Arş.Gör. F.Necmiye KACI Erzurum Teknik Üniversitesi,2017 PROTEİN İZOLASYONU Arş.Gör. F.Necmiye KACI Erzurum Teknik Üniversitesi,2017

Proteinler tüm canlı organizmalar için en önemli makromoleküllerden biridir. Bir ve ya daha fazla sayıda polipeptidten meydana gelirler. Yapısal Komponentle İletişim Savunma Hücre Düzenlenmesi Enzim Fonksiyonları Yaşamla ilgili hiçbir işlem protein olmaksızın gerçekleşemez.

İlgilenilen biyolojik molekül grubunun izolasyonu amacıyla gerçekleştirilen ekstraksiyon işlemleri parçalama (lizis) ve ayırma (saflaştırma) aşamalarından oluşur.

Protein kaynakları Memeli dokuları Eritrositler Yumuşak bitkisel dokular Bitki doku kültürü (yaprak ve tohumdan sabit üreme koşulları) Mayalar (logaritmik üreme fazına dikkat!) Bakteriler (logaritmik üreme fazına dikkat!) Yağlı dokular Membran proteinleri

Protein Ekstraksiyonu Ekstraksiyonda ilk aşama, ilgili proteinin hücrenin içinde mi, dışında mı olduğuna, içindeyse lokalizasyonuna bağlı olarak değişkenlik gösterir. Ekstrasellüler bir protein ise, kullanılacak yöntem oldukça basittir. Membrana bağlı veya sitoplazmik bir protein ise, kullanılacak yöntem oldukça uzun ve karmaşıktır. Dikkat edilmesi gereken kilit nokta, proteinin yapısını en az etkileyecek yöntemi seçmektir. Eğer protein bir organel içinde bulunuyorsa, ilk olarak o organel diferansiyel santrifüj ile izole edilmeli; sitoplazmik proteinler uzaklaştırılmalı, ardından ekstraksiyon yapılmalıdır. Tüm ekstraksiyonlardaki en önemli nokta izole edilen proteinin hemen hemen tamamının sıvı faza geçmesidir.

Sıvının bir kısmı çözünmeyen hücresel artıklar ile kaybedilir. Parçalama sonunda elde edilen homojenattaki çözünmeyen materyal santrifüjlenerek uzaklaştırılır. Önemli olan istenilen proteinin hemen tamamının sıvı faza (supernatant) geçmesidir. Sıvının bir kısmı çözünmeyen hücresel artıklar ile kaybedilir. Çalışılan proteinin stabilitesini artırmak için ortama: EDTA (1-5 mM) 2-merkaptoetanol veya sistein (5-20 mM) Çinko +2 (Çinko içeren enzimler için) Piridoksal fosfat Kofaktörler eklenir. Ortama proteaz inhibitörleri eklenmeli: PMSF (Fenilmetil sülfonil florür) Aseton veya etanol ile hazırlanır. Çok çabuk hidrolize olduğu için kullanılmadan hemen önce hazırlanıp, proteazların olduğu ortama verilir. Streptomisin, protamin ve polietilenimin gibi bazı maddelerin ortama verilmesiyle nükleik asitler vb. çökebilir. Streptomisin ribozomlarla etkileşerek RNA çökmesini sağlayan bir antibiyotiktir. Protamin, spermden elde edilen ve DNA ‘yı bağlayan doğal bir proteindir.

Dikkat edilecek noktalar: Protein denatürasyonundan ve inaktivasyonundan korunmak için çalışmanın her aşamasında pH ve sıcaklık (genelde +4°C) kontrol altında tutulmalıdır. Ortam pH’sının 7 ya da 7’ye yakın olduğu durumlarda en geniş çapta tris (ticari adı: Trisma) ve fosfat tamponları kullanılır. pH ayarlamada dikkat edilmesi gereken diğer bir faktör de sıcaklıktır. Tamponlara kullanılacakları sıcaklıklarda pH ayarı yapılmalıdır. (Örn: Tris’in 25°C’de pH’sı 8.06 iken; 0°C’de pH’sı 8.85’e kadar çıkmaktadır.) Materyal parçalama sırasında ortaya çıkacak proteazların etkisinden korunmalıdır. Hazırlanan tamponlar derişik stoklar (10X, 50X veya 100X) olarak hazırlanmalıdır. Ekstraksiyon sonrası protein örnekleri, -25°C’nin altında, mümkünse –80°C’de saklanmalıdır. Protein kullanılmadan önce 40-50 °C’de ısıtımış su banyosu içerisinde hızlıca çözülmelidir.

Dikkat edilecek noktalar: Hemen hemen tüm proteinler, sodyum dodesil sülfat (sds) veya setil trimetilamonyum bromür (CTAB) gibi iyonik deterjanlarla çözünür hale getirilebilir ancak çoğunlukla geri dönüşümsüz şekilde denature olurlar. Dolayısıyla ektraksiyonda proteinin doğal yapısını bozmayacak, yumuşak bir deterjan kullanılır. Sıklıkla iyonik olmayan Triton X-100 kullanılır.

1. Ektrasellüler protein Sentezlendikten sonra hücre dışına salınan proteinleri santrifüjleme veya filtrasyon tekniği ile bulundukları ortamdan ayırmak mümkündür. İleri saflaştırma yapılabilir.

2. Membrana bağlı –sitoplazmik protein Ekstrakte edilecek protein membrana bağlı veya sitoplazmik (intrasellüler) bir proteinse önce hücre çeperi engeli aşılmalıdır. Bu aşamada kullanılabilecek uygun teknik seçilmeli ve protein yapısının zarar görmesi engellenmelidir.

Çeşitli materyallere uygulanabilecek bazı parçalama teknikleri Yumuşak Ozmotik şok Eritrositler Enzim ile parçalama Bakteriler, mayalar Deterjan ile parçalama Doku kültürü hücreleri El homojenizatörü (veya havan) Karaciğer vb. Doğrama Kas vb. Orta Bıçaklı homojenizatör Hayvansal ve bitkisel dokular Kum, alumina ile ezme Bitkisel dokular, bakteriler Sert Fransız basınç hücresi Ultrasonikasyon Hücre süspansiyonları Bilyeli mil

3. İntrasellüler (Organel) içinde protein Organel içindeki proteinlerin izolasyonunda öncelikle organel izolasyonu yapmak daha temiz ekstre sağlar. Diferansiyel santrifüjleme ile istenilen organel izole edilebilir. (düşük hızlarda önce nukleus, sonra artan hızlarda mitokondri ve son olarak da ribozom gibi en küçük moleküller çöktürülür)

Diferansiyel santrifüjleme ile organel izolasyonu

Protein Konsantrasyonun Belirlenmesi a) Biüret Yöntemi Duyarlılığı düşük (1-10 mg/ml) olmakla beraber, pratikliği nedeniyle geniş çapta kullanılan bir yöntemdir. Reaksiyonun temeli belirteçteki bakır iyonlarının (Cu+2) peptid azotlarına bağlanması sonucu alkali çözeltide 540-560 nm’de maksimum absorbsiyon gösteren renkli bir kompleksin oluşumuna dayanır. Cu+2 iyonlarının ana zincire bağlanması nedeniyle amino asit çeşitlerinin ölçümler üzerinde herhangi bir etkisi yoktur.

b) Lowry Yöntemi Lowry yöntemi alkali koşullarda meydana gelen iki farklı reaksiyona dayalıdır. Hassasiyet aralığı 5 - 100 µg/ml’dir. Bunlardan birincisi amid bağları ile bakır arasında meydana gelir ve indirgenmiş bakır oluşumu ile sonuçlanan Biüret reaksiyonudur. İkincisi ise Folin-Ciocalteu ayıracının (fosfomolibden ve fosfotungsten) tirozin ve triptofan amino asitleri ile tepkimeye girerek indirgenmesidir. İndirgenmiş ayıraç mavi renktedir ve 500-700 nm arasında absorbans verir ancak çoğu zaman tercih edilen değer 660 nm’dir. Bu iki reaksiyonu bir arada gerçekleşmesi Biüret reaksiyonu hassasiyetini 100 kat artırır. Lowry yöntemi pH hassasiyeti gösterir, ortam pH’sı 10-10.5 olmalıdır. Yöntem pek çok farklı tamponun içeriğinde yer alan Tris, EDTA ve potasyum bileşikleri ile enterferans yaratabilir, bu durumda yanıltıcı absorbans değerlerinin ortaya çıkmasına neden olur. Yöntem triptofan ve tirozin içeriği fazla olan proteinlerin miktar tayini için avantajlıdır zira ayıraç bu amino asitlere daha yüksek hassasiyet gösterir.

c)Warburg-Christian Yöntemi Diyaliz ya da fraksinasyon yoluyla protein olmayan maddelerin uzaklaştırılmasından sonra 280/260 nm’de UV. absorbsiyon analizleri yapılır. Proteinlerin triptofon ve tirozin reziduları 275-280 nm’de UV. absorbansını arttırır. Çünkü beraber durumdaki bu iki amino asitin saf bir protein çözeltisindeki derişimleri birçok proteinde genellikle sabittir. 280/260 nm yönteminde duyarlılık 0,05-2.0 mg/ml dır. ml.'deki mg protein = A280 - A260 dır. (1.5 x A280 )- (0.75 x A260) = mg protein/ ml.

d)Bradford (Coomassie Blue: G-250) Yöntemi Oldukça duyarlı olan bu yöntem (5-100 µg/ml); organik boyaların, proteinlerin asidik ve bazik grupları ile etkileşerek, renk oluşturmasını esas alır. Mavi rengin oluşmasında proteinin amino asit bileşimi (özellikle arjinin gibi bazik amino asitler ve aromatik amino asitler) önemlidir. Yöntemde temel alınan olgu, asidik boya normal şartlarda 465 nm’de maksimum absorbans verirken, protein ile bağlandığı zaman 595 nm dalga boyunda maksimum absorbans vermesidir.

Anlatılan metotların yanısıra protein tayini yapılırken, koşullar uygun olduğu taktirde, Smith yöntemi, Kjeldahl analizi, bulanıklık ölçümleri (turbidimetri), özgül aktivitenini ölçülmesi, kırılma indeksinin ölçülmesi (refraktometri) ve saflaştırılıp kurutulmuş örneklerin doğrudan tartılması yöntemlerinden de faydalanılabilir.

Protein Ekstresinin Konsantre Edilmesi Proteini konsantre hale getirmek için; Kuru Polimer Kullanımı( Sephadex G-25 kullanımı) Ultrafiltrasyon (tercih edilen) Diyaliz (seyreltik protein çözeltisini derişik hale getirmek) Liyofilizasyon (diyaliz işlemi sonrası yapılır (ilk olarak tuz vb uzaklaştırılır;ardından süblimleşme ile su uzaklaştırılır ve toz halde protein elde edilir) Çöktürme Trikloroasetik asit ile çöktürme (protein denaturasyonuna yol açar) Organik çözücülerle çöktürme (Aseton, etanol, metanol. Soğukta, 10°C altında denaturasyona yol açmadan çökme sağlar) Tuzla çöktürme (Amonyum sülfat örnektir; denaturasyona yol açmadan protein agregasyonu sağlar) Polietilen glikol (PEG) ile çöktürme (iyonik olmayan, suda çözünebilen bir polimerdir. %20-30 PEG konsantrasyonu max. protein çökmesi sağlar)

Deney : Kandan Hemoglobin İzolasyonu Materyaller: Antikoagülanlı (pıhtılaşmayı önleyen) kan örneği % 0.9 NaCl Distile su Toluen

Metot : 1. 1 ml EDTA'lı kan örneği alınır. 3000 rpm'de 5 dakika santrifüj edilerek üstteki plazma kısmı pipet ile alınır. 2. Kan örneği üç kez serum fizyolojik ile yıkanır. Yıkama İşlemi: Örnek üzerine % 0.9 NaCl ilave edilir ve hafifçe çalkalanır. Ardından 3000 rpm'de 5' santrifüj edilir. Süpernatant kısmı aspire edilir. 3. Santrifügasyondan sonra altta kalan alyuvar tabakası üzerine 1.5 katı distile su ve yarısı kadar da toluen ilave edilir. 4. 8 dakika elle çalkalanır. 5. 20 dakika 3000 rpm'de santrifüj edilir. 6. Aradaki berrak kısım mikropipetle dikkatlice alınır.

NOTLAR: EDTA: Ca++ iyonlarını bağlayarak kanın pıhtılaşmasını önler. % 0.9 NaCl : Alyuvarların oluşturduğu çöküntü kısmında plazmadan kalan artıkları temizlemek için yıkama işleminde kullanılır. Toluen: Hücre membranındaki lipid tabakasını eriterek hücre membranının parçalanmasını sağlar.