Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı HIZLI VİRAL TANI TESTLERİ Doç. Dr. Dilek Çolak Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Viroloji Bilim Dalı FEN. 2004. Ankara

Virolojik Tanı Yöntemleri Direkt tanı yöntemleri İndirekt tanı yöntemleri

Virolojik Tanı Yöntemleri 1. Direkt Tanı yöntemleri Direkt inceleme Histoloji Sitoloji Elektron mikroskobisi yöntemi Hücre kültürleri Antijenlerin saptanması İmmün boyama (-floresan, -peroksidaz, vb) ELISA Lateks agl. Nükleik asitlerin tayini Moleküler testler

Virolojik Tanı Yöntemleri 2. İndirekt Tanı Yöntemleri Özgül antikorların araştırılması IgM IgG IgG avidite serum, BOS, vb

Sitoloji: Virus grubu ! Tzanck smear HSV - VZV

Sitoloji: İntranükleer inklüzyonlar CMV

Elektron Mikroskobisi Yöntemi Dışkı Rotavirus, Adenovirus Vezikül sıvısı HSV, VZV

Elektron Mikroskobisi Yöntemi Adenovirus Rotavirus (courtesy of Linda Stannard, University of Cape Town, S.A.)

Elektron Mikroskobisi Yöntemi Direkt görüntü Virus karekterizasyonu Hızlı Ayrdedici Pahalı Duyarlılık 106part./ml Araştırma lab. İmmün Elektron Mikroskobisi

Hücre kültürleri Konvansiyonel CPE

Hücre kültürleri Geç sonuç (1-30 gün) Örnek kalitesi ve transportu çok önemli Kontaminasyon riski Örneklerin toksik etkisi Üremeyen viruslar

Hücre kültürleri Hızlı hücre kültürleri CMV 48 saat

Viral Antijenlerin Saptanması İmmünfloresan boyama (FAT) EIA Lateks agl. Hızlı Canlı virusa gerek yok

Viral Antijenlerin Saptanması RSV Influenza Parainfluenza Adenovirus HSV Varicella-zoster CMV Rotavirus HBV

Viral Antijenlerin Saptanması Nazofaringeal aspirat Dışkı Deri Kan RSV Influenza A and B Parainfluenza Adenovirus Rotaviruses Adenoviruses HSV VZV CMV (pp65 antijenemi testi)

Viral Antijenlerin Saptanması İmmünfloresan boyama

Viral Antijenlerin Saptanması FAT Deride HSV (DFA) (Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital)

Viral Antijenlerin Saptanması Periferik kan lökositleri CMV antijenemi testi; CMV pp65 antijeni 3-4 saat Ciddi lökopenide yetersiz kalır!

pp65 antijenemi testi

Viral Antijenlerin Saptanması FAT RSV Influenza A

Duyarlılık Özgüllük PPD NPD FAT 80 93.3 92.3 95.1 HSV 1-2; Duyarlılık Özgüllük PPD NPD FAT 80 93.3 92.3 95.1 Shellvial-IP 87.6 100 100 96.9 Kon.kültür 100 100 100 100 Chan EL et al. Clin Diagn Lab Immunol 2001;8:909-912

1188 nazal yıkama örneği  sitospin preparatı FAT x Hızlı hücre kült. % Virus Duyarlılık Özgüllük PPD NPD ADV 62.5 100 100 93.8 Infl.A 80 98.6 85 99.6 Infl.B 67.4 100 100 98 PI.1,2,3 88.5 99.7 96.4 98.9 RSV 93.8 95.6 87 98 Toplam 86.7 93.8 87.9 93.1 Rochol C, et al. Pediatrics 2004;113:e51-e56

FAT yönteminde: Örnek kalitesi çok önemli Örnekte yeteri kadar hücre olmalı “yalancı negatif sonuç” Deneyimli personel gerekli Çok sayıda örneğin incelenmesi zor

Viral Antijenlerin Saptanması EIA

Viral Antijenlerin Saptanması EIA Çok çeşitli örnek çalışılır Fazla sayıda örnek çalışılır Otomasyon

Viral Antijenlerin Saptanması Membran EIA

Viral Antijenlerin Saptanması Lateks aglütinasyon

Nükleik Asit Tayini Moleküler testler Polimeraz zincir reaksiyonu Klasik PCR Real-time PCR Hibridizasyon

Nükleik Asit Tayini Klasik PCR

Nükleik Asit Tayini

Nükleik Asit Tayini Real-time PCR                                        

Plato fazı Geçiş fazı Sinyal Logaritmik faz Eşik çizgisi Baz çizgisi 10 20 30 Döngü sayısı

Nükleik Asit Tayini Amplifikasyonla ilişkili floresan sinyallerinin Real-time PCR Amplifikasyonla ilişkili floresan sinyallerinin alınması için gereken siklus sayısı (Ct değeri), başlangıçtaki hedef nükleik asit miktarıyla ters orantılı

Nükleik Asit Tayini Real-time PCR ürün saptama SYBR green I Fluorescense resonance energy transfer (FRET) Hibridizasyon probları Taq-man probları Molecular beacons

SYBR green

FRET

Taq-man probları

Molecular Beacons

Hybrid capture CMV DNA testi 1-DNA ekstraks. Tam kan 4- Konjugat 2-Hedef DNA’nın CMV RNA probu ile hibridizasyon 5.Kemilüm. saptama 3-DNA: RNA hybridlerinin antikorla tutulması by antibody

ADV, 37 konjonktival sürüntü örneği % Test Duyarlılık Özgüllük PPD NPD H.kült. 76.9 100 100 64.7 FAT 73.1 100 100 61.1 PCR 88.4 100 100 78.6 Percivalle E, et al. J Clin Virol 2003;28:257-264 FAT (-)  diğer testler

ADV, >5000 örnek  perif. kan lökositleri Real-time PCR dışkı idrar 132 KHT alıcısı ADV, >5000 örnek  perif. kan lökositleri Real-time PCR dışkı idrar boğaz sürüntüsü Periferik kan löokositlerinde PCR (+) İnvaziv ADV inf. göstergesi Lion T, et al. Blood 2003;102:1114-1120

Tedavi monitörizasyonu Moleküler testler: Avantajları Hızlı Duyarlılık yüksek “latent viruslar için kantitatif testler” Pek çok patojen için uygulanabiliyor Seçilen yönteme göre kontaminasyon riski çok az “MagnaPure+LightCycler” Tedavi monitörizasyonu

Moleküler testler: Dezavantajları Çoğu standardize değil “internal ve eksternal kalite kontrol uygulamaları” Lab.lar arası sonuç karşılaştırması zor “tanı karmaşası” PCR temelli olanlarda IC kullanılmalı Rutin sonuç verirken dikkat! Pahalı Seçilen yönteme göre kontaminasyon riski fazla “in house PCR”

Seroloji: BOS’da antikor tayini: Herpesviruslar Respiratuvar viruslar İntratekal antikor sentezi olduğu gösterilmeli BOS spesifik Ab :serum spesifik Ab BOS IgG:serum IgG  1.5

İletişim Laboratuvar klinik Toplantılar Karşılıklı bilgilendirme Hasta bilgileri paylaşılmalı .....

Yorum Elde edilen sonuçlar neyin göstergesi ne diyor şimdi n’olacak? Mikrobiyolog yaptığı testin sonucunun yorumunu yapabilmeli Klinisyen istediği testin sonucunun yorumunu istemeli, öğrenmeli

“Rekabet ile işbirliğini harmanlayıp; düşleri ortak bir gerçekliğe aktarmak...” Bahar Ö. Düzgören