MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II: POLİAKRİLAMİT JEL ELEKTROFOREZİ: PAGE Doç.Dr.Evren ÖNAY UÇAR 5.Ders

Proteinler izoelektrik noktalarının üzerindeki pH değerlerinde () yüklüdürler ve elektriksel alanda anoda göç ederler, izoelektrik noktalarının altındaki pH değerlerinde ise (+) yüklüdürler ve katoda göç ederler.

Bu özellikleri nedeniyle protein karışımlarının ayrılmasında elektroforez yönteminden geniş çapta yararlanılır. Bu teknik proteinlerin elektrik alanda göçüne dayanır.

Çapraz bağlı bir polimer (JEL) katı destek ortamını oluşturur.

NİŞASTA AGAROZ SELÜLOZ ASETAT POLİAKRİLAMİT (EN GENİŞ ÇAPTA) KULLANILAN JELLER: NİŞASTA AGAROZ SELÜLOZ ASETAT POLİAKRİLAMİT (EN GENİŞ ÇAPTA)

ÇAPRAZ BAĞLAYICI MONOMER POLİMER POLİAKRİLAMİT Kovalent çapraz bağlar sonucunda porlu (gözenekli) polimer (JEL) oluşur.

POLİMERİZASYON BAŞLATICI FOTOKİMYASAL KİMYASAL Amonyum persülfat

KATALİZÖR: TEMED (N,N,N',N' –TETRAMETİLETİLENDİAMİN)

POLİMERİZASYON

Poliakrilamit jelde por büyüklüğü, akrilamit ve bis içeriğini ifade eden % T ve % Cbis terimleri ile belirlenir. % T, total akrilamit % si (ağırlık/hacim); % Cbis ise bis’in monomere oranı (ağırlık/ağırlık) olup formüllere göre hesaplanırlar:

Akrilamid (g) + Bis (g) % T = ----------------------------------------- x 100 Hacim (ml) Bis (g) % Cbis= ------------------------------- x 100 Akrilamid (g) + Bis (g)

Bu formüllere göre: %20 T ve %5 Cbis içeren bir jelde %20 total akrilamit (akrilamit + bis) bulunur ve total akrilamitin % 5’i bis’tir. %T arttıkça por çapı küçülür. %5 Cbis her türlü % T koşulunda optimum por büyüklüğünün oluşmasına yol açar.

Çeşitli akrilamit konsantrasyonlarında ayrımı yapılabilecek polipeptit ağırlıkları Akrilamit konsantrasyonu pp.ağırlığı(kDa) 15 12-43 10 16-68 7.5 36-94 5 57-212

DİKEY JEL ELEKTROFOREZ SİSTEMLERİ TÜP JEL ELEKTROFOREZ SİSTEMLERİ

GÜÇ KAYNAĞI

DİKEY ELEKTROFOREZ

Kullanılan prosedüre göre hazırlanan monomer karışımı, elektroforez aletinin jel dökme aparatında, jelin çeşitli kalınlık ve ebatta hazırlanabilmesine olanak veren, sandviç şeklinde hazırlanmış iki cam (jel kaseti) arasına veya jel tüplerine doldurulur, tarak takılır ve polimerizasyona bırakılır.

Oksijen polimerizasyonu engellediğinden, monomer karışımının havası alınmalıdır. Bu da karışımdan inert bir gaz geçirerek, vakum uygulayarak ya da ultrasonik su banyosunda bekletilerek sağlanır.

Jel karışımı tüp ya da kaset içine döküldüğünde, üst yüzeydeki gerilim nedeniyle ortaya çıkan eğimli yüzey, bant dağılımının bozuk olmasına yol açar. Bunu önlemek için, polimerizasyon başlamadan önce jelin yüzeyi çok ince bir su veya su ile doyurulmuş 2-butanol tabakası ile kapatılır.

Hazırlanan kaset aletin tank bölümüne yerleştirilir Hazırlanan kaset aletin tank bölümüne yerleştirilir. Bu yerleştirimden sonra tamponla temas ettirilen jelden elektrik akımının geçmesi sağlanır.

Kuyucuklar (cepler) tampon anot katot Yükleme jeli Ayırma jeli plastik conta Proteinlerin poliakrilamit jel elektroforezi (PAGE) yöntemiyle ayrılması (dikey sistem).

Elektroforezde kesiksiz (“continuous”) ve kesikli (“discontinuous”) olmak üzere 2 farklı tampon sistemi kullanılabilir. Kesiksiz sistemde tek bir ayırıcı jel vardır; tanklarda ve jelde aynı tampon kullanılır. Kesikli sistemde ise jel farklı tamponlarla hazırlanmış iki kısımdan oluşur: (1) Büyük porlu yükleme (“stacking”) jeli; (2) Küçük porlu ayırma (“separating”) jeli.

Bu sistemde kullanılan tank tamponları da jel tamponlarından farklıdır Bu sistemde kullanılan tank tamponları da jel tamponlarından farklıdır. Bu farklılık jel boyunca bir pH ve voltaj gradientinin oluşumuna yol açar. Böylece daha seyreltik örneklerle çalışılabilir ve daha iyi bir ayrışım elde edilir.

GRADİENT JELLER Jelin üst kısmındaki (başlangıç) porlar alt kısmından daha büyük!

Elektrik akımı geçirmek üzere anot ve katot bağlantıları yapılır ve güç kaynağı çalıştırılır: Protein elektroforezinde elektriksel parametrelerden biri, genellikle akım sabit tutulur. Bu durumda proteinlerin göç hızı da sabittir, ancak direnç artıkça ısı açığa çıkar. İşlem sabit voltajda gerçekleştirilirse, direnç artıkça göç hızı düşer, ancak ısı artmaz.

İŞLEM TAMAMLANDIĞINDA: Boyama yapılarak ayrılan proteinler gözle görünür hale getirilir. En çok kullanılan boyar madde “Coomassie blue” dur. Daha duyarlı bir boyama tekniği ise gümüş boyamadır. Jel boyandıktan sonra fotoğrafı çekilebilir, ya da densitometre ile taranarak analiz edilebilir. Jelde ayrılmış radyoaktif örneklerin analizi için otoradyografi yöntemlerinden yararlanılır. Membrana transfer (“blot-transfer”) teknikleri de son yıllarda geniş çapta kullanım alanı bulmaktadır. (Western blotting ve immünoblotting)