BİYOKİMYA (Tıbbi ve Klinik Biyokimya) TLT213 Doç. Dr. Yasemin G. İŞGÖR Ankara Üniversitesi «Laboratuvar genel özellikleri, kullanılan Teknikler ve Analiz yöntemleri »

Klinik Biyokimya laboratuvarlarında, biyolojik materyallerde, hastalıkların tanısı, ayırıcı tanısı, bir hastalığın şiddeti ve seyrinin (prognozunun) belirlenmesi, bir hastalığın sağaltımının (tedavisinin) izlenmesi, bulgu vermeyen bir hastalığın ortaya çıkarılması amacıyla laboratuvar analizleri yapılır. Biyokimya, canlı yapı taşlarını ve canlılık olaylarını molekül düzeyinde inceleyen temel bilim dalıdır. Klinik Biyokimya, sağlıkta ve hastalıktaki biyokimyasal mekanizmaları tanı, ayırıcı tanı ve prognoz tayinindeki testlerin seçimi, tekniği, sonuçların yorumlanması ve klinisyenlerle konsültasyonu da içeren, tıbba özgün bir laboratuvar bilimidir. Doç. Dr. yasemin G. İŞGÖR /Ankara Üniversitesi/ link: http://80.251.40.59/ankara.edu.tr/isgor/index.html

Klinik Biyokimya Laboratuvarı temel işlevleri Tarama (screening) Tedavi (treatment, sağaltım) Klinik Laboratuvar Diagnoz (Diagnosis, teşhis) Prognoz (prognosis, seyir, gidişat) Teşhis (diagnoz) :tanı ve ayırıcı tanılar hastalığın teşhisinde, tedavi için doğru teşhisin konulmasında Prognoz/seyir : uygulanan tedaviye göre hastalığın gidişatının takibini ifade etmede kullanılır. Hastalık tedaviye cevap veriyorsa Doç. Dr. yasemin G. İŞGÖR /Ankara Üniversitesi/ link: http://80.251.40.59/ankara.edu.tr/isgor/index.html

Klinik biyokimya laboratuvarının genel organizasyonu İdari bölüm Kan alma ve numune kabul bölümü Serum/plazma ayırma bölümü Genel Biyokimyasal analizler bölümü (genel olarak enzim aktiviteleri ve Metabolit düzeyi ölçümlemeleri) İlaç düzeyleri ve Hormon testleri bölümü Kan gazları ve elektrolit analizleri bölümü İdrar ve gaita analizleri bölümü Çözelti ve kit hazırlama bölümü Distile, diyonize, redistile su üretimi, malzeme yıkama-kurutma-sterilizasyon bölümü Ambar ve soğuk depo Acil laboratuvarı Bilgi işlem ve raporlama birimi Doç. Dr. yasemin G. İŞGÖR /Ankara Üniversitesi/ link: http://80.251.40.59/ankara.edu.tr/isgor/index.html

Biyokimyasal Analizlerin Sınıflandırılması A) Ölçümlenebilir olması açısından 1) Kalitatif (nitel) analizler 2) Kantitatif (nicel) analizler [ g/dL (%g), mg/dL (%mg), g/dL, ng/dL, pg/dL, g/L (mg/mL), mg/L (g/mL) ] B) Genel söylem açısından analiz materyaline göre 1) Metabolit düzeyi 2) Enzim Aktivitesi 3) Vitamin Düzeyi 4) Hormon düzeyi 5) İyon düzeyleri ….. C) Analiz yönteminin skalasına göre (numune başına düşen toplam analiz hacmine göre) 1) Makro 2) Semi-(yarı) ve Mikro 4) Ultramikro (yarı otomatik analizör) 5) İleri ultramikro metodlar (otoanalizör) D)Analiz yöntemi için gereken malzemelerin temini durumuna göre 1) Preparatif (Hazırlanacak çözelti ve ajanlarla) analizler 2) Kitlerle (Hazır ayıraçlar içeren özel analiz setleri) 3) şeritler ya da daldırma çubukları (dipstick) gibi ve kalitatif analiz ayraçlarıyla yapılan analizler E) Elle işleme ve otomatlaşma gereksinimine göre klinik biyokimyasal analizler 1) Manuel analizler. Elle işlenen metodlar 2) Otomatlaştırılmış analizler. Otoanalizör gerektiren metodlar Doç. Dr. yasemin G. İŞGÖR /Ankara Üniversitesi/ link: http://80.251.40.59/ankara.edu.tr/isgor/index.html

A) Otoanalizörle analiz B) Kitlerle analiz C) manuel (otomatik olmayan, tamamen bireysel aktiviteyle gerçekleştirilen) analiz. Doç. Dr. yasemin G. İŞGÖR /Ankara Üniversitesi/ link: http://80.251.40.59/ankara.edu.tr/isgor/index.html

Manuel ve dipstik testi: idrar analizi İdrar görünüşü, mikroskobik incelemesi manuel metodlarla gerçekleştirilir. 3. ve son aşama olarak da biyokimyasal analizler gerçekleştirilir (dipstik ve otoanalizör) Doç. Dr. yasemin G. İŞGÖR /Ankara Üniversitesi/ link: http://80.251.40.59/ankara.edu.tr/isgor/index.html

Analiz teknikleri Gravimetri (Kütleye bağlı analizler ) Sedimantasyon, hematokrit analizi vs Titrimetri (Hacime bağlı (volumetrik) analizler) Spektroskopi (Optiksel , ışık emilim, yansıtma, kırma vb özelliklere bağlı Analizler ) Absorpsiyon, saçılma, kemilüminesan, fosforesan, floresan, polarimetri, refraktometri Elektrokimya (elektrik sinyalindeki değişime bağlı Analizler) Radio-İmmun Analiz (RIA) (radyo izotopların numunelerdeki bağlanma ve yarılanma ömürlerine göre analizler) Kromatografi (mobil ve sabit iki faz arasında incelenecek materyalin hareketliliğine göre ayrıştırılması veya tanımlanması) İyon kromatografisi, HPLC, ince tabaka kromatografisi, gaz kromatografisi, vb.. Elektroforez İncelenecek biyomolekülün bir jel ortamında maruz kaldığı elektrik yüküne göre anod ve katot arasındaki hareket etme kabiliyeti ve hızına bağlı olarak ayrıştırılması ve karakterizasyonu prensibine dayalı analizler Otoanalizörler bu tekniklerin iki veya daha fazlasını, çok sayıda numune analizi sırasında seri olarak analiz etmede kullanan cihazlardır. Genellikle mikro ve ultra-mikro yöntemlere dayandırılmıştır ve otomasyonu korumak adına bu cihazlar üretici firma tarafından cihazın çalışma prensibine bağlı olarak önerilen kitlerle çalışır. Doç. Dr. yasemin G. İŞGÖR /Ankara Üniversitesi/ link: http://80.251.40.59/ankara.edu.tr/isgor/index.html

Analizde Kullanılan Numune (biyolojk Materyal) türleri Analizde kullanılacak materyaller genellikle hedef teste göre laboratuvarlara yönlendirilir. Genel olarak biyolojik materyaller: Kan, idrar, beyin-omurilik sıvısı (BOS, serebrospinal sıvı), amniyon sıvısı, mide özsuyu, sperma Plevra sıvısı, periton sıvısı, eklem sıvısı (sinovyal sıvı) ovaryum kisti, hidatik kist gibi kist sıvıları ve çeşitli fistüllerden sızan sıvılar safra yolu ve idrar yolu taşları gibi katı kısımlar biyopsi parçaları özel ponksiyon yoluyla alınan punktatlar, kemik iliğinden aspirasyonla alınan aspiratlar, bronkoalveoler lavaj sıvısı (BAL) solunumla verilen hava Doç. Dr. yasemin G. İŞGÖR /Ankara Üniversitesi/ link: http://80.251.40.59/ankara.edu.tr/isgor/index.html

Kan numunelerinin analize özgü tüpleri ve Antikoagülanlar Plasma ve serum kimyasal olarak aynıdır tek farkları serum da fibrinojen olmamasıdır. Doç. Dr. yasemin G. İŞGÖR /Ankara Üniversitesi/ link: http://80.251.40.59/ankara.edu.tr/isgor/index.html

Preparatif numune tüpleri (içerik) Antikoagulant Etki Yolu Tüp içi Miktar Avantaj Dezavantaj EDTA/Ethylene diamine tetra acetic acid Çözünmez Ca (kalsiyum) Tuzu oluşturur 10-20mg (1 % lik solüsyondan 1 mL) tüpe alınır ve oda ısısı veya inkübatörde kurutulur Rutin hematolojik prosedürler ve hücre elementlerinin gözlenmesi Hücreler büzülebilir (na tuzları az çözünür) Heparin Antithrombin ve antithromboplastin 1-2mg (tüpe 1% lik solüsyondan 0.2 mL eklenir) Kan gazı analizi için (gazometri) uygundur RBC hemolizine etkisi azdır WBC’lerin kümeleşmesine yol açar WBC boyama(Stain) ile interferans vardır Na citrate (sodyum sitrat) Ca ile birleşerek çözünmez kalsiyum tuzu oluşturur Tüp içinde 10-20 mg (1 mL içinde 10-20 mg olmalıdır) Kan transfüzyonu için uygundur Çoğu kimyasal analizle interferans yapar, hücrelerde büzülmeye neden olur Potasyum okzalat (K Oxalate) Ca ile birleşerek çözünmez kalsiyum okzalat tuzu oluşturur 20mg (%20 lik solüsyondan 2 damla eklenmiş tüp inkübatörde kurutulur) Çözünürlüğü yüksektir Hücrelerde büzülmeye neden olduğundan kan hacminin artmasına neden olur Sodyum okzalat (Na Oxalate) Genel olarak PTZ (protrombin zamanı) için kullanılır Doç. Dr. yasemin G. İŞGÖR /Ankara Üniversitesi/ link: http://80.251.40.59/ankara.edu.tr/isgor/index.html

Yaygın kullanılan antikoagülantlar Antikoagulantlar Kimyasal ajanlar tam kan ve plazma gerektiği durumlarda rutin olarak kullanılırlar. Yaygın kullanılan antikoagülantlar Heparin EDTA Okzalatar Sodyum florür 1. Heparin: «DOĞAL» antikoagülantdır çünkü kanda zaten var olan bir ajandır. Ancak taze alınmış kanda miktarı düşük olması sebebiyle pıhtılaşmayı durdurmaya yeterli değildir. Heparin etki mekanizması trombin inhibisyonuyla gerçekleşir. Bu da antitrombin III aktivitesinin heparince arttırılmasıyla gerçekleşir. Kan numunesinin mililitresi başına 0.2 mg heparin eklenmesi yeterlidir ve bu antikoagülantın eklenmesi Eritrosit volümğnde değişime neden olmaz. 2. EDTA: yaygın olarak disodyum tuzu şeklinde eklenir. Kelasyon ile ortamdan Ca iyonlarını almasıyla etkisini gösterir Kan numunesinin mililitresi başına 0.2 mg EDTA disodium tuzunun eklenmesi yeterlidir. Bu miktardan çok daha fazlası kullanıldığında bile eritrosit volümünde değişiklik gözlenmemiştir. 3. Oxalatlar: Lityum, Sodyum ve Potasyum okzalatları antikoagülant olarak Ca iyonlarının ortamdan uzaklaştırılmasıyla etkisini gösterir. Potasyum okzalat (K2C204.H20) yaygın kullanılan okzalatdır. Kan numunesinin mililitresi başına 1-2 mg yeterlidir. 4. Sodyum Florür: Bu antikoagülant kanda glukoz ölçümleri için toplanan numunelerde kullanılır. Eritrositler (RBC)de glikoliz yolundaki enolaz aktivitesini özgün olarak inhibe eder. Böylece kan numunelerindeki RBClerin oda ısısında bekleyen numunedeki serbest glukozu tüketmesine engel olur. Zayıf bir antikoagülant olduğundan genellikle potasyum okzalat gibi bir antikoagülantla beraber kullanılır. Doç. Dr. yasemin G. İŞGÖR /Ankara Üniversitesi/ link: http://80.251.40.59/ankara.edu.tr/isgor/index.html

Laboratuvar numunelerine eklenecek kimyasal koruyucular Kimyasal koruyucular iki ana grupta incelenir: Numunelerdeki kimyasal değişimleri engellemek Mikrobiyolojik üremenin engellenmesi Steril olmayan numuneler Sander’in protokolüne göre 1 mL kan numunesi için 10 mg Sodyum florür+ 1 mg Timol» eklendiğinde 2 hafta boyunca analiz yapılacak halde kararlı kaldığı mikrobiyolojik üreme olmadığı belirlenmiştir. Ancak bu numunelerde nitrojen (azot) analizi yapılamaz. Sodyum florür Kan glukoz düzeyi ölçümünde santrifüj edilene dek numunelerdeki RBClerin glukozu tüketmesini engellemek amaçlı kullanılır. Timol ile kıyasla daha etkin olduğu öne sürülen diğer iki koruyucu ise Monoklorobenzen ve monobromobenzen’dir ve sodyum florür ile kullanılabilir. Antibiyotikler de mikrobiyal üremeyi önleme adına kullanılabilir. 10 mL kan numunesi için 1 mg streptomisin kullanılabilir. Bu numuneler Hemoglobin ve üre analizlerinde kullanılabilir. İdrar numuneleri için yaygın koruyucular formaldehit, timol, tolüen ve kloroform’dur ve antimikrobiyal ajanlar olarak kullanılırlar. Doç. Dr. yasemin G. İŞGÖR /Ankara Üniversitesi/ link: http://80.251.40.59/ankara.edu.tr/isgor/index.html

Analizlerin raporlanmasında genel olarak kullanılan Birim ve Kısaltmalar 1. Metabolitler (glucose, üre vb) düzeyleri mg / dL veya mmol/L olarak, 2. Elektrolitler (Na+, K+, Ca2+) düzeyleri mmol/L (eski terminoloji kullanıldığında meq/L) olarak, 3. Enzim düzeyleri ise enzim aktivitesi şeklinde Unit/L olarak ifade edilir. Uluslararası ölçüm sistemine göre 1 Ünite (U) : 1 mikromol substratı 1 dakikada ürüne çeviren enzim miktarıdır. (yaygın kullanılan ifadedir). Enzim aktvitesi U/L veya U/mL olarak ifade edildiğinde aslında enzim katalizliğinde gerçekleşen tepkime sonucu 1 mikromol substrat/ dakika/ mL enzim şeklinde raporlanış demektir. Her enzim için bu ölçüm o enzime özgü protokol ile ve enzime özgü standard şartlarda gerçekleştirilir.Enzim aktivitesi raporlandığında (özellikle saf enzimler için) bu standard şartlar rapora eklenir. Klinik biyokimya laboratuvarlarında her enzime özgü alt ve üst sınırları belirten skala mevcuttur. Enzim Unitesi tanımı 1964 yılında Uluslararası Biyokimya Birliği (IUB, bugün IUBMB: uluslararası biyokimya ve moleküler biyoloji birliği olarak bilir) tarfından düzenlenmiş ve kabul edilmiştir. Dakika bir SI birimi olmadığından (SI birimi açısından zaman saniye olarak alınır) hala yaygın olmamakla beraber enzim aktivitesi katal (1 mol/saniye/mL) ile ifade edilir (1978 de önerilmiş ve 1999 da kabul edilmiştir). 1U=1/60 Katal =16.67 nanokatal Enzim aktivitesini ifade etmekte kullanılan U ile International Unit (IU) aynı şey değildir. IU ifadesi Biyolojikçe aktif maddelerin ölçüm birimidir. Doç. Dr. yasemin G. İŞGÖR /Ankara Üniversitesi/ link: http://80.251.40.59/ankara.edu.tr/isgor/index.html

Analizlerin güvenilirliğinin ifadesi kesinlik (precision) Aynı metodoloji kullanıldığında farklı zamanlarda aynı veya yakın sonuçların alınması analizin kesinliğini gösterir. Kesinlikten bahsederken bir analizin tekrarlanabilirliğinden (yinelenebilirlik) bahsederiz. doğruluk (accuracy) Doğruluk tekrarlanan analizlerin gerçek değere ne kadar yakın olduğudur. Analizin doğruluğu kullanılan metodolojiye bağlıdır. hassasiyet (Sensitiflik: sensitivity) Hassasiyet analizin çok küçük değişimleri tespit etmesidir. Analiz edilen madde, enzim aktivitesi, ilaç düzeyi ve benzeri hedef ne kadar az olursa olsun ölçülebilirlik sınırları vardır (detection limit, ölçüm limiti). Bu sınır içerisinde ne kadar düşük değişimleri tespit edilebiliyorsa analiz yöntemi kadar hassastır. Özgünlük (spesifiklik: spesificity) Özgünlük analiz metodunun hedefi ölçümleme sırasında asıl ölçümü yapılan hedeften farklı maddelerin ne kadar ölçüldüğüyle (interferans) ilgilidir. Özgünlük derecesi hedef ile interferans yapan maddelerin sonuçlarının farklılığının fazla olmasıyla beraber artar. Bu fark ne kadar ayrımlanabiliyorsa o kadar özgündür analiz yöntemi. Interferans: Asıl ölçüm yapılan madde yerine başka maddelerin de sonuç vermesi, yani deney sonucuna karışması interferans olarak tanımlanır. Doç. Dr. yasemin G. İŞGÖR /Ankara Üniversitesi/ link: http://80.251.40.59/ankara.edu.tr/isgor/index.html