ÖKARYOTİK GENOMUN YAPISI VE DÜZENİ Temel Genetik Dersi ÖKARYOTİK GENOMUN YAPISI VE DÜZENİ Prof.Dr. Selma YILMAZER Tıbbi Biyoloji AD

1944 Avery ve ark. Genetik materyal; DNA (bakteri). Nesilden nesile geçen Türün özeliklerini belirleyen 1953 Watson ve Crick DNA yapısı Çift sarmal yapıda makromolekül 1956 İnsanda kromozom sayısı; 46 1958 DNA replikasyonu

Yıl 2000 İnsan DNA dizilemesi tamamlandı!! (yaklaşık….) (3x109 bç)

1961 Genetik bilgi nükleotidler dizisi şeklinde şifrelenir (3’lü kodonlar) 1963-66 genetik şifre (64 Triplet kodon) 1970 Restriksiyon enzimleri 1972 Rekombinant DNA teknolojisi 1974 Kromatin yapısı, nukleozom (Körnberg) 1977 İntronların keşfi (Sharp ve Roberts) DNA dizi analizi yöntemleri (Sanger, Maxam ve Gilbert) 1981 Mitokondrial genom dizi analizi 1985 Polimeraz zincir reaksiyonu (Mullis ve ark) 1986 İnsan genlerinin klonlanması 1988 İnsan genom projesinin başlaması 2001 İnsan genomu taslak dizisi yayınlandı 2003 İnsan genom dizisi tamamlandı

Genom Bir organizmanın her bir hücresinde bulunan genetik bilginin tamamı İnsan genomu: 46 adet doğrusal DNA molekülü Toplam uzunluğu: ~2 metre 3 milyar baz çifti

Ökaryotik Genom Çok sayıda uzun ve doğrusal DNA molekülünden oluşur. Esas olarak nukleusta yerleşmiştir.(Nuklear genom) Ayrıca organel genomları da vardır (Mitokondrial genom, Kloroplast genomu)

İnsan genomunu oluşturan nüklear ve mitokondrial genom bileşenleri

Hücre Gen Nukleus Kromozom

DNA 2 polinukleotid zincirinden oluşan ikili sarmal yapı;20nm çapta 5 karbonlu Şeker (deoksiriboz) + Fosfat + Organik baz (Purin ;A,G veya Pirimidin;C;T Nukleotid zinciri bir şekerin hidroksil grubu diğerinin fosfat grubuna (fosfodiester köprü) bağlanarak oluşur. Zincirin bir ucunda serbest 5’ trifosfat grubu, diğer ucunda serbest 3’ hidroksil grubu bulunur Şeker + fosfat= omurgayı oluşturur. Bazlar içerde yerleşmiş A=T ,C=G

DNA nın yapı taşları

C ve T pirimidin A ve G C ve T Primidin bazları A ve G Purin bazları C=G, A=T C ve T pirimidin A ve G

DNA İki zincir bazlar arasındaki hidrojen bağları ile bağlanır; A ile T arasında 2 hidrojen bağı C ile G arasında 3 hidrojen bağı bulunur. Bazlar birbirinden 3.4 A° uzaklıkta İki zincir ters yönlü paraleldir (antiparalel) 5’-3’ 3’-5’ Tamamlayıcı zincirlerden oluşur Sağ dönümlü sarmal B formu (Orijinal form) Büyük ve küçük çukur lar içerir

DNA ikili sarmal yapısı DNA ikili sarmal yapısı. İkili sarmalin dış kısmında büyük ve küçük oluklar görülmektedir.Yapısındaki atomlar farklı renklerde gösterilmiştir.Karbon atomları: koyu mavi Nitrojen:açık mavi Hidrojen: beyaz, Oksijen:kırmızı, Fosfor:sarı

DNA En önemli özelliği ; esnek ve değişken oluşudur İki ipliğin ayrılması: DNA replikasyonu ve ekspresyonu için 2 iplik ayrılmalıdır Geçici ayrılma Kısa bölgeler halinde,kovalent bağlar bozulmadan, Tekrar hızla birleşebilir (tamamlayıcı baz eşleşmesi ile) Ayrılma = denatürasyon Yeniden birleşme = renatürasyon Z –DNA sol dönümlü Zigzag form (sınırlı parçalarda görülür) A-DNA (nadir )form, sadece dehidre durumda bulunur

DNA çift sarmal parçalarının elektron mikrofotoğraftaki görünümü DNA çift sarmal parçalarının elektron mikrofotoğraftaki görünümü. DNA parçaları küçük halkasal mitokondrial DNA moleküllerinden alınmıştır. Parçalar sadece 200 bç uzunlukta olmasına rağmen çoğu tam bir halka oluşturacak şekilde bükülmüştür

İnsan kromozomları

Prokaryotik genom ( tek ve dairesel DNA molekülü ) ve                                              Figure Plasmids are small circular DNA molecules that are found inside some prokaryotic cells. Prokaryotik genom ( tek ve dairesel DNA molekülü ) ve bazı prokaryotik hücrelerde bulunan küçük ve dairesel DNA molekülleri olan plasmidler.

Ökaryotik genom Prokaryotik genomdan daha büyük ve karmaşık Fonksiyonel genler Kodlayıcı olmayan DNA dizileri İnsan genomu – DNA ; 2m ~ 25.000 gen 3x109 bç (3 milyar baz çifti)

Prokaryotik 10 Mb den küçük Tek hücreli ökaryotlar50 Mb den küçük Bazı protozoa 200 Mb den büyük Çok hücreliler100.000 Mb ye erişebilir Bakteri 1000 gen / Mb

Eğer insan genomundaki her nukleotid çifti şekil (A) da görüldüğü gibi 1mm olarak çizilirse insan genomu 3200 km bir uzunlukta olacaktı.Bu mesafe Afrikanın ortasından baştanbaşa geçmeye yetecek bir uzunluktur ve (B) deki kırmızı çizgi ile gösterilmiştir. Ortalama bir gen uzunluğu 30m olacak kodlayıcı diziler ise sadece 1metre civarında olacaktı.

Ökaryotik genom Prokaryotik genomdan daha büyük ve daha karmaşık İnsan genomu bakteri genomuna kıyasla bin kat büyük Genom fazlalığı genellikle genetik komplekslik ile ilişkili   Kural dışı örnekler: Salamander ve zambak İnsandan 10 kat fazla DNA içerir (insandan daha kompleks olmadığı halde)

Ökaryotik genomun kompleks oluşu Kodlayıcı olmayan dizilerin çokluğu nedeni ile kompleks bir yapı. Kodlayıcı olmayan DNA dizileri 1-Genler arasında (uzun DNA dizileri) 2-Ökaryotik genlerin içinde

Gen: Fonksiyonel bir ürün; RNA veya polipeptid şifreleyen DNA parçası Gen hücresel ürünleri şifrelemekle kalmaz Ayrıca bu ürünün ne zaman, nerede ve ne kadar miktarda sentezleneceğini belirleyen kontrol bölgeleri içerir.

Kodlayıcı olmayan DNA dizileri 1-Genler arasında uzun DNA dizileri halinde 2-Ökaryotik genlerin içinde bulunur

Ökaryotik Gen Yapısı Çoğu kesintili yapıdadır yani Gen ürününü şifreleyen bilgiyi taşıyan diziler şifreleyici olmayan diziler ile kesintiye uğramıştır Şifreleyici bölgeler: ekson Şifreleyici olmayan bölgeler: intron Kontrol edici elementler (Kontrol dizileri) ( örn.Transkripsiyonun Başlangıç ve bitiş sinyali oluşturan diziler, 5’ ucunda promotör bölge,diğer düzenleyici elemanlar (güçlendiriciler;enhancer,silencer)

Bir insan kromozomu üzerindeki genlerin dağılımı

Ökaryotik Gen yapısı Kesip çıkarma

Ökaryotik genlerin transkripsiyonu ve mRNA işlenmesi Hem ekson hem de intronların transkripsiyonu sonucunda Uzun bir öncül RNA yapılır. Daha sonra intronlar kesilip çıkarılır (splicing= Kırpılma ) 5’uca şapka (cap) ve 3’uca poli A kuyruğu eklenir Olgun m-RNA oluşur.  

Kesintili gen yapısı ve olgun mRNA’nın yapılması Transkripsiyon ve translasyon arasında mRNA üç aşamada işlenir.İlk olarak intronlar kesilip atılır ve eksonlar kesintisiz dizilecek şekilde biraraya getirilir. Daha sonra 5’ ucuna özel bir nükleotid (Cap-şapka) eklenir. En son 50-200 adet adenin nükleotidinden oluşan poli(A) kuyruğu 3’ uca bağlanır.

Fare beta globin geni

İntronların Keşfi 1977 Sharp ve Roberts Adenovirusta gen ekspresyonu çalışmaları 1993 de Nobel ödülü

Kesintisiz bir gene ait mRNA ile bu geni taşıyan DNA dizisinin hibritleştirilmesi Kesintili bir gene ait mRNA ile bu gene ait DNA dizisinin hibritleştirilmesi

İntronlar Ökaryotik genlerin çoğunda eksonlardan daha çok yer kaplar Örneğin Tavuk ovalbumin geni %75 i intron Faktör VIII geni 186 kb’lık bunun 175 kb’ı intron dizileri Distrofin geni (Duchenne muskuler distrofi) 2 milyon bç’lik sadece %1’i ekson dizileri İntronlar yüksek ökaryotların genomunda eksonlardan 10 kat fazla yer kaplar Total genomik DNA nın % 25 ini oluşturur.

İntronlar Gelişmiş ökaryotik organizmaların genomunda intron içermeyen genler de vardır. Örn.Histon genleri En ilkel ökaryotik organizmaların (maya) genlerinin çoğunda intron yoktur. Prokaryotların genlerinde çok nadir bulunur.

Çeşitli organizma genomlarında kodlayıcı olmayan dizilerin karşılaştırılması

                                                                              . İnsan,maya,sirke sineği,mısır ve E.coli genomlarının karşılaştırılması

Ökaryotik gen yapısı

Tipik bir insan geni yapısı (mutasyonu hemoglobinopatilere neden olur) ( ( (mutasyonu Hemofili A ya neden olur) Dokuya özgün genler Hypoxanthine phosphoribosyltransferase (House keeping gen) Tipik bir insan geni yapısı

Ökaryotik Promotör diziler TATA kutusunun önünde verimli transkripsiyon için gerekli olan üç dizi elemanı içerir;bir CCAAT kutusu ve iki GC kutusu (konsensus dizisi GGGCGG)

İntronların işlevi İntronların çoğu hücresel bir ürünün sentezlenmesini sağlamaz. Bazıları işlevsel RNA veya proteinleri şifreler Ancak gen ifadesinin kontrol edilmesinde önemli rol oynarlar. İntronların varlığı bir genin eksonlarının farklı kombinasyonlarda birleşmesini ve böylece Aynı genden farklı proteinler sentezlenmesini sağlar. Alternatif Kesip-ekleme (kırpılma)

İntronların işlevi Evrimde önemli rol oynamış olabilecekleri düşünülüyor Farklı genlerin eksonları arasında rekombinasyonu kolaylaştırarak (ekson karma) Yeni genlerin oluşmasını sağlamış olabilir. Bazı genlerin başka birkaç genden gelen eksonların bir kimerası olduğu anlaşılmıştır. (dizileme çalışmaları ile)

Çok kez tekrarlanan genler Çok fazla ihtiyaç duyulan RNA ve proteinleri şifreleyen genler Örn. rRNA, tRNA genleri, Histon genleri Gen aileleri İşlevsel olarak ilişkili genler Farklı dokuda Gelişimin farklı evrelerinde fonksiyon görür örn. α ve β hemoglobin gen aıleleri, immunglobulin süper ailesi, MHC gen ailesi Embriyonik, fetal, erişkin dokularda ailenin farklı elemanlarının transkripsiyonu yapılır. Aynı kromozomda veya farklı kromozomlarda yerlesebilirler Psödogenler (mutasyonlarla işlevini yitirmiş genler) tahminen 20.000 adet Örn. psi Beta (globin gen ailesi içinde)

Globin gen aileleri İnsan  ve  globin gen aileleri 16 ve 11 nolu kromozomlar üzerinde yerleşmiştir. Her aile embriyonik, fötal ve yetişkin dokularda ekspresyonu yapılan genler ve işlevini yitirmiş gen kopyaları (psödogenler) içermektedir.

Tekrarlanan DNA dizileri 1-Ardarda tekrarlanan basit DNA dizileri 2-Aralara serpiştirilmiş tekrar dizileri

Tekrarlanan DNA dizileri Denatüre DNA parçaları hibritleştirildiğinde ~ %50 si çok hızlı br şekilde tamamlayıcı dizi ile birleşti. Geri kalan kısım yavaş hibriteşti. Yorum:Bazı dizilerin çoklu kopyaları olduğu için tek kopyalı olanlara göre hızlı renatüre oluyor Memeli DNA sının ~ %50 si 100.000 -1.000.000 kez tekrarlanan çoklu tekrar dizilerinden oluşur.

Basit dizi tekrarları, ardışık tekrarlar (ACAAACT) AT den zengin diziler GC den zengin dizilerden daha az yoğun CsCl yoğunluk gradyanı ile ayrılabilir Bazı tekrar dizileri Az yoğun olduğundan genomik DNA nın diğer kısmından ayrı bant oluşturur. Uydu DNA (Satellit DNA) adı verilmiş

1-Ardarda tekrarlanan DNA Dizileri Satellit DNA (2-200 bç’lik dizilerin binlerce-milyonlarca kere tekrarı) genomun %10 unu oluşturur. Sentromerik diziler=CEN (α satellit 171 bç) Kromozomların sentromer bölgelerinde bulunur Hiç bir zaman transkripsiyonu yapılmaz kromozom yapısında önem taşır Telomerik diziler Kromozom uçlarında bulunur İnsanda AGGGTT tekrarları (yüzlerce-binlerce kez tekrarlanır Kromozom uçlarına kararlılık sağlar.Birbirine birleşmekten korur.

Telomer Telomer Sentromer

Telomerler Telomeres. The sequence at the end of a human telomere. The length of the 3 extension is different in each telomere. Telomerler: İnsan Telomerlerinin ucundaki tekrarlanan diziler görülmektedir, 3’ uzantısının boyu farklılık gösterir

1-Ardarda tekrarlanan basit DNA Dizileri Minisatellit 13 bç tekrarları VNTR=değişen sayıda ardarda tekrarlar DNA parmak izi (adli tıpda önem taşır) Mikrosatellit 2-4 bç tekrarları (örn.insanda CA tekrarları) (daha da polimorfik)

Mikrosatellit analizinin genetik profilin belirlenmesi amacıyla kullanılması

Kromozom 6 nın kısa kolunda bulunan mikrosatellitler polimeraz zincirleme reaksiyonu (PCR) ile çoğaltılmıştır. PCR ürünleri floresan işaretleyiciler ile işaretlenmiş ve poliakrilamid jelde yürütülmüştür. Her sütun farklı bir kişinin genetik profilini göstermektedir.Hiç bir kişinin genetik profili bir diğerininki ile aynı olamaz çünkü her insan farklı uzunlukta mikrosatellit varyantlarıa sahiptir

2-Serpiştirilmiş tekrar dizileri İnsan genomik DNAsının % 45 ini oluşturur SINE (kısa dizi tekrarları) 100-300bç uzunluğunda serpiştirilmiş diziler 1.5 milyon kopya İnsan DNA sının % 13 ünü oluşturur. Örn. Alu dizileri (Alu I için tek kesim yeri) LINE (uzun dizi tekrarları) 6500bç uzunluğunda 850.000 kopya genomun % 21 ini oluşturur. ) Örn. (L1-L2) LI (hareketli genetik eleman) Bilinen işlevleri yoktur

Hareketli DNA elemanları Tekrarlanan dizilerin çoğu genom içinde sabit bir yerde bulunmaz.örn.LİNE ler ve SİNELER (retrotranspozon) Bunlar hareketli DNA elemanlarıdır Hem prokaryotik hem de ökaryotik organizmalarda vardır. Genomda farklı yerlere gittiği zaman mutasyonlara neden olabilir. Evolüsyonda önemli bir rolleri vardır.

2-Serpiştirilmiş tekrar dizileri 3- Retrovirus benzeri diziler Genomda ters transkripsiyon ile hareket ederler.2-10 kb uzunlukta İnsan genomunda 450.000 tane İnsan DNA sının % 8 ini oluşturur Serpiştirilmiş diziler Bazıları gen ekspresyonu düzenlenmesine katılıyor olabilir Evrimsel rol oynamış olabilirler ( genetik çeşitliliğin oluşmasına katkıda bulunarak) Çoğu bencil DNA adını alır

Genişlemiş mikrosatellitler ile hastalıkların ilişkisi Mikrosatellitler bazen transkripsiyon unitesinin içinde bulunabilir. Bazı kişiler özel bazı genlerinin içinde Mikrosatellit tekrar sayısı daha fazla olarak doğarlar Böyle genişlemiş Mikrosatellit tekrarlarının en azından 14 farklı nöromusküler hastalığa sebep olduğu bulunmuştur (Söz konusu genin fonksiyonunu veya ekspresyonunun bozar) i.e.Myotonic dystrophy, spinocerebellar ataxia

Genomun araştırılması Genomik nedir? H.influenzae Genomun araştırılması

Genomik Genomların dizilenmesi (yapısal genomik) Genom üzerindeki genlerin tanımlanması Genom fonksiyonlarının araştırılması (fonksiyonel genomik) Farklı canlı türlerine ait genomların karşılaştırılması (karşılaştırmalı genomik) Sağlıklı ve hastalıklı genlerin araştırılması İnsan mitokondri genomu

DNA dizilemesi tamamlanmış genomlar Genom bankasında dizilenmiş genomlar (Nisan 2003) 519 ökaryot 426 bakteri 1310 virus (+SARS corona virus) Model organizmalar E.coli, maya, nematod, solucan, sirke sineği, hardal bitkisi, zebra balığı, fare, insan Tür Genom Gen (Mbç) Mycoplasma 0.58 470 Rickettsia 1.11 834 Bacillus 4.2 4.100 E.Coli 4.6 4.288 Saccharomyces 13.5 6.034 Arabidopsis 119 25.498 Drosophila 165 13.601 Caenorabditus 97 18.424 Homo sapiens 3.300 30.000+ T2 faj genomu

Kullanılan YAC klonları İnsan genom projesi Kullanılan YAC klonları

Yıl 2000 İnsan DNA dizilemesi tamamlandı!! (yaklaşık….) (3x109 bç)

Çeşitli organizmaların genom dizileme çalışmaları sonuçları-I Gelişmiş ökaryotların genomunun büyük kısmı mRNA ve diğer RNA ları şifrelemez Bu kodlayıcı olmayan DNA insan genomunun %95’ini oluşturur.

Çeşitli organizmaların genom dizileme çalışmaları sonuçları-II Şifre taşımayan DNA birbirine benzeyen diziler içerir.(Tekrarlanan DNA dizileri) Tekrarlanan DNA dizilerinin tekrar sayısı aynı canlı türünün farklı bireyleri arasında bile farklılık gösterir.(DNA parmak izi)

İnsan genom projesi sonuçları İnsan genomunda ~30.000 adet gen (kurtçuk veya sinek genlerinin sadece 2 katı) İnsan genleri daha karmaşıktır. Alternatif kırpılma ile daha fazla protein ürünü yapılır. İnsan genomu içinde dışarıdan nakledilen genler vardır. (Örn. Bakterilerden) İnsanlar genetik olarak oldukça eşittir. Bireyler arasında %0.1’lik farklılık var. Kromozomların gen içeriği farklı. Örn. Kromozom 19 ve 17 gen açısından zengin Kromozom 21, 18 ve 13 gen açısından fakir Erkek DNA’sı dişi DNA’sının 2 katı mutasyon taşır.

Dizilerin yorumlanması

Kromatin Kromatin= DNA + Protein (Histon ve histon olmayan proteinler) Kromatin nukleustan izole edilip düşük yoğunluktaki tuz eriyiği üzerine yayılıp EM de incelendiğinde; 1 -10 nm lik kromatin ipliği -Kromatin ipe dizilmiş boncuk görünümünde Eriyiğin tuz yoğunluğu yükseltilirse; 2- Kromatin 30 nm çapında bir iplik oluşturur.(Solenoid)

30 nm (A) ve 10 nm lik (B) kromatin ipliklerinin Elektron mikroskobunda görünümü

Kromatin Histonlar; 1-10nm kromatin ipliği Boncuk gibi yapılar; nukleozom (histonlar+DNA) Histonlar; 1-H2A, H2B, H3, H4 (nukleozomal histonlar) 2-H1 histonlar Nukleozom; 2x (H2A,H2B,H3,H4)= 8 histon molekülünden oluşan oktamer + çevresinde dolanmış DNA (~ 2 dönüm) 2 nukleozom arasında → bağlayıcı DNA (~60bç) H1 bağlayıcı DNA ya nukleozom yakınında bağlanır

Nukleozomal histonların yapısal düzeni Nukleozomal histonların yapısal düzeni. (A) çekirdek histonlarının hepsi bir N-terminal kuyruk,ve bir histon kıvrım bölgesi içerir. (B) Histon kıvrım bölgesi 4 histonun hepsinde bulunur. (C) 2A and 2B Histonlar bir dimer yapar. H3 and H4 Histonlar da birbiri ile etkileşerek dimer yapar.

Histon oktamer.’in oluşumu

30 nm çaplı kromatin iplikleri;Solenoid Her dönümde 6 nukleozom içeren heliks yapı Histon olmayan Proteinler;(1000 çeşit) yapısal ve işlevsel proteinler (gen anlatımı,replikasyon v.b.)

30-nm kromatin ipliği yapısı..

Kromozom oluşumu

A comparison of extended interphase chromatin with the chromatin in a mitotic chromosome. (A) An electron micrograph showing an enormous tangle of chromatin spilling out of a lysed interphase nucleus. (B) A scanning electron micrograph of a mitotic chromosome: a condensed duplicated chromosome in which the two new chromosomes are still linked together (see Figure 4-22). The constricted region indicates the position of the centromere

The three DNA sequences required to produce a eucaryotic chromosome that can be replicated and then segregated at mitosis