DNA’NIN REPLİKASYONU Prof.Dr. Davut ALPTEKİN

Watson-Crick modeline göre Hücre siklusunun S evresinde DNA kendi kendisinin kopyasını çıkarır yani dublike olur. Oluşan yeni hücrelere eşit dağıldığı için her hücrede aynı miktarda değişmeden kalır. Kopyasını çıkarmak için DNA iplikleri açılır ve iplikler kalıp olarak kullanılır. Her iplik birbirinin tamamlayıcısı olduğu için oluşan iki iplik birbirinin aynısıdır.

DNA’nın çoğalması Semikonservatif yolla olur DNA’nın çoğalması Semikonservatif yolla olur. Hücre döngüsünün S evresinde iki iplik açılır. Eski ipliğin karşısına yeni iplik sentez edilir. 1958 yılında Meselson ve Sthal kültür ortamında N14 ve N15 kullanarak E. coli ile yaptığı denemelerde DNA replikasyonunun semikonservatif yolla olduğunu göstermişlerdir.

Replikasyonun Orijini ve Yönü Replikasyon DNA üzerindeki orijin noktalarından başlar. Prokaryotların DNA’sında tek bir orijin nokTası vardır.

Replikasyonun Orijini ve Yönü Ancak ökaryot DNA’sı çok uzun olduğu için çok fazla orijin noktası bulunur. (İnsanda haploit genomun yani 23 kromozomun büyüklüğü yaklaşık 3 milyar baz çiftidir). DNA ipliklerinin açılması orijin noktasından iki tarafa doğru olur. Orijin noktasından itibaren replike olan DNA parçasına Replikon denir. Bakterilerde tek orijin noktası bulunduğu için tek replikon vardır. Ökaryotlarda ise çok fazla replikon vardır.

E. coli DNA’sının orijin noktası William Wellington Cairns tarafından saptanmış ve Ori C olarak adlandırılmıştır. 245 baz çiftinden oluşur, 9-13 bazdan oluşan tekrarlar içerir. Ökaryotlara örnek olarak mayalarda orijin bölgeleri çalışılmış, mayaların orijin bölgelerine ARS (Autonomous Replicating Sequences) ismi verilmiştir. Bu bölge 100 bazlık bir bölge olup tüm mayalarda ortak olan 11 bazlık çekirdek dizisi içerir. Replikasyon başladığında orijin noktasında bazlar arasında H+ bağları kırılır ve iki yöne doğru açılma olur. İki replikasyon çatalı oluşur.

Replikasyon çatalının açılmasını replikasyon kompleksinin bir parçası olan Helikaz enzimi sağlar. Helikaz DNA’ya ve ATP’ye bağlıdır. ATP’den aldığı enerji ile bazlar arasındaki H+ bağlarını kırar ve DNA ipliklerinin açılmasını sağlar.

İplik açılırken açılan her kola SSBP (Single Stranded Binding Protein) bağlanarak ipliğin stabil kalmasını sağlar. İpliklerin açık kalması, her ipliğin karşısına yeni bazlar bağlanarak komplementeri yapılacağı için oldukça önemlidir.

İplik Helikaz enzimi tarafından açıldıkça DNA’nın henüz açılmayan kısımlarında kıvrımın sıklığı artar. Üst üste gelen kıvrımlar DNA Topoizomeraz enzimleri tarafından rahatlatılır. Bir topoizomeraz olan Giraz DNA’nın tek veya çift ipliğini keser, kıvrımı düzleştirerek rahatlatır. Sentez edilen DNA’da da kıvrımlar artarsa orayı da keserek kıvrımı rahatlatıp yeniden birleştirir. İplik açıldıktan sonra DNA polimeraz enzimleri devreye girip replikasyonu başlatır.

DNA Polimeraz I 1957 yılında Cornberg tarafından keşfedilmiştir. Var olan nükleotide yeni bir nükleotit ekler. Yeni bir zincir oluşumunu başlatamaz. 5. karbonuna bağlı (5’) ve üç fosfatlı dNTP’lerden 2 fosfat grubu ayrılır. Geride kalan fosfat uzayan zincirdeki deoksi ribozun 3’ OH grubuna bağlanır. İpliğin uzaması 5’→3’ yönünde olur. Her bağlama sonunda deoksi ribozun 3’OH grubu açıkta kalır, yeni nükleotidin 5’ ucundaki fosfat diğer nükleotidin 3’ ucundaki OH grubuna bağlanır ve iplik gittikçe uzar.

DNA Polimeraz II, III 1969 yılında radyasyona maruz kalan E.coli’de mutant bir suş bulmuşlar ve bu suşda DNA Polimeraz II ve III’ün olduğunu saptamışlar. Daha sonra bu enzimin normal bireylerde de olduğu belirlenmiş ve de bu enzimlerin DNA sentezi esnasında görev yaptığı saptanmıştır.

DNA Polimeraz I, II, III’ün Özellikleri DNA sentezini başlatamazlar. Sentez esnasında DNA ipliğinin uzamasını sağlarlar. Büyük proteinler olup moleküler ağırlığı 100.000 Dalton civarındadır. Her üç enzimin 3’→5’ ekzonükleaz aktiviteleri vardır. Geri dönüp eklenen nükleotidlerin doğru olup olmadığını kontrol eder. Doğru olmayanlar çıkarılıp yerine doğrusu eklenir.

DNA Polimeraz I, DNA replikasyonunun 5’→3’ yönünde ekzo nükleaz aktivitesi ile nükleotitlerin aynı yönde dizilmesini sağlarken aynı zamanda RNA primerlerini de saptayıp onların kesip çıkarılarak ayıklanmasını da sağlar. DNA Polimeraz I daha stabildir. Bu nedenle hücrede en çok bulunan polimeraz enzimidir.

Polimeraz I aynı zamanda replikasyon esnasında RNA primerlerinin ayıklanması ile oluşan boşlukları da doldurur. Polimeraz III, Polimerizasyondan sorumlu ve replikasyon için gerekli bir enzimdir. 3’→5’ ekzonükleaz aktiviteleri ile hatayı düzeltirler, hatalı DNA oluşumunu engellerler. DNA Polimeraz II, UV veya radyasyon ile DNA’da oluşan hasarları düzeltir.

Prokaryotlarda DNA Sentezi DNA sarmalı Helikaz ile orijin noktasından açılır ve sentez başlar. Ancak önce DNA polimeraz olan Primaz açılan ipliğin karşısına 5-15 nükleotitlik bir primer sentez eder. 5’→3’ yönünde primer sentez edildikten sonra son nükleotidin 3’-OH ucu serbest kalır. Serbest kalan bu uca DNA polimeraz I, III enzimi açılan ipliğin komplementerini 5’→3’ yönünde polimerize eder. İpliğin biri kesintisiz devam ederken diğer iplikte sentez kesintili devam eder.

Kesintili iplik 1000-2000 nükleotitlik DNA fragmanlarını sentez eder Kesintili iplik 1000-2000 nükleotitlik DNA fragmanlarını sentez eder. Bu fragmanlara Okazaki fragmanları denir (1968 yılında Reiii Okazaki ve Tsuneko Okazaki bulmuştur). Okazaki fragmanlarının birleşmesi gerekir. Her fragman önce RNA primeri sentez eder, sonra DNA polimerize olur. Bu nedenle Okazaki fragmanı kadar RNA primeri vardır. Fragmanların birbirine bağlanması için DNA polimeraz I tarafından önce RNA primeri çıkarılır. Yerine DNA nükleotitleri eklenir.

Boşluklar doldurulduktan sonra açıkta kalan 3’-OH ucu ile 5’-P ucu Ligaz enzimi ile katalizleyerek fosfodiester bağı ile birleştirilir. DNA polimeraz enzimi aynı zamanda bazların doğru eşleşip eşleşmediğini de kontrol eder. İki iplikte sentez birbiri ile koordineli olarak yürütülür. Bazen komplementer olmayan yanlış baz eklenebilir. Bu durumda yeni oluşan iplikteki yanlış baz DNA polimeraz I ve III’ün 3’→5’ ekzonükleaz aktivitesi ile kesip çıkarılır. Yerine doğru nükleotit eklenir.

Ökaryotlarda DNA Sentezi Ökaryotlarda DNA sentezi bakterilerdekine benzer. Ancak çok fazla orijin noktası vardır. Ayrıca ökaryot DNA’sı proteinlerle kompleks halindedir, sentez esnasında bunlarında açılması gerekir. Ökaryot DNA’sı interfaz evresinde kromatin yapısını oluşturmak için histon proteinleri ile kompleks oluşturur. DNA+Histon kompleksi o canlının her hücresinde aynıdır.

DNA sentezinden hemen önce histonlar yapıdan ayrılır DNA sentezinden hemen önce histonlar yapıdan ayrılır. Replikasyon çatalından itibaren yeni sentezlenen DNA ile yeniden birleşir. Hücre bölünmesinde DNA sentezinden önce hücre hacmini iki katına çıkardığı için histon proteinleri de hücrede S evresinde iki katına kadar sentez edilir ve yeni oluşan ipliklere bağlanır.

Ökaryotlarda da DNA sentezini DNA Polimeraz yapar Ökaryotlarda da DNA sentezini DNA Polimeraz yapar. Ancak 6 çeşit DNA polimeraz vardır. DNA polimeraz Alfa (α) DNA polimeraz Beta (β) DNA polimeraz Gama (γ) DNA polimeraz Delta (δ) DNA polimeraz Epsilon (ε) DNA polimeraz Zeta (ζ)

DNA Polimeraz alfa, delta ve epsilon’un bölünen hücrelerde bulunması replikasyondan sorumlu olduğunu gösterir. DNA polimeraz-α; DNA replikasyonu için gerekli en önemli enzimdir. Prokaryotların DNA polimeraz III enziminin görevi gibi sentezi başlatır. Daha sonra bu görevi DNA polimeraz-δ’ya devreder.

DNA polimeraz-δ; ipliğin uzamasını ve 3’→5’ ekzonükleaz aktivitesi sayesinde hatalı bazın girmesini engeller. Ayrıca, DNA polimeraz I gibi gecikmeli sentezin yapıldığı iplikteki RNA primerlerinin ayıklanmasını ve okazaki parçalarının birleşmesini de sağlar. DNA polimeraz epsilon (ε); delta (δ)’ya benzer. Mayalarda mutasyon ile aktivitesi bitirilmiş ve maya hücreleri yaşamamıştır.

DNA polimeraz-β ve zeta (ζ); hem bölünen hem de bölünmeyen hücrelerde bulunur. DNA tamirinde görev alır. DNA polimeraz-γ; Mitokondride bulunur ve mitokondri DNA’sının replikasyonundan sorumludur. Ökaryotlardaki DNA polimerazlar da DNA sentezi için deoksiribonükleozit trifosfatlara, RNA primerine ve kalıp DNA’ya ihtiyaç duyar.

Orijin noktası açılıp sentez başladığında iki replikasyon çatalı vardır ve sentez her iki yöne doğru olur. Burda da gecikmeli iplikte okazaki fragmanları vardır. Ancak bu fragmanlar prokaryotlardaki parçalardan küçük olup 100-200 nükleotit içerir. Orijin noktası 50-300 kb arasında değişen mesafelerde bulunur. Bakterilerde tek olmasına rağmen insan genomunda 25.000 kadar orijin noktası dolayısı ile replikon vardır.

Her replikon 100.000-200.000bç’den oluşur. Ökaryot hücrelerinde çok sayıda replikon olduğu için çok miktarda DNA polimeraza ihtiyaç vardır. E.coli’de sentez için DNA polimeraz III’ün 15 kopyası yeterken, hayvansal hücrelerde sadece DNA polimeraz alfa için 50.000 kopyaya ihtiyaç vardır. Ancak DNA replikasyonu bakterilere göre ökaryotik hücrelerde daha hızlı yapılmaktadır. Ör. E.coli’de replikasyon 20-40 dakikada tamamlanırken, Drosophyla’nın emriyonik hücrelerinde 3 dakikada tamamlanmaktadır.

Ökaryotlarda Telomerlerin Sentezi Prokaryotik DNA sirküler yapıda Ökaryotik DNA lineer yapıdadır. Bu nedenle DNA replikasyonu da farklıdır. Sentez 5’→3’ yönünde olduğundan lineer DNA replikasyonunda her replikasyondan sonra 5’ ucu boşta kalır ve sentezlenemez. Bir primer boyu kadar DNA kısalır.

Normal koşullarda, telomerazın somatik hücrelerde çalışmaması nedeniyle, somatik hücreler her bir bölünmede 50-200 nükleotit yitirir. Üreme hücreleri; yumurta ya da sperm hücreleri, embriyonik kök hücreler, kemik iliği hücreleri, tek hücreli ökaryotlar ve kanser hücrelerinde ise Telomeraz Aktivitesi görülür. DNA’nın dolayısı ile Kromozomların uç kısımlarındaki bu yerlerde Telomeraz enzimi devreye girer.

Kromozomların uç kısımları Telomer denilen kısa tekrar dizilerinden oluşur. Telomer dizileri ilk kez tek hücreli bir canlı olan Tetrahymena’da saptanmış, 5’-TTGGGG-3’ olduğu, daha sonra omurgalılarda saptanmış, 5’-TTAGGG-3’ olduğu belirlenmiştir. Telomerler bir çeşit DNA polimeraz olan Revers transkriptaz enzimi ile DNA sentezler. Ancak önce DNA’daki telomer dizisi kalıp olarak kullanılarak primer RNA sentez edilir.

Tetrahymena; Daha çok tatlı su havuzlarında yaşayan Ciliata’lardan tek hücreli bir canlı

Sentez edilen RNA primer olarak kullanıldığı için 3’-OH ucu boş kalır Sentez edilen RNA primer olarak kullanıldığı için 3’-OH ucu boş kalır. Buraya RNA’dan revers transkriptaz ile yeniden DNA sentezlenip DNA’nın 5’ ucuna eklenir. En son primerler ayıklanıp yerine DNA sentezi yapılır ve replikasyon tamamlanır.