ONDOKUZ MAYIS ÜNİVERSİTESİ TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİ BİTKİ DOKU KÜLTÜRÜ HÜCRE ve PROTOPLAST KÜLTÜRÜ HAZIRLAYANLAR: AYŞENUR EFŞAN YARAR KÜBRA ATALAY MAVİŞ YAYLA HALİME EDA SEFER MELİH KENDİR DANIŞMAN: YRD.DOÇ.DR. YILMAZ KAYA

HÜCRE KÜLTÜRÜ Hücre kültürleri, uygun sıvı besi ortamlarında bireysel veya kümeler halindeki büyüyen hücrelerden oluşur. Bu kültürler kallus parçalarının sıvı besi ortamı içinde bir çalkalayıcı üzerinde süspanse hale gelinceye kadar çalkalanması ile elde edilir. 

Hücre kültürlerinin elde edilmesinde; 0 Hücre kültürlerinin elde edilmesinde; 0.5 g kallus, 50 ml besi yeri içeren 200 ml’lik erlen kabına transfer edilir, erlen bir çalkalayıcı üzerine yerleştirilir ve çalkalayıcının hızı 100-150 devir/dk olarak ayarlanır. Çalkalama sırasında kallusu oluşturan hücreler, bireysel hücrelere veya hücre kümelerine ayrılır.

Periyodik olarak kültürlerin besi ortamı yeni ortam ilave edilerek hücrelerin hızlı bir şekilde çoğalmaları sağlanır. Hücre süspansiyonu elde edildikten sonra, bu süspansiyondan alınan 10 ml’lik süspansiyon pipet yardımıyla alınarak, içinde 40 ml taze besi ortamı bulunan yeni bir erlen kabına aktarılır ve böylelikle alt kültüre alınmış olur.

Hücre Kültürlerinin Kullanım Alanları Hücre kültürlerinin kullanım alanları aşağıda açıklanmıştır. 1. İn Vitro Seleksiyon 2. Protoplast Kültürlerinin Elde Edilmesi 3. Sekonder Metabolit Üretilmesi

1. İn Vitro Seleksiyon Hücre kültürlerinin varyasyon yaratılması ve arzu edilen varyantların seçilmesinde kullanılması bitki ıslahında bilinen ve bitkilerin seleksiyonunu esas alan seleksiyon yöntemlerine göre birçok avantajlar sağlamaktadır. Bu avantajlar; - Bir test tüpü içerisinde 100 milyon adet hücreyi kültür etmek ve bunlardan seleksiyon yapmak mümkündür. Buna karşılık aynı sayıdaki bitki ile çalışmak için yaklaşık 10 bin hektarlık alana ihtiyaç duyulur. - Eşey hücrelerinden elde edilen haploid kromozom sayısına sahip hücrelerle çalışıldığında, resesif durumdaki mutasyonların ortaya çıkarılması ve bunların seçimesi çok kolaydır. Bilinen klasik ıslah yöntemleriyle ise bu tip mutasyonların ortaya çıkarılması güç ve zaman alıcıdır. - Mutasyona uğrayan tek bir hücreden bitki rejenerasyonu sağlanabildiği için kimera bitkilerin (genetik farklılık gösteren hücre gruplarını içeren bitki) ortaya çıkması önerilir.

Hücre kültürlerinde seleksiyon uygulamasında, hücreler herhangi bir kimyasalın veya herhangi bir patojenik toksik maddenin toksik etki gösteren konsantrasyonu içeren besi ortamlarında kültür edilir. Mutasyon gösteren hücreler böyle bir ortamda büyümelerine devam ederler. Toksik maddeden etkilenen hücreler ölür. Yapılan araştırmalarda nükleik asit ve aminoasit benzeri maddelere atrazin, 2,4-D ve NaCl’e dayanıklı hücre hatları selekte edilmiş ve bu hücrelerden bitki rejenerasyonu gerçekleştirilmiştir.

Carlson (1973),  tütün hücre ve protoplasma kültürleri ile sürdürdüğü araştırmalarda yapısal olarak hem methionin hem de tütünde vahşi yanıklık hastalığının etmeni olan Pseudomonas tabaci bakterisinin toksinine benzeyen methionin sulfoximin maddesine dayanıklı hücreleri selekte etmiştir. Bu hücrelerden rejenere olan bitkilerin normal bitkilere göre beş kat daha fazla methionin içerdiği ve Pseudomonas tabaci bakterisinin enfeksiyonuna daha az hassas oldukları saptanmıştır. Yapılan genetik analizler bitkilerde ortaya çıkan bu farklılığın kanıtsal olduğunu ortaya koymuştur. Bu araştırmanın sonuçları iki önemli noktaya işaret etmektedir; 1)Bitkilerde beslenme açısından önemli aminoasitlerin konsantrasyonları artırılabilir. 2)Bitkilerin patojenlere karşı hassasiyeti azaltılabilir.

2. Protoplast Kültürlerinin Elde Edilmesi Hücre kültürleri protoplast izolasyonu için başlangıç materyalini oluştururlar. Hücre kültürlerinden izole edilen protoplastlar somatik melezleme ve gen transferi gibi daha komplike biyoteknolojik yöntemlerin uygulanmasına olanak sağlar. 3. Sekonder Metabolitlerin Üretilmesi Hücre kültürlerinin pratikte kullanım alanlarından birisi de, tıp ve endüstrinin değişik alanlarında kullanılan alkoloidler, glikozidler,eterik yağlar,steroidler, terpenoidler, phenolikler gibi birçok sekonder bitki metabolitlerinin (bitkinin ürettiği fakat direkt olarak kullanmadığı metabolitler) in vitro kültür yoluyla biyosentezidir.

Bitki hücre ve doku kültüründeki gelişmeler, penisilin gibi tıbbi bileşiklerin mantarların kültürü ile elde edilebildiği gibi bitkisel sekonder metabolitlerinin bitki hücrelerinin sıvı besi ortamlarında süspensiyon halinde kültür edilmeleriyle elde edilebileceği fikrini doğurdu. Hücre kültürleri ile bitkisel sekonder metabolitlerinin üretimi bitkilerden bu ürünlerin elde edilmesine göre aşağıdaki avantajları sağlayabilir; Söz konusu bileşikler kontrollü koşullarda üretilebilir Kültür edilen hücreler her türlü mikrop ve insektisitlerden arınmış haldedir. Herhangi bir bitkinin hücreleri belirli bir metaboliti üretmek üzere çoğaltılabilir. Hücre büyümesi otomatik olarak kontrol edilebilir ve metabolik olaylar düzenlenebilir.

Hücre kültürünün yukarıda sayılan özellikleri sekonder metabolitlerin üretiminde verimliliği arttırır ve iş gücü ve masrafı azaltır. Fakat hücre kültürü yoluyla sekonder metabolitlerin üretiminin bilinen klasik yöntemle bu ürünlerin elde edilmesine alternatif oluşturabilmesi için , böyle bir tekniğin bazı koşulları yerine getirmesi gerekir. Her şeyden önce iyi bir sekonder metabolit verimi elde edilebilme ve öncelikle de ekonomik üretim yapılabilmelidir. Belirli bir sabit verim alabilmek için hücrelerin genetik stabilite göstermeleri gerekir. Hücre kültürlerinde yüksek bir sekonder metabolit elde edebilmek için, hücre kültürlerinin elde edilmesinde kullanılan kallusun arzu edilen sekonder metabolit ürünlerinin verimi ışık, besin maddeleri, büyüme regülatörleri gibi çevre koşulları, morfolojik ve kimyasal farklılaşma ve biyosentetik kapasite gibi biyolojik faktörlerden etkilenir.

PROTOPLAST KÜLTÜRÜ Bitki hücrelerinin plasma membranları selülozdan oluşan bir duvarla çevrilmiştir ve bir dolu içindeki hücreler pektince zengin bir matrix ile birbirine bağlanmıştır. Mekanik olarak veya enzimlerle hücrelerin birbirinden ayrılması ve hücre duvarının uzaklaştırılması sonucu hücre duvarı olmayan çıplak hücreler olarak bilinen protoplastlar elde edilir.

Protoplast Kültürlerinin Kullanım Alanları Somatik Melezleme Protoplastların fuzyonu yoluyla somatik melezleme yakın akraba veya akraba olmayan türlerin melezlerini elde etmede kullanılan bir yöntemdir. Bu yöntem bitki ıslahında bilinen yöntemlerle gerçekleştirilemeyen arzu edilen melez bitkilerin elde edilebilmesine olanak sağlar. İn Vitro Seleksiyon Bazı bakteriyel ve mantar patojenleri tarafından üretilen toksik bileşikler hassas bitkilerin protoplastları üzerinde zararlı etki yapmakta, dayanıklı bitkilerin protoplastlarını ise etkilememektedirler. Protoplastlar bu toksik maddeleri içeren besi ortamlarında kültüre alınarak dayanıklı bitkiler protoplast düzeyinde selekte edilebilmektedir.

Gen Transferi İzole edilmiş protoplastlar çekirdek ve kloroplast gibi bitki organellerini içine alabilmektedir. Ayrıca protoplastların protein, DNA ve diğer makro molekülleri içine alabildiği araştırmalarda saptanmıştır. Bakteri ve diğer organizmaların DNA’sı protoplastlar tarafından alınabilmektedir. Bu yolla protoplastlara genetik transfer yapılabilmektedir.

Bitki Protoplastlarının İzolasyonu Yüksek bitkilerde mekanik yolla protoplast izolasyonu 1892’de başarılmıştır ( Feher ve Dudits,1994 ) Ancak bitki protoplastları ile ilgili gerçek araştırmalar; 1960’lı yıllarda enzim uygulaması yoluyla canlı protoplastların izolasyonu yönteminin ortaya konması ile başlamıştır. (Gamborg ve ark.,1981). Uygun besi ortamı ve çevre koşullarında protoplastlar hücre duvarı oluşturmakta ve hücre bölünmesi göstererek tam teşekküllü bir bitki oluşturabilmektedirler.   

Protoplastlar genellikle dokuların protoplast skrütürünü ve canlılığını muhafaza edecek osmotik stabilizasyon sağlayan maddeleri içeren solüsyonlar içinde hücre duvarını parçalayacak enzimlerle muamelesi yoluyla izole edilir.Protoplast izolasyonunda başarı; protoplast izolasyonu için kullanılan doku ve hücrelerin fizyolojik durumuna, kullanılan enzimlere, solüsyonun bileşimine ve osmotik stabilizasyonu sağlayıcı maddelerin tipine ve konsantrasyonuna bağlıdır. Bugüne kadar yapılan araştırmalarda arpa, mısır, çeltik, buğday, sorghum, pamuk, patates, kolza, şeker pancarı, keten, yonca, bezelye, soya fasulyesi, fasulye ve tütün gibi tarla bitkilerinde protoplast izolasyonu başarı ile gerçekleştirilmiştir.

Protoplast izolasyonunda yaygın olarak kullanılan bitki organı yapraklardır. Genç bitkiler veya yeni sürgünlerden alınan tam olarak açılmış yapraklar protoplast izolasyonu için en uygun materyali oluşturmaktadır. Yaprağın yaşı ve yaprağın alındığı bitkinin yetiştiği yerdeki ışık,sıcaklık,toprak verimliliği ve su gibi çevre koşulları protoplast verimini,canlılığını ve kalitesini önemli ölçüde etkiler. Dokunun fizyolojik durumu protoplast izolasyonunda başarıyı etkileyen en önemli faktör olduğu için bitkiler çevre koşullarının kontrol edilebildiği iklim odalarında ve seralarda yetiştirilir. 0,3- 1,0 W/cm2 arasındaki ışık intensitesinin olumlu sonuçlar verdiği, bazı durumlarda daha yüksek ışık intensitelerine gereksinim duyulduğu saptanmıştır.Genellikle 16-18 saatlik aydınlatma periyotları uygulanır.Bazı durumlarda protoplast izolasyonundan önce dokuların 24-72 saat karanlıkta bekletilmesinin hücrelerde bulunan nişasta taneciklerinin parçalanmasına yol açarak protoplast canlılığını olumlu yönde etkilediği saptanmıştır.

Bitkinin yetiştiği koşullardaki sıcaklık ve nem koşulları iyi bir bitki gelişmesini sağlayacak şekilde ayarlanmalıdır.Bitkinin beslenme koşullarının, özellikle azot beslenmesinin iyi olması yararlı olmaktadır. Yaprak dokusu dışında, sürgün uçları, kotiledonlar, çiçek petalları ve mikrosporlar da protoplast izolasyonunda kullanılabilmektedir.Agarlı ortamda kültür edilen kallusta büyüme hızı yavaş ve kallusu oluşturan hücreler arasında yaş ve fizyolojik durum farklılığı olması nedeniyle bu tip kallus protoplast izolasyonu için çok uygun değildir.

Protoplast izolasyonunda kullanılacak hücre süspansiyon kültürlerinin 3-4 günde bir yeni ortama aktarılarak maksimum büyüme ve hücre popülasyonunda üniformite sağlanması gerekir.Alt kültür yapılan hücre kültürleri yeni ortama aktarılmalarından 2 gün sonra protoplast izolasyonu için en uygun duruma gelmektedirler.Yeni oluşturulmuş hücre kültürleri protoplast izolasyonunda kullanıldığında, bu tip kültürler farklı büyüklük ve yaştaki hücreleri ve bir kısım ölü hücreleri içermeleri nedeniyle düşük protoplast verimine neden olmaktadırlar.

Protoplast İzolasyonunda Kullanılan Enzimler ve İzolasyon Ortamı Bitki hücre duvarı fizyolojik bir engel olmamasına karşılık, bir çok yüksek bitkilerde mekanik bir bariyer oluşturur. Hücre duvarı, hücre zarına destek oluşturur ve osmotik basınç değişikliği ortaya çıktığında zarın zarar görmesini engeller. Ayrıca, hücre duvarı mikroorganizmaların hücre içine girişini engeller. Yapılan araştırmalarda hücre duvarının selüloz, hemiselüloz ve pektik maddelerden oluştuğu saptanmıştır.

Selüloz hücre duvarının %25-50 sini oluşturur Selüloz hücre duvarının %25-50 sini oluşturur. Hücre duvarının ortalama %53’ü hemiselülozdan oluşur. Pektik maddeler ise, dikotiledon bitkilerde hücre duvarının önemli bir kısmını (%35) oluşturmasına karşılık, monokotiledon bitkilerde pektik maddelerin hücre duvarının oluşumuna katkısı çok azdır. Bu durum iki farklı bitki grubunda etkin bir protoplast izolasyonu için kullanılacak enzimlerde farklılığa yol açabilmektedir.

Protoplast izolasyonunda kullanılan enzimler genellikle selülaz,hemiselülaz ve pektinaz gibi üç enzim grubundan oluşur. Bu enzimlerin piyasada satılan preparatları genellikle saf değildir. Protest, lipaz ve nükleaz gibi enzimlerle karışık olarak bulunurlar. Bunların bazıları protoplastlara zararlı etki yapabilir.

Enzimlerin kompozisyonu ve konsantrasyonu protoplast izolasyonunda başarıyı etkiler. Protoplast izolasyonunda kullanılan inkübasyon karışımı, bazı mineralleri içeren bir solüsyon veya bir besi ortamı içinde çözülmüş enzimler, bir tampon ve osmotik basınç ayarlayıcı maddelerden oluşur. Yaygın olarak kullanılan osmotik basınç ayarlayıcı maddeler; sorbitol, mannitol, glukoz ve sükrozdur. 

Bu maddeler genellikle karışım halinde kullanılır Bu maddeler genellikle karışım halinde kullanılır. Protoplast izolasyonunda kullanılan inkubasyon karışımının pH’sı 5-6 arasında olmalıdır. Solüsyon genellikle fosfat veya MES (2(Nmorpholino)- ethanesulfonic acid) gibi tampon maddelerinden birisini içerir.Bu maddeler solüsyonun pH’sındaki aşırı değişimleri minimize eder.

İzolasyon İşlemi Protoplast izolasyonu petri kutularında veya benzeri cam kaplarda yapılır. Yaprak veya diğer dokular 1mm’lik küçük parçalara ayrılır ve mümkünse yaprak epidermisi uzaklaştırılır. Daha sonra bu yaprak parçaları 23-28 derecede inkübasyon solüsyonu içerisinde bir çalkalayıcı üzerinde inkube edilir.İnkübasyon süresi 6- 16 saat arasında değişir.Çalkalama hızının fazla olması protoplastlara zarar verebilir.

İnkübasyon işleminden sonra; protoplastlar enzimler, hücre duvarı kalıntılarını parçalanmamış dokulardan filtrasyon, santrifüj ve yıkama ile ayrılır. Protoplastları içeren enzim solüsyonu 50-100 µm’lik naylon süzgeçlerden geçirilir ve böylece protoplastlar, enzimden etkilenmemiş büyük doku parçaları ve hücre kümelerinden arındırılır. Daha sonra, 2-5 dakika süre ile 75-100 devirli santrifüjden geçirilir.Bu takiben, en az iki kez yıkanır.

İzole Edilmiş Protoplastların Kültürü Protoplastlar sıvı besi ortamında veya agarlı ortamda kültüre alınır. Kültür işlemi sırasında protoplastlar sıcaklığı 25-28 derece ye ayarlanmış iklim odalarında 100–500 lux’lük ışık intensitesi altında veya karanlıkta inkube edilir.Protoplastlarda hücre zarları oluştuktan ve hücre bölünmesi başladıktan sonra sıvı ortamda bulunan protoplastlar agar ortamına taşınabilir.

Protoplast kültüründe besi ortamı hücre kültürleri için kullanılan besi ortamına benzer. Bu amaçla birçok bitki türlerine ait protoplastların kültüründe MS veya B5 ortamları kullanılmaktadır.Ancak, bu ortamlarda bazı değişikliklerin yapılması gerekir.Protoplast kültürü için besi ortamı; osmotik basınç düzenleyicileri, inorganik besin maddeleri, karbon kaynağı, vitaminler, organik azot ve büyüme düzenleyicilerini içerir. Osmotik basıncı düzenleyici olarak mannitol veya sorbitol kullanılır.

Protoplast kültürü için kullanılan besi ortamı hem nitrat hemde amonyum azotu içermelidir.Amonyum azotunun toksik etkisini azaltmak için besi ortamına suksinat gibi bir organik asit ilave edilebilir. Protoplast kültürlerinde karbon kaynağı olarak glikoz tercih edilir.Glikoz ve sükrozun birlikte kullanılması durumunda da bitki hücreleri iyi bir şekilde büyüyebilirler. Bazı besi ortamları ilave karbon kaynağı olarak 1-3mM riboz veya diğer pentoz şekerlerinden birini içerir.

Protoplast kültürleri için kullanılan vitaminler hücre kültürlerinde kullanılan thiamin, nikotinik asit ve pyridoxin gibi standart vitaminlerdir. Protoplast kültürlerinde kullanılan besi ortamları çoğu zaman bir veya daha fazla amino asit içerir. Besi ortamına ilave edilen % 1-5 konsantrasyonundaki hindistan cevizi sütünün protoplast kültürünü olumlu yönde etkilediği saptanmıştır.

Protoplast kültüründe hücre bölümlesini ve bitki rejenerasyonunu teşvik etmek için besi ortamına oksin ve sitokininlerin ilave edilmesi gerekir. Genellikle bu amaçla 2,4-D ve NAA gibi oksinler ve Kinetin, BAP ve Zeatin gibi sitokininler kullanılmaktadır.

Danışman: Yrd. Doç. Dr. Yılmaz KAYA KALLUS KÜLTÜRÜ Danışman: Yrd. Doç. Dr. Yılmaz KAYA Hazırlayanlar: Merve GÜNEŞ Zeynep KILIÇ Seher YILDIRIM Kübra METE 06.12.2018

Bitki biyoteknolojisinde kallus kültürü kullanım amaçları: Kallus; organize olmamış hücrelerin bir yığınıdır. Bazı bitki türlerinde mekanik yaralanma yerlerinde kallus ortaya çıkar. Ayrıca birçok bitki türlerinin değişik organ ve dokuları kallus oluşturmaya teşvik edilebilmektedir. Bitki biyoteknolojisinde kallus kültürü kullanım amaçları: İn vitro çoğaltma Ortaya çıkan somaklonal varyasyondan yararlanma Hücre kültürlerinin oluşturulması

Kallus Kökten kallus oluşumu Embriyodan kallus oluşumu

Kallus Kültüründe Kullanılan Eksplantlar; Birçok monokotiledonlarda kallus oluşturmak amacıyla en sık ve başarıyla kullanılan eksplant olgunlaşmamış embriyodur.Bu amaçla daha çok döllenmeden 10-15 gün sonra izole edilen embriyolar kullanılır.

Olgunlaşmamış embriyoların ekspant olarak kullanımının dezavantajları: Kullanılacak olgunlaşmamış embriyoların bitki türüne bağlı olarak belirli gelişme dönemlerinde izole edilmeleri gerekir. Çok erken veya geç dönemde izole edilen embriyolar arzu edilen derecede başarılı olmamaktadır. Diğer taraftan,F1 bitkilerinden embriyolar alındığında eksplantın fenotipinin bilinmemesi uygulamalı programlarda sorun yaratır.

Kallus oluşturmada yaygın olarak eksplantlardan birisi de genç çiçek durumlarıdır. Çiçek durumlarının eksplant olarak kullanılmasında bunların izole edildikleri andaki gelişme durumları kallus oluşumu ve kallusdan bitki rejenerasyonu açısından büyük önem taşır.

Nitekim,Hatipoğlu (1992) bir buğdaygil türü olan tüylü sakalotu bitkisinde genç çiçek durumlarının kültüre alınma sırasındaki boylarının kallus oluşumu ve bu kalluslardan bitki rejenerasyonunu önemli derecede etkilediğini saptamıştır.

Genç yaprak segmentleri de kallus oluşturma amacıyla sık kullanılan eksplantlardır. Yaprak segmentlerinden kallus oluşumu ve bitki rejenerasyonunda da en önemli faktör yaprağın gelişme dönemidir.

Bir eksplanttan kallus oluşumunu başlatmak için genellikle besi ortamına büyüme düzenleyicilerinin ilave edilmesi gerekir. Besi ortamına ilave edilecek büyüme düzenleyicisi tipi ve konsantrasyonu genotipe ve kulanılan eksplantın bünyesinde bulunan hormon içeriğine bağlıdır. Ayrıca besi ortamına ilave edilen büyüme düzenleyicieri yanında genotip,besi ortamının bileşimi ve fiziksel faktörler de kallus oluşumunu etkiler. Kallus indüksiyonu için genellikle MS ortamı veya bu ortamın modifikasyonları kullanılır.

Kallus Kültürü İndüksiyon ortamında kallus 2-3 cm çapına eriştiğinde, oluşan kallus eksplant kalıntılarından ayrılarak, yeni bir besi ortamına aktarılır ve kallusun büyümesine devam etmesi sağlanır. Bu durum bitki türüne ve kullanılan ekspanta bağlı olarak kültür başlangıcından itibaren 3-5 hafta sürer.

Somatik Embriyogenesis EKSPLANT Orgonogenesis Somatik Embriyogenesis KALLUS Direkt orgonogenesis İndirekt orgonogenesis İndirekt Embriyogenesis Direkt embriyogenesis

ORGANOGENESİS • Hücrelere ve dokulara baskı uygulayıp bazı değişikliklere sebep olarak sürgün veya kök taslağı diye adlandırılan tek kutuplu ve vasküler sistemi kökenini aldığı dokuya bağlı olan bir yapının meydana gelmesine yol açan işlemdir.

ORGANOGENESİS İndirekt organogenesis Direkt organogenesis Kallus Sürgün veya kök Sürgün veya kök Bitki Bitki

Avantajları; Hücre veya dokulardan yeni bitki bireyleri meydana getirmeye imkan tanıdığı için, generatif yoldan çoğaltılması zor olan bitkilerin üretimine kolaylıklar sağlamaktadır. Bitki transformasyon çalışmalarında oldukça önemlidir.

Dezavantajı; Bütün bitki türleri için evrensel bir rejenerasyon protokolü yoktur. Her bitki türü, hatta her bitki çeşidi için spesifik bir sistemin optimize edilmesi edilmesi gerekir.

SOMATİK EMBRİYOGENESİS Somatik hücre veya dokulardan embriyo oluşumu somatik embriyogenesis olarak adlandırılır. Oluşan embriyolar yumurta hücresinin döllenmesiyle oluşsan zigotik embriyolara benzer.

Somatik Embriyogenesis Direkt embriyogenesis İndirekt embriyogenesis Eksplant Eksplant Somatik embriyolar Kallus Pro-embriyolar Bitki Bipolar embriyolar

KALLUS KÜLTÜRÜNÜN UYGULANMASI Genç bir yaprak bitkiden alınır ve sterilize edildikten sonra küçük parçalara ayrılarak auxin içeren uygun besi ortamında kültüre alınır. Uygun kültür koşullarında muhafaza edilen bu yaprak ekplantatlarından kallus oluşur. Oluşan kallusun daha fazla büyümesi için, kallus yeni ortama aktarılır. Alt kültür işlemi tekrarlanabilir. Daha sonra kallusun rejenerasyonu için kallus rejenerasyon ortamına aktarılır.

Eğer elde edilen kallus embriyonik ise genellikle rejenerasyon ortamına büyüme düzenleyicisi ilavesi gereksizdir. Böyle bir besi ortamında somatik embriyolar çimlenerek sürgün ve köklü bitkicikleri oluştururlar. Oluşan bitkicikler yeterli derecede büyümeleri için kullanılan temel besi ortamının içerdiği makro ve mikro besin elementlerinin yarı konsantrasyonlarını içeren besi ortamına aktarılır. Bu ortamda şeker konsantrasyonu da azaltılır. Bitkicikler ışıklı ortamda ve uygun sıcaklık koşullarında 3-4 hafta büyümelerine devam ederler. Bu süre sonunda saksılara aktarılan bitkiler 3-4 gün sera içerisinde plastik örtü altında tutularak çevreye adaptasyonları sağlanır.

Eğer kallus emriyogenik değilse, sürgün oluşumu amacıyla sitokinin içeren besi ortamına aktarılır. Bu ortamda kallustan sürgün oluşumu gerçekleşir. Oluşan sürgünler auxin içeren besi ortamında kültüre alınarak köklendirilir. Oluşan köklü bitkiciklerin kültürüne somatik embriyogenesis yoluyla rejenerasyonda olduğu gibi devam edilir.

TEŞEKKÜR EDERİZ..

Bitki Doku Kültürü Dersi Dr. Öğr. Üyesi Yılmaz KAYA T.C ONDOKUZ MAYIS ÜNİVERSİTESİ TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİ BÖLÜMÜ HAPLOİD BİTKİ ÜRETİMİ Bitki Doku Kültürü Dersi Hazırlayanlar B. Abdullah Koçak Ahmet Hacıhamzaoğlu Selen Türe Serkan Çam Dr. Öğr. Üyesi Yılmaz KAYA Samsun 2018

1.HAPLOİD BİTKİ ÜRETİMİ Seksüel üremede mayoz bölünme sonucunda yarıya düşen kromozom sayısı döllenme sonucunda tekrar ikiye katlanır ve oluşan embriyo ebeveyn bitkinin taşıdığı kromozom sayısına benzer kromozoma sahip olur. Diploid bir bitkide mayoz bölünme olursa meydana gelen gametler ana bitkinin taşıdığı kromozom sayısının yarısı kromozom taşırlar. Böyle bir gametten döllenme olmaksızın bitki oluşursa, ana bitkinin taşıdığı kromozom sayısının yarısı kadar kromozoma sahip bu bitkiye monohaploid bitki denir.Tetraploid bitkiye ait gametlerden döllenme olmadan bitki oluşursa bu bitkiye dihaploid bitki denir.

1.1 Haploid Bitkilerin Bitki Islahında Kullanım Alanları Haploid bitkilerin bitki ıslahında kullanım alanları aşağıda verilmiştir. Haploid bitkilerde spontan olarak veya kolhisin denilen kimyasal maddenin uygulanması sonucunda kromozom katlaması yapılarak klasik ıslah yöntemine göre daha kısa sürede homozigot hatların elde edilmesi ıslah çalışmalarında zaman açısından süreyi kısaltır. Homozigot hatların elde edilmesi bilhassa yabancı döllenen bitkilerde büyük önem taşır. Bu tip bitkilerde yabancı döllenmenin etkisiyle heterozigotluk artar. 1.1.1 Islah Sürecinin Kısaltılması

Homozigot bireylerin elde edilmesi ise 6-8 generasyon kendilemeyle mümkün olmaktadır. Bu yöntem ise hem masraflıdır, hem de bireylerin kendine döllenmesi sonucu oluşan kuşaklarda kendileme depresyonunu ortaya çıkartır. Kendine döllenen bitkilerde gerçekleştirilen melezleme ıslahında arzu edilen genotiplerin elde edilmesi için, istenilen karakterler yönünden homozigot hatların elde edilmiş olması gerekir. Bu işlem ise 5-7 yılda mümkün olabilir.Bununla beraber melezlemeyle elde edilen F1 haploid bitkiler ve bunlardan da double haploid bitkilerin elde edilmesi 1 yıl gibi bir süre içerisinde gerçekleştirilir.

Özellikle mısır gibi kültür bitkilerinin hibrit çeşit ıslahında haploid bitkilerin elde edilmesi büyük önem arz eder. Bir hibrit çeşidin elde edilmesi için; melezleme işleminde kullanılacak materyallerin rekombinant kendilenmiş homozigot saf hat olması gerekir. 1.1.2 Poliploid Bitkilerde Kalıtımın İncelenmesi ve Arzu Edilen Karakterlerin Kalıtımı Poliploid bitkilerle yapılan çalışmalarda haploid bitkilerin elde edilmesi büyük avantajlar sağlamaktadır. Diploid seviyede kalıtımın incelenmesi, istenilen karakterlerin kombine edilmesi tetraploid seviyeye göre daha basittir. Autotetraploid bitkilerde bu durum özellikle söz konusudur.

1.1.3 Mutasyon Islahında Resesif Mutasyonların Ortaya Çıkarılması Mutasyon ıslahında resesif mutasyonların meydana gelmesinde monohaploid bitkiler önemli avantajlar sağlarlar. Mesela diploid bir bitkide AA genotipi Aa şeklinde mutasyon geçirmişse bu organizmanın genotipini AA genotipinden ayırmak olanaksızdır. Çünkü dominant yapıdaki AA geni çekinik a geninin etkisini kapatır. Haploid bitkilerde ise genlerden yalnızca birisine sahip olacağından mutasyona uğrayan bitkiler kolaylıkla belirlenebilir. Buna ek olarak haploid organizmaların hücrelerinde mutasyon oluştuğunda kimeraların meydana gelmesi de önlenir.

1.1.4 Kuşkonmaz Bitkisinde Süper Erkek Bitkilerin Elde Edilmesi Haploid bitkilerin elde edilmesindeki kullanım alanlarından bir tanesi kuşkonmaz (Asparagus officinalis) bitkisinde süper erkek bitkilerin elde edilmesidir. Çift evcikli olan kuşkonmaz bitkisinin dişileri XX, erkekleriyse XY genotipindedir. Döllenme sonucu meydana gelen bitkilerin yarısı dişi yarısı erkektir. Erkek bitkiler daha üstün verimlidirler, dişi bitkiler hasat olgunluğuna erişmeden önce hasat durumunda olurlar.

1.1.5 Somatik Hibridizasyon Haploid protoplastlar somatik hibridizasyon için daha uygun yapıya sahiptirler. Çünkü iki haploid protoplastın birleşmesi sonucu diploid somatik melez meydana gelir. Diploid protoplastlar kullanıldığında ise oluşan somatik melez tetraploid yapıda olur.

2. Haploid Bitki Elde Etme Yöntemleri Haploid bitkilerin yukarıda belirtilen önlemleri nedeniyle bitki ıslahçıları doğal olarak ve yapay olarak haploid bitkileri elde edebilmek için çok büyük çaba ve mesai harcamaktadırlar. Doğada karşımıza çıkabilen haploid bitki türü sayısı 100’den fazladır. Haploid bitkiler apomiksis veya parthonegenesis sonucu oluşmaktadır. Böylece döllenmemiş yumurta hücresi, erkek veya sinerjik çekirdeklerden haploid bitkiler oluşmaktadır. Haploid bitkilerin suni olarak elde edilmeside ışın uygulaması, ısı şoku, uzak akrabalarda melezleme, geç tozlama, döllenme kabiliyetinde olmayan çiçek tozları ile tozlama,farklı kimyasalların kullanılması ile yumurta hücresi,sinerjidler ve polen danesinden haploid bitkiler elde edilmektedir.

Haploid bitkilerin elde edilmesinde kullanılan in vitro teknikler aşağıda belirtilmiştir: Embriyo kurtarma tekniği Ovul kültürü tekniği Mikrospor kültürü tekniği 4) Anter kültürü tekniği

EMBRİYO KÜLTÜRÜ Verimi yüksek bitkilerin tohumlarından veya tohum taslaklarından embriyoların izole edilerek belli ortamlarda kültüre alınması embriyo kültürü olarak tanımlanmaktadır. Bu teknik ilk defa 1904 yılında Hannig tarafından uygulanmıştır. Embriyo kültürü embriyonel büyüme ve farklılaşma üzerine besinlerin, bitki büyüme düzenleyicilerinin ve diğer kimyasal ve fiziksel faktörlerin etkilerini incelemek için yararlı bir tekniktir.

Embriyo kültürü tipleri; 1-Olgun Tohum Embriyolarının Kültürü Gelişmesini tamamlamış tohumlardan izole edilen olgun embriyolar, tohumun çimlenmesini engelleyen dormansiyi ortadan kaldırmak amacıyla kültüre alınır. 2-Olgunlaşmamış Erken Bölünme Fazındaki Proembriyoların Kültürü Olgunlaşmamış embriyoların kültürü, genellikle normal koşullarda gelişmesini tamamlayamayan embriyolardan yaşama gücündeki bitkilerin elde edilmesi amacıyla yapılır.

Embriyo Kültüründe Amaç • Çimlenmesi çok daha zor olan tohumların çimlendirilmesi, • Genetik çalışmalarda ıslah süresinin kısaltılması, •Yeterince gelişememiş ve hibrit embriyoların yaşatılması, •Haploid bitki üretilmesi, •Hastalıksız bitki üretimi, •Tohumla üretimi zor olan bitkilerin üretimidir

Embriyo Kültüründe Başarıyı Etkileyen Faktörler 1-Genotip: Bazı bitki türlerin de embriyoların in vitro kültürü çok iyi iken bazı türler de çok güçtür. Hatta aynı türlerin genotipleri arasında bu açıdan büyük farklılıklar vardır. 2-Embriyoların İzolasyon Sırasındaki Gelişme Dönemi: Çok küçük olgunlaşmamış embriyoların invitro kültürde geliştirilerek bunlardan bitki elde edilmesi çok zordur. Gelişmeleri ilerlemiş durumdaki embriyoların invitro kültürü daha kolaydır.

3-Ana Bitkilerin Yetişme Koşulları Embriyo kültürü amacıyla kullanılacak donör bitkiler genellikle serada yetiştirilir. Aynı zamanda tarla koşullarında yetiştirilen bitkilerde bu amaçla kullanılabilir. Donör bitkilerin büyüme koşullarının iyileştirilmesi endosperm gelişmesinin daha iyi olmasını dolayısıyla da embriyoların daha iyi büyümesini sağlar. 4-Işık Bazı durumlarda izole edilmiş embriyolar 7-14 gün süre ile karanlık koşullara ihtiyaç duymaktadırlar. Bu karanlık dönemden sonra ışık koşullarında klorofil oluşumu gerçekleşir. 5-Oksijen Oksijen embriyo kültüründe önemli bir faktördür. Bazı durumlarda oksijen gereksinimi normal havanın oksijen içeriğinden daha fazla olabilir.

6-Besi Ortamının Bileşimi Olgunlaşmamış embriyolar olgun embriyolara göre daha kompleks besi ortamlarına gereksinim duyarlar.Aynı zaman da hem olgunlaşmamış hemde olgun embriyoların in vitro kültürün de besi ortamı makro ve mikro elementleri ile şeker içermelidir. Genellikle PH’ı 5-6 arasında değişen katı ortamlar kullanılır. Agarın genellikle %0,6-0,8 konsantrasyonları kullanılır.Yüksek agar konsantrasyonları embriyo büyümesini engeller. Embriyo kültürü için çok değişik mineral besi ortamları kullanılmaktadır. Embriyolar mineral solüsyonlara çok hassas olup, büyümeyi teşvik eden mineral solüsyonlar embriyolarda toksik etki yapabilmekte, toksik etki yapmayan mineral solüsyonlar ise embriyoların normal farklılaşmasını sağlayamamaktadır. Bundan dolayı embriyo kültürü için kullanılan mineral solüsyonlarda bu durumların dikkate alınması gerekmektedir.

Embriyo kültüründe şeker kaynağı olarak genellikle sakkaroz kullanılır Embriyo kültüründe şeker kaynağı olarak genellikle sakkaroz kullanılır. Fakat bazı durumlarda fruktoz ve glikoz daha iyi sonuç verebilmektedir. Genellikle embriyo kültüründe büyüme düzenleyicilerine ihtiyaç duyulmaz. Fakat bazı durumlar da ise besi ortamına ilave edilen düşük dozdaki IAA(indolacetic acid)’nın embriyo büyümesini olumlu yönde etkilediği belirlenmiştir. Embriyo kültüründe besi ortamına hindistan cevizi sütü,meyve ve sebze püreleri ile kazein hidrolizat gibi maddelerin ilavesi bazı durumlarda embriyo büyüme ve gelişmesini olumlu yönde etkileyebilir. Embriyoların in vitro kültürü sırasında büyüme ve gelişme sonucu embriyoların besin maddesi gereksinimleri değişeceği için bazı durumlarda alt kültür gerekli olabilmektedir. 7-Sıcaklık Embriyo kültüründe optimum sıcaklık bitki türüne göre farklılık gösterir. Normal olarak genellikle embriyolar 22-28°C’de kültür edilir

Embriyo Kültürü Tekniğinin Çalışma Mekanizması

OVÜL KÜLTÜRÜ -Döllenmemiş yumurta hücrelerinin haploid bitki elde etmek amacıyla in vitro koşullar altında kültüre alınmasıdır. -Birçok bitki türünde döllenmemiş yumurta hücresi yumurtalığın in vitro kültürü ile haploid bitkilerin elde edilme olasılığı araştırılmıştır. Ancak yumurta hücresinden kallus oluştuktan sonra sonra büyüme durmuş ve rejenerasyon gerçekleşmemiştir. -Bununla beraber buğday , arpa, çeltik ,mısır , şeker pancarı ve soğan bitkilerinde ovul kültürü tekniğiyle haploid bitkiler elde edilebilmiştir. -Ovul kültürü tekniği ile haploid bitki elde edilmesi çok yaygın olarak kullanılmamaktadır. Çünkü birçok bitki türünde ovüllerden haploid bitki elde etme frekansı çok düşüktür.Bu tekniğin Compositae familyası gibi bazı familyalarda anter ve mikrospor kültüründen daha başarılı olabileceği belirtilmektedir.

Brassica'larda türler arası melezlerin oluşturulmasında ovül kültürü (Seyis ve ark., 2005) Tekniğin Uygulanışı: Uygun olgunluktaki tomurcuklar emaskulasyon işlemine tabi tutulur. Sonra tozlaşma sağlanır ve yumurtalıklar 7-40 içerisinde hasat edilir. Yumurtalıklara yüzey sterilizisyonu işlemi uygulanır ve buradan besi ortamına alınır. Kültür ortamında çimlenme süresi 30-150 gün arası bir süre alır. Çimlenen tohumlar daha büyük bir besi ortamına alınır ve belli bir olgunluğa ulaşıldığı görüldüğünde toprağa aktarılır ve kolhisin ile muamele edilir.

MİKROSPOR KÜLTÜRÜ Mikrospor kültürü, henüz olgunlaşmasını tamamlamamış mikrosporların anterlerden izole edilerek in vitro koşullarda sıvı besin ortamlarında geliştirilmesi ve bunlardan haploid embriyoların elde edilmesi yöntemidir. Mikrospor kültürü konusunda ilk çalışma Kameya ve Hinata tarafından 1970 yılında yapılmıştır ancak mikrosporların kendi içerisinde bölünmesinden meydana geldiği kesin olarak ıspatlanamamıştır. Daha sonra mikrospor kültürü konusunda Nitsch ve Norreel (1973)’in Datura innoxia’ da yaptıkları çalışmada başarılı sonuçlar alınmıştır. Yapılan araştırmalar mikrospor kültürünün Brassica türleri, Gramineae türleri ve Nicotiana’da başarılı sonuçlar verdiğini göstermektedir.

Mikrospor kültürünün anter kültürüne göre üstünlüklerini şu şekilde sıralamak mümkündür: Anter dokularında bulunan engelleyeci maddeler ortamdan uzaklaştırıldığı için sorun olmaktan çıkar. Mikrosporlar ortamdaki besin maddeleri ile doğrudan temas halinde olduklarından besin maddelerini daha iyi bir şekilde alabilmektedir. Bazı türlerde (Örneğin: kolza) haploid embriyo verimi anter kültürüne göre daha yüksektir (Siebel ve Pauls, 1989). Gramineae familyasına ait türlerde (Örneğin: buğday) anter kültürüne oranla albino bitki oluşumu azalmaktadır (Holme ve ark., 1999). Gen transferi çalışmalarında da avantajlı bir tekniktir.

Mikrospor Kültürünün Yapılışı -Anter içerisindeki mikrosporlar izole edilir ve değişik çapta filtrelerden süzülerek mikrospor süspansiyonu sıvı besin ortamıyla karıştırılır istenilen gelince işlem tamamlanır. -Genel olarak ortamda yüksek miktarda şeker kullanılır. Şeker kaynağı olarak ise genellikle sakkaroz ve maltoz kullanılır. -Mikrospor yoğuluğu ise türden türe farklılık gösteren bir diğer faktördür.Örneğin karnabaharda 100.000 mikrospor/ml iken brokolide 20.000 mikrospor/ml. olarak belirtilmiştir. -Mikrosporların izole edilmesi türden türe farklılık göstermektedir.Bu sebeple her türe özgü izolasyon uygulaması bulunmuştur. Örneğin Brassica’larda NLN-B ortamı (%13 sakkaroz,hormonsuz,pH:6,1) kullanılmaktadır.

ANTER KÜLTÜRÜ TEKNİĞİ Günümüzde haploid bitkilerin elde edilmesinde yaygın olarak kullanılan teknik anter kültürü tekniğidir. Bu tekniğin diğer in vitro haploid bitki elde etme tekniklerine göre avantajı ise bir anter içerisinde binlerce mikrospor bulunması ve uygun bir in vitro kültür sistemi ortaya konabildiğinde bir anterden çok sayıda haploid bitki elde edilebilmesidir. 1967 yılında Bourgin ve Nitsch ilk defa Nicotiana sylvestris ve Nicotiana tabacum türlerinde anter kültürü yoluyla haploid bitkileri elde edilmiştir. Anter kültürünün temel prensibi; normal olarak erkek gameti oluşturacak olan polen hücresinin gelişimini durdurmak ve somatik hücrelerde olduğu gibi polen hücresini direkt olarak bir bitki oluşturmaya zorlamaktır.

Anter Kültüründe Başarıyı Etkileyen Faktörler Bugün anter kültürü tekniği uygulamasında; Soya fasulyesi,buğday,arpa ve mısır gibi bazı önemli kültür bitkilerinde anterlerden haploid bitki oluşma frekansı çok düşük olması Anter kültürü yoluyla elde edilen haploid bitkiler genetik ve kromozomal dengesizlik göstermekte Buğday,arpa gibi ekonomim öneme sahip bitkilerde anter kültürü ile elde edilen haploid bitkiler arasında yaşama gücü olmayan albino bitkiler ortaya çıkması gibi problemlerle karşılaşılmaktadır.

Genotip: Farklı bitki türleri ve aynı türün farklı genotiplerinin anter kültürüne farklı reaksiyon gösterdiği birçok araştırmada gözlemlenmiştir.Nitekim, 215 ekmeklik buğday çeşidi ile sürdürülen bir araştırmada ancak 93 genotipten yeşil haploid bitkiler elde edilebilmiştir. Donor Bitkilerin Fizyolojik Durumu Ve Yaşı: Çiçek gelişim sezonunun başlangıcında genç bitkilerden alınan çiçekler içindeki anterler büyüme peryodunun daha geç dönemlerinde alınan çiçeklerdeki anterlere göre anter kültürü için daha uygundur.

-Anterlerin izole edileceği çiçek tomurcukları yüzeysel dezenfeksiyon işlemine tabi tutulurlar. -Tomurcuklardan alınan anterler steril besi ortamlarına konulur.Genellikle agarla katılaştırılmış besi ortamlarına konulurlar. -Petriye dikim işlemi yapılır ve petri hava almayacak şekilde sarılır. -Petri içerisindeki anterler inkübasyon için farklı koşullara alınabilmekte bu durum türden türe değişiklik göstermektedir. -Kültürün 40. gününde embriyoların gelişimi gözle görülebilmektedir.Buna direkt androgenesis denmektedir. -Bazı türlerde ise önce kallus oluşup sonrasında organogenesis yoluyla haploid bitki elde edilir.Buna da indirekt androgenesis denir.

POLEN GELİŞME DÖNEMİ Mayoz bölünme sonrası oluşan tetradlar ve olgun polenlerden bazı durumlarda haploid bitkiler elde edilebilmesine karşılık,en yüksek haploid bitki frekansı anterlerin kültüründen elde edilmektedir. Polen gelişme evreleri; Erken tek çekirdekli dönem, orta erken tek çekirdekli dönem, orta tek çekirdekli dönem, mitoz başlangıcı ve iki çekirdekli dönem olarak sıralanmaktadır.

ANTERLERE SOĞUK UYGULAMASI Haploid bitki üretimi için anterlerin veya izole edilmiş mikrosporların kültürü ‘’anter kültürü’’ olarak bilinir. Bu kültürde anterler içinde bulunan polenlerin gelişme dönemi, anter örneklerinden hazırlanan preperatların mikroskop altında incelenmesi ile belirlenir.

Birçok bitki türünde anterler kültüre alınmadan önce belirli bir süre soğuk koşullarda muhafaza edildiklerinde, kallus oluşum frekansı büyük bir artış göstermektedir. Uygulanacak soğuğun derecesi ve süresi bitki çeşidine göre değişkenlik göstermektedir. Anterlere soğuk uygulanmasının anter reaksiyonuna olumlu etki mekanizması tam olarak bilinmemektedir.

Soğuk uygulama sonrası zayıf anter ve mikrosporların ölmesi sonucu kültüre alınma esnasında yaşama gücü yüksek olan anterler kültüre alınmış olmaktadır. Aynı zamanda soğuk uygulama ile anter duvarlarının özellikle de tapetum tabakasının yaşlanmasını geciktirmektedir. Bu durum ise daha fazla sayıda mikrosporun gametofitik gelişme seyrine yönelmesine neden olmaktadır.

BESİ ORTAMININ BİLEŞİMİ Besi ortamının bileşimi, yalnız anter kültüründe başarıyı değil aynı zamanda polen gelişiminin şeklinide belirleyen bir faktördür. Diğer tüm kültür çeşitlerinde olduğu gibi anter kültüründe de tüm bitkilerde iyi sonuç verecek bir besi ortamı tavsiye etmek olanaksızdır. Anter kültürü çalışmalarında sıvı veya katı ortam kullanılmaktadır ancak sıvı ortamda gaz değişimi olmadığı için genellikle başarısız sonuç vermektedir.

Katı ortamlarda yaygın olarak kullanılan katılaştırıcı madde agardır Katı ortamlarda yaygın olarak kullanılan katılaştırıcı madde agardır. Son yıllarda anter kültürü çalışmalarında kullanılabilecek başka bir madde arayışı sonucunda,agar yerine arpa nişastasının kullanılabileceği saptanmıştır.

Hem besi ortamının osmozunu düzenleyen hemde karbon kaynağı olan şekerler anter kültüründe değişen miktarlarda kullanılır. Özellikle buğday,arpa,çeltik ve patateste yüksek şeker konsantrasyonunun kültürdeki başarıyı arttırdığı bilinmektedir. Karbon kaynağı olarakta genellikle sukroz kullanılmaktadır. Yine buğday ve tütünde besi ortamına eklenen patates ekstraktı haploid bitki frekansını arttırmaktadır.

Ayrıca bazı bitki türlerinde besi ortamına 5-20 gr/l konsantrasyonlarında ilave edilen aktif karbonun anter kültüründe başarıyı olumlu yönde etkilediği ortaya çıkmıştır.

Mikrosporların in vitro gelişimi Kültüre alınan anterler içindeki mikrosporlar farklı şekillerde gelişme göstererek haploid bitkieri oluştururlar. Mikrosporların in vitro gelişme seyri aşağıdaki şekillerde ceryan edebililir

Polen danesinde çekirdek bölünmesi ile büyük bir vejetatif çekirdek ve küçük bir generatif çekirdek oluşur. Oluşan genertif çekirdek dejenere olur ve dormant duruma geçer. Vejetatif çekirdek bölünmeye devam eder ve haploid bitkiyi oluşturur. Genellikle polenden haploid bitki oluşumu bu yolla gerçekleşir. Bazen de vejetatif çekirdek dejenere olur veya dormant durumuna geçer. Generatif çekirdek bölünerek haploid bitkiyi oluşturur. Bu yolla haploid bitki oluşumu çok yaygın değildir. Bazı durumlarda polen danesindeki çekirdek mitoz bölünmesi ile eşit büyüklükte iki çekirdek oluşturur. Bu iki simetrik çekirdek bölünerek haploid bitkiyi oluştururlar veya iki çekirdek birleşerek diploid bir çekirdek oluştururlar. Bu iki çekirdeğin bölünmesi ile diploid homozigot bitkiler oluşur.

Mikrosporlardan haploid bitki oluşumu Haploid bitkiler izole edilmiş anterler içindeki mikrosporlardan iki yolla oluşur. Direkt olarak : Polen danesinden direkt olarak bir embriyo oluşur ve bu embriyo çimlenerek haploid bitkiyi oluşturur. İndirekt olarak: polen danesinden önce kallus oluşur. Daha sonra bu kallustan embriyogenesis veya organogenesis yoluyla haploid bitki oluşur.

Haploid Bitkilerde Kromozom Katlaması ve Homozigot Bitkilerin Elde Edilmesi Anter kültüründe polen danelerinden oluşan bitkilerin normal olarak haploid kromozom sayısına sahip olmaları gerekir. Ancak bazı durumlarda kültür sırasında haploid hücrelerde kromozom katlanması ortaya çıkmakta ve oluşan bitkiler diploid olmaktadır. Arpa, patates, kolza ve çavdar da anterlerden rejenere olan bitkilerin % 70 i diploid olabilmektedir. Buna karşılık mısır ve buğdayda bu oran çok daha düşüktür.

Anter kültürü sırasında haploid hücrelerden diploid bitkilerin oluşmasına iki faktör neden olmaktadır. Bunlar ; Endomitisis: Hücre bölünmesi olmaksızın çekirdek bölünmesi ile hücredeki kromozom sayısının iki katına çıkmasına endomitosis denir. Haploid hücreler genellikle kültür sırasında endomitosis yoluyla kromozom sayılarını iki katına çıkarma eğilimi gösterirler. Polen Çekirdeklerinin füzyonu : Polen içerisinde bulunan vejetatif veya generatif çekirdek bazı durumlarda birleşerek diploid bir çekirdek oluşmakta ve bu çekirdekten de diploid bitkiler oluşmaktadır.

Haploid mikrosporlardan diploid bitkilerin rejenere olmasına neden olan endomitosis ve çekirdek füzyonunun ortaya çıkışına neden olan faktörler; Genotip Anterlerin kültüre alınması sırasında mikrosporların gelişme devresi Besi ortamında bulunan büyüme düzenleyicilerinin konsantrasyonu İn vito kültür süresinin uzunluğu Kültür koşulları dır.

Anter kültürü yoluyla elde edilen bitkilerin haploid veya diploid oldukları bitkinin dış görünüşlerinden ayırt edilebileceği gibi , bitkilerin kök uçlarndan hazırlanan preparatlarda kromozom sayımları ile kesin olarak saptanabilir. Haploid olduğu saptanan bitkilerde kromozom katlanması yapılması gerekir. Çünkü bu bitkiler fertil yeteneğine sahip değillerdir ve tohum tutamazlar. Haploid bitkilerde kromozom sayısının katlanması genellikle bitkilerin kökleri veya sürgün uçlarının kolhisin çözeltisi içerisinde belirli süre tutulması ile yapılır. Anter kültüründe kromozom katlanması daha erken dönemde de yapılabilir.

TEŞEKKÜRLER

BİTKİ DOKU KÜLTÜRÜ DERSİ T.C ONDOKUZ MAYIS ÜNİVERSİTESİ ZİRAAT FAKÜLTESİ TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİ BÖLÜMÜ BİTKİ DOKU KÜLTÜRÜ DERSİ SOMAKLONAL VARYASYON ve SOMATİK MELEZLEME HAZIRLAYANLAR: Ceren ÖZEN, Gizem TERZİ, M. Tuğrul ARIK

A) Somaklonal varyasyon nedir? 1) İn vitro kültürde genetik değişikliklere neden olan faktörler 2) Somaklonal varyasyonun bitki ıslahında kullanılması B) Somatik melezleme nedir? 1) Somatik melezlerin elde edilmesi 2) Somatik melezlemenin bitki ıslahında önemi 3) Somatik melezlemede karşılaşılan problemler

A) SOMAKLONAL VARYASYON Bitkilerin somatik hücrelerden in vitro çoğaltılması ve rejenerasyonunda doğal olarak rejenere olan bitkilerin fenotip ve genotip olarak in vitro kültürde kullanılan eksplantın alındığı bitkiye benzemesi gerekir. Çünkü, in vitro kültürde hücrelerin mitoz yoluyla bölünmeleri söz konusudur. Fakat kallus kültürlerinden rejenere olan bazı bitkilerde gözlenen değişiklikler in vitro kültürde somatik hücrelerden rejenere olan bitkilerin genetik stabilite göstermesi gerektiği şeklindeki düşüncenin değişikliğine sebep oldu ( Lörz, 1985). Bugün in vitro kültür sırasında ortaya çıkan ve rejenere olan bitkilerde gözlenen değişiklikler Somaklonal Varyasyon olarak adlandırılmaktadır (Larkin ve Scowcroft 1981).

İn vitro kültür yoluyla çoğaltılan bitkilerde gözlenen varyasyona bitkilerin genetik yapılarında ortaya çıkan değişiklikler neden olabileceği gibi, kalıtsal olmayan faktörler de bu tip varyasyonlara neden olabilir (Geier, 1985). İn vitro kültürde rejenere olan bitkilerde gözlenen ve nedeni kalıtsal olmayan değişiklikler dölden döle geçmezler. Bu tip değişikliklere Epigenetik Değişiklikler denir.

Örneğin, in vitro kültür sırasında kullanılan besi ortamı, besi ortamındaki sitokinin ve auxinler bu tip değişikliğe neden olabilirler. Buna karşılık, in vitro kültürde rejenere olan bitkilerin genetik yapılarındaki değişiklikler nedeniyle ortaya çıkan varyasyon kalıtsaldır ve bu değişiklikler dölden döle geçerek devam eder.

İn vitro kültürde bitkinin genetik yapısında ortaya çıkan değişiklikler; Kromozom sayısındaki değişiklikler, Kromozom yapısındaki değişiklikler ve Gen mutasyonları şeklinde ortaya çıkar.

A) Kromozom Sayısındaki Değişiklikler Aneuploidi (bitkinin normal kromozom sayısından eksik veya fazla kromozoma sahip olması) Poliplodi (bitkinin normal kromozom sayısının katlanması) in vitro kültürde rejenere olan bitkilerde sık rastlanan kromozom sayı değişiklikleridir. Bitkinin kromozom sayısında ortaya çıkan değişiklikler bitkinin yapraklarından veya kök uçlarından hazırlanan preperatlarda mitoz bölünmenin metafaz safhasında kromozom sayımları ile saptanabilir. Kromozom sayısındaki değişiklikleri kallus veya hücre kültürlerinde de saptamak mümkündür. Bugüne kadar yapılan araştırmalarda buğday, arpa, çavdar, mısır, çeltik, patates, tütün gibi birçok bitkinin in vitro kültürde rejenere olan rejeneratlarında aneuploidi ve poliplodiye rastlanmıştır.

B) Kromozom Yapısındaki Değişiklikler Deletion (bir kromozomun bir parçasının kaybolması) Duplikation (bir kromozomdan kopan bir parçanın söz konusu kromozomun homoloğu üzerinde koptuğu bölgeye benzer kısma birleşmesi) Inversion (bir kromozomun bir parçasının 180° dönmesi) Translokasyon (bir kromozomun bir parçasının koparak homolog olmayan bir kromozoma eklenmesi) gibi kromozom yapı değişiklikleri (kromozom mutasyonları) ise bitkinin eşey hücrelerinde mayoz bölünmenin incelenmesi ile saptanabilir. Fakat bu tip değişikliklerin küçük kromozomlu bitkilerde belirlenmesi oldukça güçtür. Yulaf bitkisi üzerinde sürdürülen araştırmalarda kallus kültürlerinden rejenere olan bitkilerde kromozom yapı değişiklikleri saptanmıştır (MacCoy ve ark, 1982).

C) Gen Mutasyonları Gen mutasyonlarının belirlenmesi ise oldukça güçtür. Bu tip mutasyonların belirlenmesinde kromozom bandlama tekniği, elektroforez tekniği ve RFLP tekniği gibi tekniklerden yararlanılır. Bu tip mutasyonlar resedif durumda olduğunda, bunları bitkilerde gözlemek olanaksızdır. Bu tip mutasyonları ortaya çıkarmak için bitkinin kendilenmesi ve ortaya çıkan döllerin gözlenmesi gerekir.

1) İn Vitro Kültürde Genetik Değişikliklere Neden Olan Faktörler Bugüne kadar in vitro kültürde ortaya çıkan genetik değişimlerin nedenleri çok tartışılmıştır. Ancak bu değişimlere neden olan faktörler tam olarak açıklanamamıştır. Bununla birlikte bazı faktörlerin in vitro kültürde genetik değişimlerin ortaya çıkmasında belirleyici faktörler eden olduğu ortaya konmuştur. Bu faktörler aşağıda açıklanmıştır.

1.0 İn Vitro Rejenerasyon Yöntemi Meristem, sürgün ucu ve tomurcuklardan direkt olarak herhangi bir kallus fazı olmaksızın rejenere olan bitkiler büyük bir genetik stabilite gösterirler. Bu nedenle mutlak genetik stabiliteye gereksinim duyulan durumlarda in vitro çoğaltma için meristem, sürgün ucu ve tomurcukların kullanılması önerilir. Kallus fazını takip eden bir rejenerasyonda genetik varyabilitenin ortaya çıkma şansı rejenerasyonun organogenesis veya somatik embriyogenesis yoluyla ceryan etmesine bağlıdır. Yapılan araştırmalar, genellikle somatik embriyogenesis yoluyla rejenerasyonda çok büyük genetik anormalliklere rastlanmadığını ortaya koymuştur (Vasil, 1987). Buna neden olarak, somatik embriyogenesiste oluşan somatik embriyoların tek hücre orjinli oldukları ve sadece normal genetik yapıdaki hücrelerden somatik embriyoların oluştuu gösterilmektedir. Embriyogenik olmayan kallustan organogenesis yoluyla rejenere olan bitkilerde genellikle büyük genetik varyasyonlara rastlanmaktadır.

Anthurium Andraeanum bitkisinin in vitro rejenerasyonu 1) Yaprak eksplantatından kallus indüksiyonu 2) Yaprak türetilmiş kallustan çoklu sürgünlerin rejenerasyonu 3) Oluşan kallustan çoklu sürgünlerin rejenerasyonu 4) Çoklu sürgünlerin uzaması ve uzaması 5) Rejenere sürgünlerden köklerin indüksiyonu 6) Toprağa ekimi ve büyümesi

1.0 İn Vitro Rejenerasyon Yöntemi Meristem, sürgün ucu ve tomurcuklardan direkt olarak herhangi bir kallus fazı olmaksızın rejenere olan bitkiler büyük bir genetik stabilite gösterirler. Bu nedenle mutlak genetik stabiliteye gereksinim duyulan durumlarda in vitro çoğaltma için meristem, sürgün ucu ve tomurcukların kullanılması önerilir. Kallus fazını takip eden bir rejenerasyonda genetik varyabilitenin ortaya çıkma şansı rejenerasyonun organogenesis veya somatik embriyogenesis yoluyla ceryan etmesine bağlıdır. Yapılan araştırmalar, genellikle somatik embriyogenesis yoluyla rejenerasyonda çok büyük genetik anormalliklere rastlanmadığını ortaya koymuştur (Vasil, 1987). Buna neden olarak, somatik embriyogenesiste oluşan somatik embriyoların tek hücre orjinli oldukları ve sadece normal genetik yapıdaki hücrelerden somatik embriyoların oluştuu gösterilmektedir. Embriyogenik olmayan kallustan organogenesis yoluyla rejenere olan bitkilerde genellikle büyük genetik varyasyonlara rastlanmaktadır.

1.1 Kullanılan Eksplantat Bir bitki türünde kromozom sayısı sabittir. Fakat bu sabit kromozom sayısı bitkinin meristematik dokuları ve eşey hücrelerinin oluştuğu dokular için geçerlidir. Yapılan araştırmalarda, bir çok bitki türlerinde farklılaşmış somatik dokuların farklı kromozom sayısına sahip hücrelerden oluştuğu ortaya çıkmıştır. Polysomatik türler olarak adlandırılan bu türlerin somatik hücrelerinde endoreduplikasyon ve endomitosis olayları sonucu poliploidizasyon ortaya çıkmaktadır. Böyle bir bitkiden alınan eksplantatdan in vitro kültürde farklı kromozom sayısına sahip bitkiler ortaya çıkabilmektedir. Genellikle poliploid türler in vitro kültürde diploid türlere göre daha fazla genetik varyasyon göstermektedir. Kullanılan eksplantatın genotipi de in vitro kültürde genetik değişikliklerin ortaya çıkmasında etkili olabilmektedir.

1.2 Besi Ortamının Bileşimi İn vitro kültürde kullanılan besi ortamının bileşimi özellikle auxin ve sitokinin içeriği in vitro kültürde genetik stabiliteyi etkilemektedir. Tütünde yapılan araştırmalar besi ortamında bulunan auxin ve kinetinin oranının hücre popülasyonunda farklı poliploidi düzeyindeki hücrelerin oranını değiştirdiğini ortaya koymuştur. Ayrıca besi ortamına yüksek konsantrasyonda ilave edilen BA’nın somaklonal varyasyonu arttırdığı saptanmıştır. Büyüme düzenleyicileri dışındaki besi elementi komponentleri de in vitro kültürde genetik stabiliteyi etkileyebilmektedir.

1.3 Alt Kültür Sayısı Genel olarak alt kültür sayısı arttıkça ve kültür süresi uzadıkça in vitro kültürde genetik varyasyonun ortaya çıkma şansı artmaktadır. Alt kültür sayısının artması ile kallu ve hücre kültürlerinde rejenerasyon kapasitesi azalmaktadır. Rejenerasyon kapasitesindeki bu azalmanın ortaya çıkan genetik anormalliklerle ilgili olabileceği üzerinde durulmaktadır.

2) Somaklonal Varyasyonun Bitki Islahında Kullanılması İn vitro kültürde ortaya çıkan somaklonal varyasyondan ıslah programlarında yararlanmak için büyük çabalar harcanmaktadır. Ancak bugün bu konuda erişilen düzey henüz yeterli düzeyde değildir. Çünkü in vitro kültürde ortaya çıkan varyasyonu hücre düzeyinde selekte etmek uygun seleksiyon yöntemleri ortaya konamamıştır. Bu nedenle somaklonal varyasyonun bitki ıslahında kullanılması bilinen mutasyon ıslahına göre bir avantaj sağlamamaktadır. Günümüzde bazı hastalıkların toksinlerine karşı in vitro seleksiyon yöntemleri geliştirilmiş ve bitki ıslahı programlarında kullanılmaya başlanmıştır.

Stres faktörleri için in vitro seleksiyonu yapmak mümkündür. Kolza (Brassica napus L.) bitkisinde Phoma lingam patojenine Yoncada (Medicago sativa) Verticullum sp. Patateste (Solanum tuberosum) Alternaria solani Stres faktörleri için in vitro seleksiyonu yapmak mümkündür.

B) SOMATİK MELEZLEME 1970 yılına kadar genetik materyalin bir bitkiden diğer bir bitkiye aktarılması ancak seksüel yol ile mümkündü. Bu yolla genetik materyal aktarılmasında; baba bitkiden gelen polen daneleri içindeki haploid generatif çekirdek ana bitkinin embriyo kesesi içinde bulunan yumurta hücres ile birleşerek yeni bir bitki oluşturmaktadır. Oluşan bu bitki genetik karakterlerinin yarısını anadan yarısını babadan almaktadır. Seksüel üremede oluşan bitkinin sitoplazmasında bulunan genetik karakterler anadan gelmektedir.

1970 yılından sonra bitki biyoteknolojisinde sağlanan gelişmeler sayesinde bugün bir bitkiden diğerine genetik materyal aktarılması seksüel olmayan yollarla da yapılabilmektedir. Bir hücreden diğer bir hücreye generatif olmayan yollarla genetik materyal aktarılmasına Genetik Manipulasyon adı verilmektedir.

Günümüzde bitkilerde faklı genetik manipülasyon teknikleri uygulanabilmektedir. Bu teknikler aşağıdaki şekildeki gibi sıralanabilir: Somatik ve Sitoplazmik Melezleme Gen Aktarılması Çekirdek, Kromozom, Kromozom Parçası ve Hücre Organellerinin Aktarılması

1970 yılında Power ve arkadaşları, 1971 yılında ise Power ve Cocking ilk defa mısır protoplastı ile yulaf protoplastını birleştirmeyi başarmışlardır (Pierik, 1987). Ancak, söz konusu araştırıcılar bu somatik melezlemeler sonucu melez bitkileri elde edememişlerdir. Carlson ve arkadaşları 1972 yılında Nicotiana Glauca bitkisinin protoplastları ile Nicotiana Langsdorffii bitkisinin protoplastlarını birleştirerek ilk somatik melezleri elde etmişlerdir.

1) SOMATİK MELEZLERİN ELDE EDİLMESİ Somatik melezlerin elde edilebimesi için aşağıdaki işlemlerin yapılması gerekmektedir. 1. Hücre duvarlarının enzimlerle parçalanarak protoplastlarının elde edilmesi 2. İki farkli türe ait protoplastların birleşiminin sağlanması 3. Somatik melezlerin selekte edilmesi 4. Melez protoplastların kültür edilmesi 5. Melez bitkilerin rejenerasyonu  

Somatik melezlemeden sonra en büyük problem somatik melezleri ayırt etmektir.Karışık bir protoplast popülasyonundan melez protoplastların selekte edilmesinde bir çok yöntem kullanılmaktadır. Direkt izolasyon: Bu yöntemde, protoplastlar mikroskop altında incelenerek füzyona uğramış protoplastlar direkt olarak izole edilmektedir. Gözle izolasyon: Bu yöntemde, klorofil içermeyen ve tipik sitoplazmik kenarlara sahip bir protoplast, kloroplast içeren protoplastlarla füzyona uğradığında melez protoplastın kloroplast içermesi ve tipik sitoplazmik kenara sahip olması ile ayırt edilmektedir.

Protoplastların boyanması: Bu yöntemde, iki türün protoplastları farklı boyalarla boyanmaktadır. Protoplast füzyonundan sonra elde edilen protoplast populasyonu hücre ayırt edici olarak adlandırılan bir düzenekten geçirilir. Bu düzenekte protoplastlar lazer ışınından geçer. Bu geçiş sırasında hücreler ışık enerjisini absorbe eder. Bu enerjinin bir kısmı farklı renklerdeki floresans ışığı olarak etrafa saçılır. Etrafa saçılan bu ışığın rengine göre melez protoplastlar ayırt edilir. Fiziksel karakterlere göre seleksiyon: Bu yöntemde, melez protoplastlar ile füzyona uğramamış protoplastlar arasındaki elektrik yükü farklılığından yararlanılarak melez protoplastlar seçilir.

Genetik özelliklerinden yararlanarak seleksiyon: Bu yöntemde, örneğin herhangi bir kimyasala karşı rezistant olan bir türün protoplastları ile füzyonu uğratılır.Elde edilen protoplast popülasyonu her iki kimyasalı içeren solüsyonda kültür edildiğinde, yalnızca melez protoplastlar yaşayabileceğinden bunlar kolaylıkla ayırt edilebilir. Heterosis etkisinden yararlanma: Klorofil eksikliği gösteren protoplastlar normal klorofilli protoplastlarla füzyona uğradıgında ortaya çıkan melez hücreler her iki ebeveynden daha iyi büyüme göstermektedir.

Pamuk (Gossypium hirsitum)

2) SOMATİK MELEZLEMENİN BİTKİ ISLAHINDA ÖNEMİ Somatik melezlemenin bitki ıslahında önemi Bilinen klasik ıslah yöntemleriyle gerçekleştirilemeyen melezlemeleri somatik melezleme ile gerçekleştirmek mümkündür. Örneğin, kültür patatesi (Solanum tuberosum) bir çok hastalığa karşı çok hassastır. Yabani bir patates türü olan Solanum brevidens ise yumru oluşturmayan, fakat bir çok hastalığa dayanıklı bir türdür. Bu iki türü bilinen klasik yöntemle melezleyerek, kültür patatesine hastalığa dayanıklılık karakterlerini aktarmak olanaksızdır.Somatik melezleme yoluyla bu iki türün protoplastlarının füzyonu ile hem hastalıklara dayanıklı, hem de yumru oluşturan melez patates bitkilerini elde etmek mümkün olmuştur.

Kolkisinin uygulaması ile tetraploid bitkilerin elde edilmesi başarısız olduğunda somatik melezleme alternatif bir yöntem olarak kullanılabilir. Seksüel organları anormal olan veya erkek kısırlık gösteren türler arasında somatik melezlemeler yapmak mümkündür. Generatif döneme erişmeleri çok uzun süren türleri, bu dönemi beklemeden melezlemeye olanak sağlar. Seksüel üremede baba bitkinin yalnızca çekirdekte bulunan genetik karakterleri yavrulara aktarılır.Somatik melezlemede ise oluşan melez her iki ebeveynin hem çekirdek, hem de sitoplazmada bulunan genetik karakterlerini taşır.

3) SOMATİK MELEZLEMEDE KARŞILAŞILAN PROBLEMLER Protoplast füzyonundan sonra melez protoplastları ayırt etmek için halen etkin bir seleksiyon yöntemi yoktur. Oluşan somatik melez genellikle genetik olarak dengesizdir.Bu nedenle özellikle çok farklı türlerin somatik melezlemelerinde oluşan melezler yaşama gücünde değildir. Somatik melezleme sonucu oluşan bitkiler büyük bir varyasyon gösterir.

Protoplast füzyonu sonunda bazı durumlarda iki protoplastın çekirdekleri birleşmeyerek ayrı ayrı bölünmeye devam eder. Sonuçta kimerik karakterde kallus oluşur. Oluşan bu kallustan rejenere olan bitkiler melez özelliği göstermez. Günümüzde yalnız belirli sayıdaki türler arasında somatik melezlemeler yapmak mümkün olmaktadır. Çünkü bir çok türde henüz rejenere olabilir protoplast kültürleri elde edilememiştir. Örneğin buğdaygiller familyasında çeltik dışındaki türlerde rejenere olabilir protoplast kültürlerinin elde edilmesi oldukça güçtür.

SONUÇLAR Bitki ıslahında varyasyon meydana getirmenin zor olduğu durumlarda avantajlı olarak değerlendirilen somaklonal varyasyon yeni bir kaynak olarak görülmektedir. Bilinen klasik ıslah yöntemleriyle gerçekleştirilemeyen melezlemeleri somatik melezleme ile gerçekleştirmek mümkündür.