel koşulların etkisi söz konusu değildir.

Farklı mikroorganizmalar tarafından aynı reaksiyonu katalizleyen enzimlere izofonksiyonel enzimler denir. Bu izofonksiyonel enzimler farklı pH optimumları gibi değişik özellikler taşarlar. Bu farklı özelliklerden istenenler mikroorganizma seçiminde kriter olur.

İyi bir endüstriyel ırk enzimi yüksek konsantrasyonda üretmelidir. Mikroorganizma seçiminden sonra suşun endüstriyel kullanımı için çeşitli aşamaları dikkate almak gereklidir. İyi bir endüstriyel ırk enzimi yüksek konsantrasyonda üretmelidir. Kural olarak yabani tiplerin enzim üretimi ticari kullanım için yeterli değildir. Bu durum katabolit represyon nedeniyledir. Glukoz gibi karbon kaynaklarının varlığında birçok parçalayıcı enzimin sentezi baskılanır. KATABOLİT REPRESYON

Katabolit represyon besiyeri bileşimini değiştirerek ya da genetik olarak azaltılabilir. 2-deoksiglukoza dirençli Trichoderma türlerinin selülazı fazla miktarda sentezledikleri saptanmıştır. MUTASYON Karbon kaynağı azar azar verilir ve katobolit represyon kırılır. Besiyeri bileşenleri değiştirilir

Kural olarak parçalayıcı enzimlerin üretilmesi için indüktörlere gerek duyulur. İndüktörler genellikle represör proteinlerin etkisiz hale gelmesi için gereklidir. NEGATİF KONTROL Büyük ölçekte üretim için indüktör gereksinimi maliyeti artırır. SORUNUN KONSTİTÜTİF MUTANT ELDESİ İLE GİDERİLMESİ Represörün bağlanacağı regülatör bölgedeki ya da regülatör protein genindeki bir mutasyon sonucu elde edilen konstitütif mutantlarda indüktör gereksinimi ortadan kalkar.

Bazı ticari enzimler için kullanılan indüktörler Enzim Substrat İndüktör α-Amilaz Nişasta Nişasta/maltodekstrin Glukoamilaz Nişasta Maltoz/izomaltoz Invertaz Sukroz Sukroz Pullulanaz Pullulan Pullulan/maltoz Ksiloz izomeraz Ksiloz Ksilan/ksiloz

Hücreiçi enzimlere göre hücredışı enzimlerin hücre dışına salgılanması için birden fazla genin ürününe gereksinim duyulması, üzerinde durulması gereken başka bir sorundur. Çoğunlukla hücredışı enzimlerin öncülleri olan polipeptidler hücre içinde hücre zarına yakın olarak sentezlenirler. Ve daha sonra posttranslasyonel modifikasyonlarla (proteolitik kesimler, funguslarda glikolizasyon) hücredışı hale getirilirler.

Endüstriyel Enzim Üretim Metodları Koji prosesi (Solid-state fermentasyon): Klasik yöntemdir. Mikroorganizmalar katı ya da yarı katı tavalardaki besiyerlerinde üretilirler. Bu katı substratlar buğday kepeği, buğday sapı, pirinç kabuğu, arpa, suyu çıkarılmış şeker kamışı vb. dir. Çoğunlukla bu katı substratlar proteazlar, lipazlar, selülazlar ve oksidazlar gibi enzimlerin üretiminde funguslar için kullanılır. Bu tip fermentasyonda kontaminasyondan korunmak, uniform temperatür, havalandırma ve nemlendirme sağlamak zordur.

Endüstriyel Enzim Üretim Metodları Fermentör kullanımı: Modern yöntemdir. Bu fermentörlerin kullanımı yukarıda sayılan olumsuzlukları ortadan kaldırır. Mikrobiyal enzim üretiminde başlıca 4 çeşit fermentör kullanılır. Karıştırıcılı tank tipi fermentör,  bubble column,  air lift,  packed bed

Air lift fermentörler

Karıştırıcılı fermentör “packed bed” mikroorganizma

Bir enzim fermentasyonu prosesinin %50-80’i substrat harcamasıdır. Bu nedenle de mikroorganizmanın ucuz besiyerlerinde hızlı bir biçimde üremesi önemlidir. Ucuz besiyerindeki başlıca karbohidratlar; melas, arpa, mısır, buğday, hidrolize nişasta ve laktoz, azot kaynakları; soya fasulyesi, pamuk tohumu, mısır maserasyon sıvısı, hidrolize maya, gluten, jelatin, kesilmiş süttür. Ayrıca besiyerine inorganik tuzlar, iz elementler ilave edilmelidir

Mikrobiyal Enzimlerin Geniş Ölçekteki Uygulamaları Mikrobiyal enzim uygulamalarından en önemlileri tatlandırıcı endüstrisi, deterjan endüstrisi, tekstil, deri, kağıt, ilaç endüstrileri ile diğer tıbbi uygulamalardır.

Gıda Endüstrisinde Enzimler Tatlandırıcı Yapımı (nişasta işlenmesi) Nişasta (glukoz polimeri) = Amiloz (doğrusal bileşen) + Amilopektin (dallanmış bileşen) Asit (HCl) Verim: %20 ÇÜNKÜ Polimerizasyon Nötralizasyon için NaCO3 kullanımı nedeniyle tuz birikimi Asite dayanıklı ekipman kullanımı Nişasta Glukoz şurubu hidrolizi Sukrozun tatlandırıcılığının %75’i glukozdan kaynaklanır.  Oysa glukoz izomeri olan fruktozun tatlandırıcı özelliği glukozun iki katıdır.  Bu nedenle düşük kalorili gıdalarda sukrozun yarı ağırlığındaki ancak iki katı tatlandırıcı özellikteki fruktoz tercih edilir.  Glukozun fruktoza çevrilmesi alkali koşullarda ve yüksek temparatürde kimyasal olarak mümkündür. Ama bu koşullar istenmeyen yan ürünlerin oluşumuna neden olur.  Enzim kullanılarak nişastadan yüksek fruktoz şurubu eldesi ile bu problemler ortadan kalkmıştır.

Nişasta endüstrisinde ticari olarak kullanılan en önemli enzimlerden; a-amilazlar molekülün iç tarafındaki α,1-4 glikozit bağlarını, glukoamilazlar (amiloglukozidazlar) α,1-4 ve β- 1-4 glikozit bağlarını, pullulanazlar ve diğer dallanma kırıcı enzimler α,1-6 glikozit bağlarını hidrolizlerler. Nişastadan glukoz ve fruktoz şurubu eldesinde ilk aşama “liquefaction” (sıvılaştırma) dır. α -amilazlarla (Bacillus licheniformis) nişastadan maltoz, az miktarda glukoz ve esas olarak da dekstrinler oluşturulur. Bu işlem nişastanın vizkozitesini düşürür ve çözünürlüğünü artırır. Glukoamilazlar ise şekerlerin oluşumuna yol açar. Bu olay ise sakkarifikasyon (şekerlendirme) adını alır.

α,1-6 glikozit bağlarına da yavaşça etki ederek dallanmaları kırarlar. Aspergillus niger glukoamilazı nişasta ve dekstrinlerde α,1-4 glikozit bağlarına etki ederek zincir ucundan glukoz monomerlerini birer birer ayırırlar. α,1-6 glikozit bağlarına da yavaşça etki ederek dallanmaları kırarlar. Bacillus pullulonazı ise α,1-6 glikozit bağlarını hızlı bir biçimde kırarlar. Bakteriyal glukoz izomeraz ile D-glukoz çok tatlı olan D-fruktoza çevrilir. Normalde reaksiyon denge durumundadır ve glukoz ile fruktozun eşit karışımı elde edilir.

Glukoz + fruktoz = glukoz-fruktoz şurubu ya da kısaca fruktoz şurubu Fruktoz şurubu sıvı tatlandırıcı olarak sukrozun yerini almakta; marmelat, reçel, çikolata, cola gibi alkolsüz içki yapımında kullanılmaktadır. Sıvılaştırma Şekerlendirme Nişasta Hidrolize nişasta Glukoz şurubu α-amilaz Glukoamilaz Glukoz izomeraz FRUKTOZ ŞURUBU

Rekombinant Kimozin Dünya üzerinde süt endüstrisinde, peynir yapımı için yılda 100 milyon $ değerinde kimozin kullanılır. Bu geniş kullanımı nedeniyle büyük ölçekte rekombinant kimozin üretimi yoluna gidilmiş ve inek kimozini E. coli’de klonlanmıştır. Bu rekombinant kimozin Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi (FDA)’nin 1990’da insan tüketimi için onayladığı ilk genetik mühendisliği ürünü olmuştur. İnek kimozini E. coli’nin dışında daha sonra çeşitli mayalarda da klonlanmış ve Trichoderma reesei’de aktif ürün eldesi arttırılmıştır.

α -amilazlar α -amilazlar nişasta endüstrisinin yanı sıra çeşitli endüstrilerde de kullanılır. Ekmek yapımında, maya tarafından kullanılmak üzere nişastanın glukoza dönüştürülmesinde kullanılır. Biracılıkta arpa tanelerinden elde edilen maltın öğütülüp su ile karıştırılmasından sonra ilave edilen α -amilazlarla alkolik fermentasyon için mayanın kullanacağı şekerler oluşur. Tekstilde dokuma ipliklerinin kopmasının engellemek için sertleştirilmelerinde (haşıllama) kullanılan α -amilaz etkisinde bırakılan nişastanın dokuma sonunda ortadan kaldırılmasında (haşıl kaldırma) kullanılır. Kağıt endüstrisinde ise iyi kalite kağıt (pürüzsüz yüzeyli) eldesi için nişasta banyosuna sokulan kağıt üzerindeki fazla nişastanın uzaklaştırılmasında α -amilazlar kullanılır.

Deterjan Endüstrisi’nde Enzimler Deterjan endüstrisinde enzimler önemli yer tutarlar. Çamaşır deterjanlarının % 80’i ağırlıklarının % 0.015- 0.025’i kadar proteolitik enzim içerirler. Yine bulaşık deterjanlarında kullanılan -amilazlar nişastalı artıkların uzaklaştırılması için kullanılmaktadırlar.

Proteolitik bir enzim olan subtilizin Bacillus’tan elde edilir ve 65C’ın üzerindeki sıcaklıklarda bile etkindir. Bu enzimin termostabilitesini arttırmak için genetik mühendisliği çalışmaları yapılmış ve protein molekülünün 218. amino asidi olan aspartik asit, serin ile değiştirilmiştir. Yine 104. amino asit olan tirozin, fenil alanine dönüştürülerek pH 11’de aktif olan subtilizin elde edilmiştir. Deterjan endüstrisinde yağlı kirlerin uzaklaştırılması için kullanılan lipazların büyük ölçekte üretilmesi için bir mantar olan Humicola’nın alkali pH’da çalışan ancak üretimi az olan lipaz enzimini kodlayan gen, fermentörde kolaylıkla üreyen Aspergillus oryzae’ye genetik mühendisliği teknikleriyle aktarılmış ve büyük ölçekte lipaz elde edilmiştir.

İMMOBİLİZE ENZİMLER Enzimlerin çözünmeyen destek görevi gören materyaller (matriksler) yardımıyla suda çözünmeyen hale getirilmeleri immobilizasyondur. Mikrobiyal hücreler de enzimler gibi immobilize edilir. Tüm hücrelerin immobilize edilmesi saf enzimin gerekli olmadığı proseslerde kullanılan ucuz ve hızlı bir metoddur. İmmobilize hücreler atıkların kullanımında, azot fiksasyonunda, steroid sentezinde, yarı sentetik antibiyotikler ve diğer tıbbi ürünlerin eldesinde kullanılır.

Enzim immobilizasyonunda kullanılan beş temel yöntem vardır. Kovalent bağlama: Enzimler kimyasal olarak kovalent bağlarla selüloz, sefadeks, agaroz, poliakrilamid, porlu seramik gibi suda çözünmeyen taşıyıcılara bağlanırlar. Çapraz bağlama: Enzimler glutaraldehit, alifatik diaminler gibi bifonksiyonel reaktiflerle çapraz bağlanırlar. Bu reaktifler enzim molekülleri arasında bağ oluştururlar. Glutaraldehit enzim moleküllerinin amino gruplarından, diaminler ise karboksil gruplarından çapraz bağlarlar.

Çapraz bağlama

Adsorbsiyon: Enzim moleküllerinin taşıyıcıların yüzeyine adsorblanmaları esasına dayanır. Kolay bir yöntemdir. Agaroz, sefadeks türevleri, selüloz türevleri, metal tuzları ve mineraller adsorban olarak kullanılırlar. Tutuklama: Enzimler yapay ya da doğal polimer kafesleri içinde tutuklanırlar. Polimer kafesler içine substrat girer ve ürün dışarı çıkar. Çapraz bağlı poliakrilamid jeller, Ca alginat, kappa karragenan bu polimerlerin örneklerindendir. Kapsülleme: Enzimler çeşitli tipteki membranlar içine alınırlar. Bu membranlar yarı geçirgendir. Düşük molekül ağırlıklı substratı ve molekülleri geçirirler. Hegza metilen diamin mikrokapsüllemede kullanılar. Ayrıca bu yöntemlerin kombinasyonları da, tutuklama-çapraz bağlama, kapsülleme-çapraz bağlama gibi, enzim immobilizasyonunda kullanılır.

Tutuklama Kapsülleme Adsorbsiyon

İmmobilize enzim kullanmanın avantajları: Enzimler tekrar tekrar kullanılırlar. Özellikle üretimi zor ve pahalı enzimler için bu önemlidir.  Ürün enzimle kontamine olmaz, çünkü enzim matrikste tutulur.  Matriks enzimi fiziksel bir bariyer olarak koruduğundan, enzim ekstrem pH ve temparatür gibi etkilere dayanıklı hale gelir.  Sürekli fermentasyonlar için enzimi daha kullanışlı hale getirir.  İmmobilize enzimler çok daha doğru bir şekilde kontrol edilirler.  İmmobilize hücrelerle bir çok enzim de immobilize olacağından aynı anda birden fazla reaksiyon gerçekleşebilir.