400100710021-Bitkilerde Fonksiyonel Genombilim http://biotek.ankara.edu.tr/ 400100710021-Bitkilerde Fonksiyonel Genombilim Prof. Dr. Ali ERGÜL Ankara Üniversitesi, Biyoteknoloji Enstitüsü

HAFTA-1 Bitki Genom Yapısı HAFTA-2 HAFTA-3 RNA İzolasyonu HAFTA-4 RNA İzolasyonu-UYGULAMA HAFTA-5 Bitkilerde Gen İfadesi ve Analizleri: Real Time PCR HAFTA-6 Real Time PCR-UYGULAMA HAFTA-7 HAFTA-8 Bitkilerde Gen İfadesi ve Analizleri: Mikroarray-RNA dizileme HAFTA-9 HAFTA-10 Bitkilerde Ters Genetik -miRNA HAFTA-11 Tüm Genom Dizileme Çalışmaları HAFTA-12 Bitki Genom Projelerine Genel Bakış HAFTA-13 Bitkilerde Genom Düzenlenmesi (CRISPR/Cas9) HAFTA-14 Moleküler Tarım

HAFTA 5:Bitkilerde Gen İfadesi ve Analizleri: Real Time PCR

Real Time PCR PCR replikasyonun invitro ortamda gerçekleştiridiği bir yöntemdir. Real time PCR, nükleik asit amplifikasyonu ile eş zamanlı olarak artış gösteren floresans sinyalin ölçülmesi ile kısa sürede, kantitatif sonuç veren bir PCR yöntemidir. Ticari olarak geliştirilmiş üç tipi bulunmaktadır. Bunlar LightCycler (Roche), Tagman (PE Biosystem) ve iCycler (BIO-RAD)’dır.

Real Time PCR Her kuyucuğa öncelikle florasan ışık gönderilir ve geri gelen ışıma toplanır. PCR reaksiyonuna florasan problarik, (dizi spesifik , çift sarmal yapıyı tanıyan boyalar) konur ve böylece online şekilde döngü izlenebilir.

Real Time PCR PCR’da esneklik sağlar Hızlıdır. Kısa sürede çoklu sonuç alınabilir. Doğruluk tekrarı mümkündür Çoklu hedefin aynı anda analizine olanak sağlar. Her türlü laboratuarda çalışılmaya olanak sağlar.

Real Time PCR SYBER Green Hibridizasyon problar Hidroliz problar

SYBER Green SYBER green çift zincir DNA’nın minör grubuna bağlanır. SYBER green melting körv analizine olanak sağlar. Gen ekpresyonu analizlerinde total RNA izole edilir ve çift zincirli cDNA’ya çevrilir ve kantitatif olarak miktar tayini yapılması sağlanır.

Real Time PCR Bunun için öncelikle bilinen cDNA konsantrasyonlarına karşı Ct (cycle point treshold) değerlerinin olduğu standart eğri oluşturulmalıdır. Daha sonra bilinmeyen örneğin Ct değeri grafiğe yerleştirilerek konsantrasyon belirlenir. Buna mutlak kuantikasyon denir. Sınırı spesifik olmayıp yalnızca çift zincire bağlanmasıdır.

Hibridizasyon Propları 3’ ucu (530 dalga boyu) florasan işaretlidir, 5’ ucunda (640 dalga boyu) ise başka bir prop bağlıdır. 3’ ucu normalde aldığı enerjiyi geri salar. Oysa iki prop bir arada iken (maksimum iki baz uzaklıkta) 3’ ucundaki probun saldığı enerjiyi 5’ ucundaki prop alır ve 640 dalga boyunda ışıma verir. Işıma anneling basamağında alınır. Buna FRET (florasans rezonans enerji transferi) denir. SNP analizine olanak sağlar.

Hidroliz Propları Hidroliz proları çalışmaları esnasında parçalandıkları için tekrar kullanılamazlar. Dizi spesifik problardır. Quenter( söndürücü) ve reporter (haberci) olmak üzere iki prop vardır. Işımanın olabilmesi için iki probun bir arada olmaması gerekir. Uzama başlayıp Quenter (söndürücü) parçalandığında ancak reporter (haberci) prop ışıma verebilir. Yani florosan ışıma PCR’ın elongasyon basamağında alınabilir. Işımanın şiddeti PCR ürünü ile doğru orantılıdır. Melting Curve analizi yapılamaz.

Real-Time PCR Total veya poliA RNA üzerinden revers transkriptaz enzimi aracılığı ile (random hekzamer yada oligo dt) cDNA sentezi yapılır. Gen spesifik ekzon primerleri ile PCR yapılır. Yüksek hassasiyette miktar tayini yapılabilmektedir.

Real-Time PCR Kantitatif tayin: SYBER green –hidroliz-hibridizayon Melting körv: SYBER green hibridizayon amaç: PCR ürünü özğüllüğü ve SNP analizleridir.

Real-Time PCR

Real-Time PCR

Real-Time PCR

Real-Time PCR

Ders Kapsamında Yararlanılan Kaynaklar Functional Plant Genomics (Editors:J.-F. Morot-Gaudry, P.Lea, J.-F.Briat) Genomics-Assisted Crop Improvement Volume 1 Genomics Approaches and Platforms (Editors:Rajeev K.Varshney, Roberto Tuberosa) Pant Functional Genomics (Editors:Erich Grotewold) Karkute, S.G., Singh, A.K., Gupta, O.P., Singh, P.M., Singh, B. 2017. "CRISPR/Cas9 mediated genome engineering for improvement of horticultural crops", Frontiers in plant science, 8, 1635. Obembe, O. O., Popoola, J. O., Leelavathi, S., & Reddy, S. V. (2011). Advances in plant molecular farming. Biotechnology advances, 29(2), 210-222.