PCR Temelli Genetik Analiz Yaklaşımları Hafta XII PCR Temelli Genetik Analiz Yaklaşımları EŞ ZAMANLI PCR Prof. Dr. Hilâl Özdağ
Son nokta tespitindeki eksiklikler (End point detection) Düşük hassasiyet Düşük çözünülürlük Otomasyon eksikliği Yalnızca boy belirlenebilmesi Sonuçların rakamsal olarak ifade edilmemesi EtBr ile boyamanın nicelik belirlemede etkin olmaması PCR sonrası işleme devam gereği (agaroz jel elektroforezi) www.appliedbiosystems.com
Eş zamanlı PCR Geleneksel PCR’a Karşı www.appliedbiosystems.com
Geometrik artış fazı/ Plato etkisi www.appliedbiosystems.com
Örnekler arası miktar farkının gözlendiği aşama www.appliedbiosystems.com
Eş Zamanlı PCR Sistemleri
Eş zamanlı PCR’da saptama yöntemleri Çift zincirli DNA’ya bağlanan boyalar (SYBR Green; LC Green) Hidroliz probları (Taqman probları) Hibridizasyon probları
SYBR Green
SYBR Green www.appliedbiosystems.com
Hidroliz Probları www.appliedbiosystems.com
Hidroliz Probları www.appliedbiosystems.com
Hibridizasyon Probları www.appliedbiosystems.com
Gen ifadesinin bağıl olarak ölçümü
Gen ifadesinin bağıl olarak ölçümü
Referans/Standart Gen Zorunlu İdare Genleri (Housekeeping Genes) Her dokuda hücre hayatiyetini temin için mutlak suretle ifadelenen genlerdir. İfade düzeylerinin doku/hücreler arası değişmediği düşünülmektedir.
Zorunlu İdare Genleri Her Dokuda Eş Düzeyde mi İfadelenir? Vandesompele J ve ark, 2002, Genome Biology, 3: 7
Gen ifadesinin bağıl olarak ölçümü E= 10-1/slope
Erime Eğrisi (Melting Curve) Roche “PCR Applications Manual”
Erime Eğrisi ile Genotipleme Roche “PCR Applications Manual”
Erime Eğrisi ile Genotipleme Roche “PCR Applications Manual”