Biyoteknolojide Kullanılan Yöntemler

Slides:



Advertisements
Benzer bir sunumlar
DNA PURİFİKASYON YÖNTEMLERİ
Advertisements

ELEKTROFOREZ.
Karışımların Ayrılması
PROTEİNLERİN DENATÜRE JEL ELEKTROFOREZİ İLE
GAZ ABSORPSİYONU SİSTEMLERİ TASARIMI
SU, ÇÖZELTİLER, ASİT VE BAZLAR I
AFİNİTE KROMATOGRAFİSi
ELEKTROFOREZ Arş.Gör. Nahit GENÇER.
ENZİM SAFLAŞTIRILMASI VE NİTELENDİRİLMESİ
BAKTERISINDEN PEROKSIDAZ ENZIMININ SAFLAŞTIRILMASI VE KINETIĞININ ARAŞTIRILMASI Parham Taslimi.
VÜCUT SIVILARINDA HÜCRE SAYIMI
ALETLİ (ENSTRÜMENTAL) ANALİZ
Semen analizinde standart ve isteğe bağlı test prosedürleri
ÇÖZELTİLER.
Uygulamalı Eğitim: PCR Kullanarak Patates Yıkama Suyu İçindeki Patojenlerin Tespiti.
KARIŞIMLAR.
DNA PÜRİFİKASYONU.
PROTEİNLER VE ELEKTROFOREZ TEKNİĞİ
ALETLİ ANALİZ YÖNTEMLERİ HPLC ‘nin İLAÇ ENDÜSTRİSİNDE KULLANIMI
JEL GEÇİRGENLİK KROMATOGRAFİSİ (GPC)
KROMATOGRAFİ.
ELEKTROFOREZ.
9.Sınıf Meslek Esasları ve Tekniği
Çözeltiler. Çözeltilerin derişimleri. Net iyonik denklem.
Kromatografi nin dayandığı temel olaylar Adsorpsiyon Dağılma
SUDA SERTLİK YAPAN ELEMENTLER VE BUNLARIN GİDERİLMESİ
KANIN BİLEŞİMİ VE İŞLEVLERİ
Deney No: 4 Derişimin Tepkime Hızına Etkisi
ÇÖZELTİLER VE ÇÖZÜNÜRLÜK
MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER 1: KANDAN DNA İZOLASYONU
Protein Analiz Yöntemleri ve Proteomik
SU, ÇÖZELTİLER, ASİT VE BAZLAR II
Çözeltiler Ve Konsantrasyon Hesabı
ÇÖZELTİLER VE ÇÖZÜNÜRLÜK
ÇöZELTİLER.
Çözeltiler.
İKİ YADA DAHA FAZLA MADDENİN ÖZELLİKLERİNİ KAYBETMEDEN ÇEŞİTLİ ORANLARDA KARIŞMASI İLE OLUŞAN TOPLULUĞA KARIŞIM DENİR KARIŞIMLAR İKİ SINIFTA İNCELENİR.
Karışımların Ayrılması
ÇÖZELTİ İki veya daha çok maddenin birbiri içerisinde serbest moleküller veya iyonlar halinde dağılarak meydana getirdiği homojen bir karışıma çözelti.
4. ÇÖZÜNÜRLÜK   4.1. Çözünürlük çarpımı NaCl Na Cl- (%100 iyonlaşma)
HÜCRE ZARINDA TAŞINIM Yrd. Doç. Dr. Aslı AYKAÇ YDÜ TIP FAKÜLTESİ
Bölüm 10. Kimyasal Dengelere Elektrolitlerin Etkisi
MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II:
MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II
MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II:
BİYOKİMYA LABORATUVARI
99mTcO4 Tanıda en sık kullanılan radyonüklid FYÖ:6 saat
MBKY Lab II: RNA izolasyonu 1. HAFTA
Arş.Gör. F.Necmiye KACI Erzurum Teknik Üniversitesi,2017
PROTEİNLERİN TANIMLANMASI
2. KİMYASAL ANALİZ YÖNTEMLERİ
BÖLÜM I1. LABORATUVAR GENEL BİLGİLERİ
PROTEİN İZOLASYONU VE WESTERN BLOTLAMA
KROMATOGRAFİK ANALİZ YÖNTEMLERİ
α-Amino asitlerin genel yapısı
KARIŞIMLAR ÇÖZÜNME ÇÖZELTİ ÇÖZELTİLER.
GENEL KİMYA Çözeltiler.
Kromatografi Diğer ayırma yöntemlerinin tam yeterli olamadığı durumlarda, tercihen kullanılan bir ayırma yöntemidir. Özellikle fiziksel ve kimyasal nitelikleri.
Bakteri- Virus- Mantar
Biyokimyasal Ölçüm Teknikleri
Genel Biyoloji Laboratuvarı II Dersi
 Plazmidler bakterilerde bulunan, ekstra kromozomal, çift iplikli, dairesel DNA molekülleridirler.  Hücre içerisinde boyutları ve kopya sayıları çeşitlilik.
KYM342 ENTRUMENTAL ANALİZ
ICP (INDUCTIVELY COUPLED PLASMA) İNDÜKTİF EŞLEŞMİŞ PLAZMA YÖNTEMİ
ANALİTİK KİMYA DERS NOTLARI
Kromatografi.
Enzimatik Reaksiyonu Etkileyen Faktörler (Pratik Ders)
Kromatografi.
ASİTLER VE BAZLAR. ASİTLER VE BAZLAR HCl(suda)  H+ + Cl - Asit nedir ? Suda çözündüğünde H + iyonu veren maddelerdir. HCl(suda)  H+ + Cl -
Sunum transkripti:

Biyoteknolojide Kullanılan Yöntemler

Protein Saflaştırmada Yapılan İşlemler

Hücrelerin Parçalanması Tekrarlı dondurma ve eritme (Örn: Sıvı azot) Sonikasyon (Ultrason), Mekanik Parçalama (Blender) Organik çözücülerle hücre zarının geçirgenleştirilmesi Deterjanlarla muamele

Ultrasonla Parçalama Ultrason ile zayıflamak mümkün mü?

Mekaniksel Parçalama

Çöktürme ile kısmi saflaştırma Amonyum sülfat çöktürmesi İzoelektrik çöktürme Organik çözücülerle çöktürme Asit ile çöktürme Isı yoluyla çöktürme Triton X-100 veya CHAPS ile membran proteinleri sökülebilir. SDS proteinleri denatüre ettiği için bu amaç için kullanılmaz.

Santifüj Santrifüj ile karışımda asılı kalan maddelerin daha hızlı çökmesi salanır. Ultra santrifüj kullanılarak mitekondriler bile çöktürülebilir.

Diferansiyel santrifüjleme Diferansiyel santrifüjleme. Homojenat, gittikçe artan santrifüj kuvvetine maruz bırakılarak fraksiyonlara ayrılır.

Denge yoğunluk gradient santrifüj yöntemi

Diyaliz Protein saflaştırmasının çeşitli aşamalarında proteinlerin küçük moleküllerden ayrıştırılması için kullanılan bir işlemdir. Örneğin, amonyum sülfat ile çökeltmenin ardından kullanılacak bir iyon değişim kromatografisi (bkz. aşağıdaki bilgili bölüm) adımı için bu tuzun giderilmesi gerekir, bunun için diyaliz yapılır.

Diyaliz Diyalizde, yarı geçirgen bir membran kullanılır, porlu bir selüloz membran gibi. Porların büyüklüğü proteinlerin geçmesine izin vermez ama küçük moleküller ve tuz iyonları geçebilir.

Diyaliz Diyaliz edilecek protein karışımı bir dializ torbasına konur, torba da büyük hacimli bir tampon çözeltisi içine yerleştirilir. Birkaç saat sonra torbanın dışındaki ve içindeki çözelti dengelenir, iki taraf küçük moleküller bakımından aynı bileşime sahip olur.

Diyaliz İşlemi ile tuzların uzaklaştırılması

Diyaliz sistem dengeye ulaşıncaya kadar devam eder

Jel filtrasyon kromatografisi ile de tuzlar uzaklaştırılabilir

Kromatografik Yöntemler Protein Saflaştırılmasında genellikle kolon kromatografisi kullanılır. Bunlar: Afinite kromatografisi İyon değişim kromatografisi Jel filtrasyon kromatografisi

Kromatografi, bir karışımdaki maddelerin bir sabit faz üzerinde farklı hızlarda sürüklenmesi sonucunda birbirinden ayrılması temeline dayanır. Maddeleri sürükleyen ise bir sıvı ya da gaz olabilir

Karışımdaki maddeler sabit faz tarafından ne kadar alıkonuyorsa o oranda yavaş ilerler. Örneğin; sıkışık bir trafikte taksiler durmuş iken motosikletlerin daha hızlı ilerlemesi gibi… Ya da trafik kontrolünde taşıtlar durdurulurken yayaların ilerlemesi gibi…

Uygulama Şekline Göre İnce Tabaka Kromatografisi Kolon Kromatografisi Sabit faz, saflaştırılmak istenen maddenin cinsine göre değişir. Bu sabit fazı genellikle hem ince tabaka hem de kolon kromatografisine uygulayabiliriz. Tercih size kalmış.

İnce Tabaka Kromatografisi

Sabit Faz Başlangıç Hareketli Faz

More polar! Less polar! s o l v e n t f r i g mixture c m p B A

Rf değeri aynı şartlarda bir madde için aynıdır. Rf ayırt edici bir özelliktir.

Elinizdeki karışımda, şüphelendiğiniz maddenin olup olmadığını İTK ile anlayabilirsiniz. Ayrılan noktayı kazıyıp maddeyi saf olarak da elde edebilirsiniz.

Kolon Kromatografisi

Principles of Separation on a column

Principles of Separation

Principles of Separation

Principles of Separation

Principles of Separation

Principles of Separation

Principles of Separation

Kolon kromatografisi uygulanan tekniğe göre değişik alt bölümlere ayrılabilir. İyon değişim kolonu Jel filtrasyon kolonu Afinite kolonu Hidrofobik etkileşme kolonu

İyon Değişim Kromatografisi Kolondaki sabit faz çalışılan pH’da + ya da – bir yüke sahiptir. Sabit fazla zıt yükle yüklü olan maddeler kolonda alıkonurken aynı yükte olanlar alıkonmazlar.

Jel Filtrasyon Kromatografisi ŞOK! ŞOK! ŞOK! Daha büyük moleküller daha hızlı ilerler.

Afinite Kroma.. Specific interactions

Afinite Kromatografisi Sabit faza öyle bir molekül tutturulur ki; sadece ilgilendiğimiz molekülle etkileşir ve onu kolonda tutar.

Afinite kromatografisinde gerekirse uzatma kolu kullanılabilir

Kromatografi bir çok analiz cihazının kullandığı saflaştırma tekniğidir. Bunlardan sıklıkla kullanılan ikisi: HPLC Gaz Kromatografisi

Hewlett-Packard Series 1100 HPLC Çözücüler Pompa Enjektör Kolon Dedektör

HPLC

HPLC ŞEMA

HPLC Chromatogram of Standard 1 0.500 x 10-4 M caffeine

HPLC Chromatogram of Standard 2 1.00 x 10-4 M caffeine

HPLC

Gaz Kromatografisi

Gaz Kromatografisi

Protenleri derişikleştirme A. Ultra Filtrasyon

Protenleri derişikleştirme B. Liyofilizasyon

Elektroforez 1D elektroforez 2D elektroforez Doğal elektroforez (Poliakril amid, Agar) SDS-PAGE (Sodyum Dodesil Sülfat Poliakril Amid Jel Elktroforezi) 2D elektroforez

Elektroforezin Temeli

Dikey Elektroforez Proteinleri Ayırmada Kullanılmaktadır

Dikey Elektroforez

SDS’nin (Sodyum Dodesil Sülfat) Etkisi

Elektroforezden sonra boyama yapılır

Boyamadan sonra ise yıkama yapılır

SDS-PAGE ile Mol Kütlenin Bulunması

Yatay Elektroforez Nükleer Materyalleri Ayırmada Kullanılmaktadır Yatay elektroforezde jel olarak agar kullanılır

Nükleer Materyallerin Elektroforez ile Ayrılması

İzoelektrik Fokuslama

2D Elektroforez

2D Elektroforez

DNA İzolasyonu Malzemeler 1. Lizis solüsyonu 0.5 M Tris-HCl pH 8.0, 20 mM EDTA 10 mM NaCl 1% SDS 0.5 mg/mL proteinase K 2. Doygun NaCl (6M) 3. Etanol (%96, %70)

DNA İzolasyonu Uygulama Basamakları Hazırlanan lizis solüsyonundan hücre peletinin üzerine 2 mL eklenir. 37°C ‘de bir gece bekletilir. 1 mL doygun NaCL eklenir. Örnekler 55°C 10 dakika bekletilir. 30 dakika 500 g’de santrifüj edilir. Alttaki protein bölümüne dokunmadan süpernatant yeni bir tüpe aktarılır. Süpernatantın 2 katı hacimde soğuk %96’lık etanol eklenir. Tüp defalarca alt üst edilerek DNA’nın çökmesi sağlanır.

DNA İzolasyonu Uygulama Basamakları Çöken DNA plastik spatula yada santrifüj ile alınarak yeni bir tüpe aktarılır. Santrifüj yapılacak ise 10.000 g’de 10 dakika santrifüj edilir. Üstteki alkol fazı atılır. %70’lik alkol ile DNA bir kez yıkanır. Bunun için 1mL %70’lik alkol eklenir. Tüp alt üst edilir. 10.000 g’de 10 dakika santrifüj edilir. Üstteki alkol fazı atılır. DNA havada kurutulur. Distile suda DNA çözülür. Çözülmesini kolaylaştırmak için 65 0C’de 10 dakika tutulur. Elde edilen DNA dan 1/25 -1/40 dilüsyon hazırlanır. A280 / A260 oranı ölçülür (oran >1.5 olmalıdır). 280 nm’deki absorbans önce 50, sonra da dilüsyon faktörü ile çarpılır. Sonuç μg/mL olarak DNA konsantrasyonunu verir.

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Antijen-antikor ilişkisini, antikora bağlanmış bir enzimin aktivitesini araştırmak temeline dayanan kantitatif ölçüm yöntemidir. Antijene karşı antikor ya da antikora karşı antijen aramak mümkündür. Virüs ve parazit enfeksiyonlarında kullanılan bir tanı yöntemidir.

Sandviç ELISA

Sandviç ELISA

Sandviç ELISA

Sandviç ELISA