Danışman:Prof.Dr.Mahmut Baykan Arş.Gör.Dr.Özlem Ögüç Şanlı İRANLI TÜRK RENAL TRANSPLANT ALICILARINDA RLFP-PZR İLE BK VİRÜSÜNÜN SUBTİPLENDİRİLMESİ Danışman:Prof.Dr.Mahmut Baykan Arş.Gör.Dr.Özlem Ögüç Şanlı

GİRİŞ İnsan polyama virüsü olan BKV 1971 yılında renal transplantasyondan sonra idrardan izole edilmiştir Çalışmaların büyük bir kısmında BKV antikorları erken çocukluk döneminde %60-%100 arası yüksek prevelansta saptanmıştır İlk defa belirgin semptomu olmayan erken çocukluk çağındaki BKV ile enfekte bireylerde saptanmıştır. BKV özellikle böbrek dokusu olmak üzere birçok doku ve organda bulunabilir

BULAŞ Vücut sıvıları ile geçerler,bu durum immun yetmezliği olan hastalarda BKV ile ilişkili hastalıkların yanısıra BKV’nin reaktivasyonuna da zemin hazırlar BK virus kemik iliği transplantasyonu yapılanlarda hemorajik sistit;allogreft böbrek olgularında allogreft disfonksiyonu vaskülopati,interstisyel nefrit;AIDS ve transplant hastalarında nefritik ve nefrotik sendrom,üretral stenoz,ensefalit,interstisyel pnömoni ile ilişkilidir

BK virüs genomu daha önceden tanımlanmıştır BK virüs genomu daha önceden tanımlanmıştır.BK virus genomu t-Ag,T-Ag,Agno,VP1,VP2 ve VP3 proteinlerini kodlar BKV’ ün çeşitli varyantlarını protein Vp1’ in frekans çeşitliliğine dayanılarak tespit edilmiştir

Jin ve arkadaşları BKV’ ün 1,2,3,4 olarak gruplandırılmasını sağlayan VP1 gen ürününün 61-83 protein rezidülerinde aminoasit değişikliğini bildirmişlerdir Fakat dört grubun arasındaki klinik önem tam olarak anlaşılamamıştır.Bu çalışmanın amacı İran’lı renal transplant alıcısı Türkler de RFLP yöntemiyle BKV suptiplerinin dağılım paternini belirlemektir

MATERYAL-METOD 12O idrar örneği Urmiya Üniversitesi nefroloji ve renal transplantasyon bölümünden, renal transplant alıcılarından toplanmıştır Suptipleme BKV viürisi için taranan 120 olgunun BK viral DNA açısından pozitif olan 12 idrar örneği ile gerçekleştirilmiştir

Bu çalışma Urmiya Üniversitesi Tıbbi Bilimler Etik Komitesinden onay almıştır 1 ml idrar 2 dk santrifüj edilmiştir Örnek sedimenti 1 ml PBS(Fosfat Tamponu) ile sulandırılmış ve ardından 2 dk santrifüj edilmiştir

Sediment 100 microlitre distile su ile resüspanse edilip 5 dk 95 °C de ısıtılmıştır 10 microlitre süpernatantta Taq polimeraz içeren reaksiyon karışımı(miks) eklenmiştir(miks 1. 25 u Taq polimeraz,dNTP,primer) Oligonükleotid VP1-327-1 ve VP1-327-2r, VP1 segmentinin PZR amplifikasyonu için kullanılmıştır Bu primerler sadece BKV için olup JCV de bulunmamaktadır

PZR reaksiyonu daha sonra 94 °C de 2 dk denatürasyon, 91 °C de 1 dk, 55 °C de 1 dk ve 72 °C de 1 dk olan 35 siklus ile devam edilmiş, final uzama siklusu 55 °C de 1 dk ve 72 °C de 4 dk olarak gerçekleştirilmiş Beklenen amplikon tip spesifik bölgeleri içeren 327 baz çifti uzunluğundaymış PZR ürünü %3’ lük agaroz jelde elektroforez aracılığıyla değerlendirilmiştir

PZR ürünleri 2 saat süre ile 37 °C 30 microlitre hacimde Alu-1 restriksiyon enzimi ile kesilmiş Kesilen PZR ürünleri %3 agaroz jelde ayrılmış ve ethidium bromide ile bantlar boyanmıştır Alu-1 ile kesilen subtipI ve subtip II BKV izolatlarının ürünleri 186 ve 141 baz çifti alanına ilerlerken subtip III ve subtip IV izolatları Alu-1 ile bölünememiştir

Alu-1 ile kesilemeyen ürünler Xmn-1 ile kesilmiş subtip II BKV izolatları 244 ve 83 baz çifti boyutunda 2 fragmandan oluşmuştur Oysa subtip I Xmn-1 ile kesilememiştir BKV subtip III ve Tip IV olarak belirlenen PZR ürünleri Ava 2 kesilmiş Subtip III izolatlarının ürünleri 237 ve 90 baz çiftlik boyutlardayken,subtip IV Ava 2 ile bölünememiştir

SONUÇLAR BKV DNA’sı RFLP PZR ile tiplendirilmiştir Renal transplant alıcılarında BKV tiplendirilmesinde, tüm örneklerde BKV subtip I tespit edilmiş Hastalarda subtip II,III ve IV bulunamamıştır Ayrıca mixt enfeksiyon alıcılarda tespit edilememiştir

BKV pozitif tespit edilen bazı hastalarda elde edilen restriksiyon paternleri FİG.1 de gösterilmiştir

TARTIŞMA BKV izolatları serolojik reaksiyonlar veya genotipleme metodları kullanılarak 4 tip içerisinde sınıflandırılır Daha önce insanlarda BKV ve subtiplerinin dağılımı hakkında İngiltere, Tanzanya, ABD, Japonya ve Almanya’da çalışmalar yapılmıştır

Bununla birlikte İran’da BKV subtiplerinin dağılım paterni hakkında bir bilgi bulunmamaktadır Bu çalışmada ilk kez İran’lı böbrek transplant alıcısı olan Türk’lerden elde edilen BKV subtiplerinin prevalansı gösterilmiştir

Bu çalışmada diğer çalışmalara benzer olarak subtip I baskın tip olarak bulunmuştur Yeni bir çalışmada Alman böbrek ve kemik iliği alıcılarından elde edilen 60 örnekte %90,9 oranında subtip I tespit edilmiştir

Takasaka ve arkadaşları Japon böbrek ve kemik iliği alıcılarında subtip I’i %70-80 oranıyla en sık subtip olarak izole etmişlerdir Benzer olarak Jin ve arkadaşları İngiltere’de kemik iliği tranplantasyonu yapılanlarda subtip I’i major subtip olarak rapor etmişlerdir

Bunlar subtip III’ü sadece gebe kadınlardan ve HIV ile enfekte hastalardan alınan örneklerde izole etmişlerdir Böbrek transplantasyonu yapılanlarda subtip IV düşük oranlarda tespit edilmiş, subtip II ve subtip III nadir veya hiç tespit edilememiştir

Subtip I tüm dünyada yaygındır Oysa subtip IV Doğu Asya’da (Japonya hariç) yaygındır, Afrika’da ise nadir görülür Bu çalışmada (İran’da)elde edilen verilerin diğer çalışmalarla uyumlu olduğu görülmüştür

Filogenetik incelemelere dayanarak Takasaka ve arkadaşları subtip I’in içinde 3 subgrup olduğunu(1a,1b,1c) ileri sürmüşler ve Japon hastalarda en sık subtip I’in içinde subgrup Ic’yi rapor etmişlerdir Almanya’da yapılan başka bir çalışmada sekansların çoğunun subgrup Ic’nin içinde kümelendiği görülmüştür

Günümüz insanlarında yaygın olan subtip IV’ün Asya’lıların atalarının infekte olduğu bir virüsten türemiş olduğu düşünülmektedir BKV subtip ve subgruplarının nasıl geliştiğini açıklamak için bazı çalışmalar yapılmıştır

Zhang ve arkadaşları Amerikalı, Avrupalı ve Asyalı populasyonlardan elde ettikleri virüs sekanslarını incelemişler ve tüm gruplar arasında subtip I’i en yüksek oranda bulmuşlar Fakat subtip IV’ ün değişken olduğu görülmüştür

Subtip I’in subgruplarının dağılım paterni Avrupa, Amerika ve Asya populasyonları arasında da farklılık göstermektedir Araştırıcılar subtiplerin ve subgrupların karşılaştırılmasıyla BKV’ün insan populasyonlarıyla beraber göç ettiğini ileri sürmüşlerdir

Bu çalışmada kısıtlı mali imkanlar nedeniyle filogenetik analiz yapılamadığı için subtip I’in alt gruplarının dağılım paterni incelenememiştir Bu çalışmadaki en önemli sınırlama örnek sayısının az olması nedeniyle olmuştur Bu sınırlama ve çalışmada daha az yaygın olan subtiplerin bulunamaması, mevcut bulguların genelleştirilmesine engel olmuştur

Olası diğer subtiplerin sıklığının belirlenmesi için daha geniş çapta yapılacak olan çalışmalara ihtiyaç vardır

SONUÇ Bu çalışma BKV’ün subtiplerinin dağılımı ile ilgili İranlı Türk renal transplant alıcılarında yapılan ilk çalışmadır Bu çalışmanın sonuçlarına dayanılarak BKV subtip I renal transplant alıcılarında en sık tip olarak tespit edilmiş Daha ileri çalışmalara, BKV’ün subtiplerinin epidemiyolojisinin daha iyi belirlenebilmesi için ihtiyaç vardır