Biyoteknolojide Kullanılan Yöntemler
Protein Saflaştırmada Yapılan İşlemler
Hücrelerin Parçalanması Tekrarlı dondurma ve eritme (Örn: Sıvı azot) Sonikasyon (Ultrason), Mekanik Parçalama (Blender) Organik çözücülerle hücre zarının geçirgenleştirilmesi Deterjanlarla muamele
Ultrasonla Parçalama Ultrason ile zayıflamak mümkün mü?
Mekaniksel Parçalama
Çöktürme ile kısmi saflaştırma Amonyum sülfat çöktürmesi İzoelektrik çöktürme Organik çözücülerle çöktürme Asit ile çöktürme Isı yoluyla çöktürme Triton X-100 veya CHAPS ile membran proteinleri sökülebilir. SDS proteinleri denatüre ettiği için bu amaç için kullanılmaz.
Santifüj Santrifüj ile karışımda asılı kalan maddelerin daha hızlı çökmesi salanır. Ultra santrifüj kullanılarak mitekondriler bile çöktürülebilir.
Diferansiyel santrifüjleme Diferansiyel santrifüjleme. Homojenat, gittikçe artan santrifüj kuvvetine maruz bırakılarak fraksiyonlara ayrılır.
Denge yoğunluk gradient santrifüj yöntemi
Diyaliz Protein saflaştırmasının çeşitli aşamalarında proteinlerin küçük moleküllerden ayrıştırılması için kullanılan bir işlemdir. Örneğin, amonyum sülfat ile çökeltmenin ardından kullanılacak bir iyon değişim kromatografisi (bkz. aşağıdaki bilgili bölüm) adımı için bu tuzun giderilmesi gerekir, bunun için diyaliz yapılır.
Diyaliz Diyalizde, yarı geçirgen bir membran kullanılır, porlu bir selüloz membran gibi. Porların büyüklüğü proteinlerin geçmesine izin vermez ama küçük moleküller ve tuz iyonları geçebilir.
Diyaliz Diyaliz edilecek protein karışımı bir dializ torbasına konur, torba da büyük hacimli bir tampon çözeltisi içine yerleştirilir. Birkaç saat sonra torbanın dışındaki ve içindeki çözelti dengelenir, iki taraf küçük moleküller bakımından aynı bileşime sahip olur.
Diyaliz İşlemi ile tuzların uzaklaştırılması
Diyaliz sistem dengeye ulaşıncaya kadar devam eder
Jel filtrasyon kromatografisi ile de tuzlar uzaklaştırılabilir
Kromatografik Yöntemler Protein Saflaştırılmasında genellikle kolon kromatografisi kullanılır. Bunlar: Afinite kromatografisi İyon değişim kromatografisi Jel filtrasyon kromatografisi
Kromatografi, bir karışımdaki maddelerin bir sabit faz üzerinde farklı hızlarda sürüklenmesi sonucunda birbirinden ayrılması temeline dayanır. Maddeleri sürükleyen ise bir sıvı ya da gaz olabilir
Karışımdaki maddeler sabit faz tarafından ne kadar alıkonuyorsa o oranda yavaş ilerler. Örneğin; sıkışık bir trafikte taksiler durmuş iken motosikletlerin daha hızlı ilerlemesi gibi… Ya da trafik kontrolünde taşıtlar durdurulurken yayaların ilerlemesi gibi…
Uygulama Şekline Göre İnce Tabaka Kromatografisi Kolon Kromatografisi Sabit faz, saflaştırılmak istenen maddenin cinsine göre değişir. Bu sabit fazı genellikle hem ince tabaka hem de kolon kromatografisine uygulayabiliriz. Tercih size kalmış.
İnce Tabaka Kromatografisi
Sabit Faz Başlangıç Hareketli Faz
More polar! Less polar! s o l v e n t f r i g mixture c m p B A
Rf değeri aynı şartlarda bir madde için aynıdır. Rf ayırt edici bir özelliktir.
Elinizdeki karışımda, şüphelendiğiniz maddenin olup olmadığını İTK ile anlayabilirsiniz. Ayrılan noktayı kazıyıp maddeyi saf olarak da elde edebilirsiniz.
Kolon Kromatografisi
Principles of Separation on a column
Principles of Separation
Principles of Separation
Principles of Separation
Principles of Separation
Principles of Separation
Principles of Separation
Kolon kromatografisi uygulanan tekniğe göre değişik alt bölümlere ayrılabilir. İyon değişim kolonu Jel filtrasyon kolonu Afinite kolonu Hidrofobik etkileşme kolonu
İyon Değişim Kromatografisi Kolondaki sabit faz çalışılan pH’da + ya da – bir yüke sahiptir. Sabit fazla zıt yükle yüklü olan maddeler kolonda alıkonurken aynı yükte olanlar alıkonmazlar.
Jel Filtrasyon Kromatografisi ŞOK! ŞOK! ŞOK! Daha büyük moleküller daha hızlı ilerler.
Afinite Kroma.. Specific interactions
Afinite Kromatografisi Sabit faza öyle bir molekül tutturulur ki; sadece ilgilendiğimiz molekülle etkileşir ve onu kolonda tutar.
Afinite kromatografisinde gerekirse uzatma kolu kullanılabilir
Kromatografi bir çok analiz cihazının kullandığı saflaştırma tekniğidir. Bunlardan sıklıkla kullanılan ikisi: HPLC Gaz Kromatografisi
Hewlett-Packard Series 1100 HPLC Çözücüler Pompa Enjektör Kolon Dedektör
HPLC
HPLC ŞEMA
HPLC Chromatogram of Standard 1 0.500 x 10-4 M caffeine
HPLC Chromatogram of Standard 2 1.00 x 10-4 M caffeine
HPLC
Gaz Kromatografisi
Gaz Kromatografisi
Protenleri derişikleştirme A. Ultra Filtrasyon
Protenleri derişikleştirme B. Liyofilizasyon
Elektroforez 1D elektroforez 2D elektroforez Doğal elektroforez (Poliakril amid, Agar) SDS-PAGE (Sodyum Dodesil Sülfat Poliakril Amid Jel Elktroforezi) 2D elektroforez
Elektroforezin Temeli
Dikey Elektroforez Proteinleri Ayırmada Kullanılmaktadır
Dikey Elektroforez
SDS’nin (Sodyum Dodesil Sülfat) Etkisi
Elektroforezden sonra boyama yapılır
Boyamadan sonra ise yıkama yapılır
SDS-PAGE ile Mol Kütlenin Bulunması
Yatay Elektroforez Nükleer Materyalleri Ayırmada Kullanılmaktadır Yatay elektroforezde jel olarak agar kullanılır
Nükleer Materyallerin Elektroforez ile Ayrılması
İzoelektrik Fokuslama
2D Elektroforez
2D Elektroforez
DNA İzolasyonu Malzemeler 1. Lizis solüsyonu 0.5 M Tris-HCl pH 8.0, 20 mM EDTA 10 mM NaCl 1% SDS 0.5 mg/mL proteinase K 2. Doygun NaCl (6M) 3. Etanol (%96, %70)
DNA İzolasyonu Uygulama Basamakları Hazırlanan lizis solüsyonundan hücre peletinin üzerine 2 mL eklenir. 37°C ‘de bir gece bekletilir. 1 mL doygun NaCL eklenir. Örnekler 55°C 10 dakika bekletilir. 30 dakika 500 g’de santrifüj edilir. Alttaki protein bölümüne dokunmadan süpernatant yeni bir tüpe aktarılır. Süpernatantın 2 katı hacimde soğuk %96’lık etanol eklenir. Tüp defalarca alt üst edilerek DNA’nın çökmesi sağlanır.
DNA İzolasyonu Uygulama Basamakları Çöken DNA plastik spatula yada santrifüj ile alınarak yeni bir tüpe aktarılır. Santrifüj yapılacak ise 10.000 g’de 10 dakika santrifüj edilir. Üstteki alkol fazı atılır. %70’lik alkol ile DNA bir kez yıkanır. Bunun için 1mL %70’lik alkol eklenir. Tüp alt üst edilir. 10.000 g’de 10 dakika santrifüj edilir. Üstteki alkol fazı atılır. DNA havada kurutulur. Distile suda DNA çözülür. Çözülmesini kolaylaştırmak için 65 0C’de 10 dakika tutulur. Elde edilen DNA dan 1/25 -1/40 dilüsyon hazırlanır. A280 / A260 oranı ölçülür (oran >1.5 olmalıdır). 280 nm’deki absorbans önce 50, sonra da dilüsyon faktörü ile çarpılır. Sonuç μg/mL olarak DNA konsantrasyonunu verir.
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Antijen-antikor ilişkisini, antikora bağlanmış bir enzimin aktivitesini araştırmak temeline dayanan kantitatif ölçüm yöntemidir. Antijene karşı antikor ya da antikora karşı antijen aramak mümkündür. Virüs ve parazit enfeksiyonlarında kullanılan bir tanı yöntemidir.
Sandviç ELISA
Sandviç ELISA
Sandviç ELISA
Sandviç ELISA