PROTEİN İZOLASYONU VE WESTERN BLOTLAMA @Murat Kasap, PhD
Neden Western Blotlama? Bir protein solüsyonunda, aranan bir proteinin olup olmadığını ve varsa ne kadar olduğunu anlamak için kullanılan bir yöntemdir. Tespit etme Miktar tayini Karşılaştırma Değişim Etkileşim
Neye ihtiyacımız var? Proteine Antikora Gerisi teknik alt yapıdan ibaret….
GENELDE PROTEİN İZOLASYONU Hemen her protein için o proteine ait özel bir izolasyon metodu geliştirmek gerekebilir. Miktarı az olan proteinler miktarı çok olan proteinlere göre daha zor izole edilirler
Solubilizasyon metotları 1. Dondur-çöz 2. Osmotik basınç 3. Enzimatik güç (Lizozom) 4. Mekanik güçler sonikasyon (ses dalgaları ile parçalama) Grinding (Keskin bir uç yardımı ile parçalama) French press (basınç ile parçalama)
Supernatant (SN) Parçalanan hücreler 12,000 ile 18,000xG’ lik güçler kullanılarak santrifuj edilmeli ve santrifügasyon sonunda üstte kalan berrak kısım (işlenmemiş protein çözeltisi- protein özütü) sonraki adımlarda kullanılmalıdır DNase yada RNase muamelesi Protamin sülfat veya streptomycin
Protein stabilizasyonu Protein denatürasyonu kolay bir iş….Nedenleri? pH ve yanlış tampon çözelti seçimi Oda sıcaklığında çalışma Yanlış yerde ve yanlış biçimde saklama Proteazlardan korumama Aşırı seyreltme Köpürtme
SDS-PAGE
boşlukların büyüklüğünü iki parametre belirler; (1) Kullanılan akrilamid miktarı (2) çapraz bağlanmanın derecesi.
Son çıkarılan elektroforez üniteleri –İki tip tampon- pH 8.5 ile pH 6.0
Proteinlerin Jel Üzerinde Görünür Hale Getirilmesi-Jelin Boyanması Coomassie Brilliant Blue (CBB) ile boyama Gümüş ile boyama
Proteinlerin jel üzerinden membrana transferi Blotlama için yapılan hazırlıklar Transfer tamponun hazırlanması Jelin Hazırlanması Membranın hazırlanması Semi-Dry Blotlama 7 cm’lik bir jelin transferi için 15V’da 20 dakikalık
Sinyal oluşumu ve görüntüleme