ISO 9308-1 (2014) ve CCA Prof. Dr. Kadir HALKMAN Ankara Üniversitesi, Gıda Mühendisliği Bölümü 09 Nisan 2015; Merck Millipore, İstanbul

Koliform Grup ve E. coli Analizi Gıdalarda, çevre örneklerinde koliform grup ve E. coli aranması ve sayılmasına ilişkin çok sayıda standart yöntem vardır. Devamında henüz standartlara geçmemiş ancak sanayide yaygın şekilde kullanılan pek çok uygulama da vardır. Bu seminerde ISO 9308 ve CCA besiyeri hakkında bilgi verilecektir. CCA, başka analizlerde de kullanılabilir.

ISO 9308 – CCA (01) TS EN ISO 9308-1, numaralı standart 2014 yılı sonunda revize edilmiş ve koliform grup ve E. coli analizleri için bir besiyeri sunulmuştur: Chromogenic Coliform Agar (CCA). Bu standardın 9308-2 (EMS) ve 9308-3 (mikroplak) bölümlerinde değişiklik yoktur. ISO’da geçen ismi ile Lactose TTC Agar with sodium heptadecylsulfate ve CCA arasındaki en önemli fark CCA’da E. coli ve diğer koliform bakterilerin çok açık bir şekilde ayırt edilmesidir. Diğer besiyeri bileşiminde böyle bir ayrımı sağlayacak bileşen yoktur, dolayısı ile tüm koliformlar aynı renk ve büyüklükte koloni oluştururlar. Üretim izni olanlara var

ISO 9308 – CCA (02) CCA’da E. coli ile diğer koliformların farklı renkte koloni oluşturmasını sağlayan özellik tümüyle enzimatik reaksiyonlardır. Bütün koliform bakterilerde (Escherichia coli; Enterobacter aerogenes; Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii ve Klebsiella pnemoniae) bulunan ve laktozun kullanılmasını sağlayan ß-D-galactosidase enzimi, CCA bileşimindeki Salmon-GAL kromojenik substratını parçalayarak E. coli dahil bütün koliform bakterilerin pembemsi kırmızı koloni oluşturmasını sağlar. İnek için %89,7; koyun keçi için %10'dan fazla değerleri de var. 10 işçiden fazla büyük elektrik

ISO 9308 – CCA (03) E. coli, diğer koliformlardan farklı olarak ß-D-glucuronidase enzimine sahiptir. CCA bileşimindeki X-Glucuronide substratı bu enzim ile parçalanır ve bu şekilde E. coli mavi/ mor renkte koloni oluşturur. Bir diğer deyiş ile bu mavi/ mor renk, pembemsi kırmızı rengi örter. Bu enzime sahip olmayan E. coli O157:H7 sadece pembemsi kırmızı renkli koloni oluşturur. ß-D-glucuronidase enzimi, MUG reaksiyonlarında da kullanılır. Enzim  Substrat ß-D-galactosidase  laktozdan asit ve gaz oluşumu.

ISO 9308 – CCA (04) Kromojenik besiyerleri, karakteristik bakteriyel enzimlerin, kromojenik substratlar aracılığı ile belirlendiği hızlı tanımlama besiyerleridir. Besiyerinin bileşimi bir yandan hedef bakterinin gelişmesini özellikle desteklerken, diğer yandan karakteristik enzimlerin optimum aktivite göstermesini sağlar. Tanımlama, koloninin tipik rengi ile yapılır. Kromojenik besiyerlerinde oluşan renk, besiyerine difüze olmadığı için ışık, pH ve sıcaklık gibi olumsuzluklardan etkilenmez ve sabit kalır. Kromojenik olmayanlarda koloni rengi zamanla değişebilir.

ISO 9308 – CCA (05) Besiyeri bileşiminde bulunan seçilmiş peptonlar, piruvat ve fosfat tampon, ağır hasar görmüş/ stres altındaki koliform bakterilerin kendilerini onarmalarını sağlarken tergitol-7, Gram pozitiflerin ve bazı Gram negatiflerin gelişimini baskılar. CCA, düşük selektiviteye sahip bir besiyeridir. Dolayısı ile kullanımı kısıtlıdır. Bu besiyerine dayanarak revize edilmiş ISO 9308-1, sadece düşük refakatçi flora olan sularda membran filtrasyon yöntemi ile E. coli ve koliform grup bakterilerin sayımını tanımlar.

ISO 9308 – CCA (06) Dolayısı ile bu besiyerinde gelişebilecek yoğun refakatçi flora olması beklenen yüzey suları ve sığ kuyu sularının analizine uygun değildir. Bu standart, filtrasyon sonunda besiyeri üzerinde 100 ve daha az sayıda koloni oluşturabilecek su numunelerinin analizi için geliştirilmiştir. E. coli ve diğer koliform grup bakteri sayısı refakatçi floradan daha yüksek ise numune seyreltilerek analiz edilebilir ancak böylesi bir numuneye doğal çevresel koşullarda rastlanması pek mümkün değildir. Bu gibi suların ISO 9308-2 (EMS) ile analizi önerilir.

04d. Koliformlar

ISO 9308 – CCA (07) Bu standardın tanımladığı CCA, ısıya duyarlı bir besiyeridir. Granül formdan hazırlanışında ya da hazır Merkotube şeklinde pazarlanan ürünün kullanımında aşırı ısıya maruz kalmamasına özen gösterilmelidir. Ancak, hazırlanışı çoğu laboratuvarda koliform analizlerinde kullanılan VRBL ya da VRBD Agar hazırlanmasından farklı değildir. Agarın eridiği sıcaklığa erişilmesi yeterlidir. Kaynar su banyosu ya da mikrodalga fırın bu amaçla kullanılabilir.

ISO 9308 – CCA (08) DİKKAT: Bu uygulama ISO 9308’de yoktur. Yoğun refakatçi flora varlığından endişe ediliyorsa, granül formda hazırlanışında [E. coli/ Coliform Selective Supplement; Merck 1.00898] ilave edilebilir. Bu amaçla eritilmiş besiyeri 40-45 oC’a soğudunda 2 mL steril damıtık su ile çözülmüş bu katkı 500 mL besiyerine eklenir, karıştırılır ve besiyeri amaca göre kullanılır (yayma, dökme, membran filtrasyon). 5 mg Cefsulodin 2 mL saf suda çözülüp tercihen 0,2 µm porlu filtreden geçirilerek sterilize edilir, aynı şekilde 500 mL besiyerine eklenir. Ya da doğrudan Chromocult Coliform Agar ES (Enhanced Selectivity) besiyeri kullanılabilir. DİKKAT: Bu uygulama ISO 9308’de yoktur.

ISO 9308 – CCA (09) Numunede Aeromonas spp gibi bakteriler E. coli olmayan koliformlar gibi koloni oluşturabilirler. Dolayısı koliform grup bakteri doğrulaması için oksidaz testi zorunludur. CCA bileşimindeki triptofan, koloni üzerinde indol testi yapılmasına olanak verir. Mavi renkli kolonilere indol testi uygulamasına gerek yoktur. Şüphe ediliyorsa koloni üzerinde değil, Tryptone Water besiyerine geçilip indol testi yapılmalıdır.

ISO 9308 – CCA (10) Pembemsi kırmızı koloniler üzerine indol testi de gerekli değildir. Şüpheli bir durum olursa bu test yapılır, Pembemsi kırmızı koloni oksidaz negatif ve indol pozitif ise E. coli O157:H7 serotipini gösterir. İndol testi yapılacak ise oksidaz testinden sonra yapılmalıdır. Filtreler Petri kutusuna yerleştirildikten sonra 362 oC’ta 213 saat inkübe edilir. 24 saatten fazla inkübasyondan kaçınılmalıdır. Devamında, inkübasyon sonrasında Petri kutularının buzdolabına kaldırılıp, ertesi sabah okuma yapılması önerilmez.

Ankara Üniv. Gıda Mühendisliği Bölümü Teşekkürler, Sorularınız/ katkılarınız Prof. Dr. Kadir Halkman Ankara Üniv. Gıda Mühendisliği Bölümü