Acta Pharmacologica Sinica 2006 May; 27 (5): 603–608.

... konulu sunumlar: "Acta Pharmacologica Sinica 2006 May; 27 (5): 603–608."— Sunum transkripti:

1 Acta Pharmacologica Sinica 2006 May; 27 (5): 603–608

2 Sülfasalazin deneysel testiküler torsiyon/detorsiyon sonrası spermatojenik hücrelerde gelişen apopitozu önler. DR ECE MİNE DEMİR ADÜ BİYOKİMYA AD

3 GİRİŞ

4 Spermatik kord torsiyonu olarak tanımlanan testis torsiyonu, 25 yaş altı erkeklerde 1:4000 oranında görülen önemli bir tıbbi durumdur. Eğer testis torsiyonu oluştuktan 4-6 saat arasında tedavi edilmezse spermatojenik hücrelerde hasar meydana gelir. Bu zaman aralığında testis cerrahi olarak detorsiyone hale getirilse bile ipsilateral testiste kalıcı hasar gelişebilir. Torsiyon/detorsiyonu takiben gelişen iskemi/reperfüzyon sonucunda testiste anlamlı patolojik değişiklikler meydana gelir.

5 Sülfasalazin 1942 yılında antibiyotik (sülfopiridin) ve antienflamatuar (5-aminosalisilik asid) ilaç kombinasyonu olarak üretilmiştir. Sülfasalazin I kappa B(lкB)’nin fosforilasyonunu inhibe ederek nükleer faktör kappa B(NF-кB)’nin inhibitörü olarak görev yapar. Böylece nükleusa translokasyonu önlenir ve adezyon moleküllerinin ekspresyonu azalır.

6 Yapılan bu çalışmada amaç: Deneysel testis torsiyonu sonrası sülfasalazinin spermatojenik epitelde NF-кB’nin aktivasyonunu ve spermatojenik hücrelerde apopitozu önlediğini göstermektir.

7 MATERYAL-METOD

8 Deney hayvanları: Sprague-Dawley cinsi 32 genç erişkin erkek rat (240-280g) kullanıldı (Wuhan Üniversitesi Tıp Fakültesi Deney Hayvanları Merkezi). Ratlar 5-6 kafese konup standart şartlarda yaşamaları sağlandı. Her grupta 8 rat olacak şekilde 4 gruba ayrıldılar. Tüm ilaç ve kimyasallar SİGMA’dan temin edildi. Sülfosalazin: 350mg/kg dozunda 15 mL %0,9 sodyum klorür (SASP) içinde çözündürülerek intraperitoneal(İP) enjeksiyonla verildi.

9 Deneysel testiküler torsiyon: Hayvanlara intraperitoneal sodyum pentobarbital(50 mg/kg) uygulanarak cerrahi işlem ve testiküler iskemi gerçekleştirildi. A ve B gruplarındaki hayvanların sol testisleri 720° longitudinal axis boyunca döndürüldü ve 2 saat boyunca torsiyone olarak bırakıldı. Torsiyon sonrası ters rotasyon yapıldı, testis skrotum içine yerleştirildi ve yeniden testise kan akımı sağlandı. A grubuna(T+SASP): SASP solüsyonu kesiyi kapatmadan hemen önce İP olarak verildi. Hayvanlar 5saat sonra İP olarak SASP solüsyonu uygulandı ve bu her 24 saat tekrar edildi.

10 B grubu(T+SC) : A grubu gibi tedavi grubuydu. Testis torsiyonu A grubu gibi uygulandı ve SASP solüsyonu yerine 15 mL %0,9’luk sodyum klorür verildi. C ve D gruplarına tesis torsiyonu hariç diğer gruplara uygulanan tüm cerrahi işlemler uygulandı. C grubuna(SC) kesiyi kapatmadan hemen önce İP 15 mL %0,9’luk sodyum klorür verildi. Bu işlemden 5 saat sonra ve her 24 saat sonrasında İP %0,9’luk sodyum klorür verildi.

11 D grubuna(SASP) kesiyi kapatmadan hemen önce İP SASP solüsyonu verildi. Bu işlemden 5 saat sonra ve her 24 saat sonrasında İP SASP solüsyonu verildi. Tüm hayvanlar detorsiyondan 72 saat sonra öldürüldü.

12 Western Blot (WB): Testisler çevre yağ ve konnektif dokulardan ayrıldı. %0,9’luk NaCl ile yıkandı, filtre kağıdıyla temizlendi. Etkilenen testisten 3 cm uzunluğundaki seminifer tüp, WB yoluyla NF-кB’deki değişimleri tespit etmek için alındı. Kalan testisler spermatojenik hücrelerde apopitoz değerlendirilmesi yapmak için kullanıldı.

13 Nükleer proteinlerin WB için hazırlanması: Seminifer tüpler buzlu-soğuk fosfat tamponu (PBS) ile muamele edildi ve parçalara ayrıldı. Hücre süspansiyonu 1200 g, 4°C de 8 dakika santrifüj edildi. Hücre pelletleri: 100 µL lizis tamponu ile tekrar süspansiyon haline getirildi.

14 Lizis tamponu: 10 mmol/L 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine ethanesulfonic acid (HEPES), pH 7.9, 60 mmol/L KCl, 1 mmol/L ethylenediaminetetracetic acid(EDTA), 1 mmol/L dithiothreitol (DTT), 1 mmol/L phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), 0.5% Nonidet P-40

15 Oluşan süspansiyondan 10 µL alındı ve eşit miktarda tripan mavisi ile karıştırıldı. Bu karışım bütünlüğü korunmuş nükleusu tespit etmek için ışık mikroskobunda(×40) incelendi. Geriye kalan süspansiyon tekrar santrifüj edildi. Nükleer pellet Nonided P-40 içermeyen lizis tamponu ile yıkandı ve 1200g, 4°C de 5 dakika santrifüj edildi. Pellet 100 µL nükleer resüspansiyon tamponu ile tekrar süspansiyon haline getirildi.

16 Nükleer resüspansiyon tamponu: 25mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 400 mmol/L KCl 1 mmol/L DTT 1 mmol/L PMSF %20’lik gliserol

17 Süspansiyon 3 kere dondurulup eritildi. 4000g 4°C de 12 dakika santrifüj edildi. Nükleer proteinleri içeren süpernatant ayrıldı. Süpernatantın bir kısmından protein miktarı tespit edildi. 10 µg’lık sitoplazmik ekstrat sodium dodecyl sulfate (SDS) içinde çözüldü, 5 dakika kaynatıldı. %10’luk akrilamid jel kullanılarak poliakrilamid jel elektroforezi(PAGE) uygulandı. SDS-PAGE sonrasında jel nitroselüloz membrana aktarıldı(1saat, 4°C).

18 5% yağsız kuru süt içeren PBS-0.1% Tween 20 (PBS-T) ile 4 °C’de gece boyunca bloklama işlemi gerçekleştirildi. NF-кB’nin p65 subünitine karşı geliştirilen poliklonal antikor (0,2 µg/mL ) içeren PBS-T ile 1 saat muamele edildi. Daha sonrasında membran PBS-T ile yıkandı. 1saat horseradish peroxidase (HRP) ile konjuge edilmiş goat anti-rabbit IgG antikoru 1/1000 PBS-T ile dilüe edilerek uygulandı.

19 PBS-T ile yıkama sonrasında HRP aktivitesi kemilüminesans substrat kullanılarak otomatik görüntüleme yöntemi ile görünür hale getirildi. Ekspresyonun göreceli miktarı, işaret üzerindeki bandın dansitesi ile orantılı olarak düşünüldü.

20 İmmünohistokimyasal boyama İmmünohistokimyasal boyama, NF-кB protein tespiti için seminifer tüp hücrelerine indirekt immünoperoksidaz metodu kullanılarak uygulandı. Hücreler, NF-кB’nin p65 subünitine karşı geliştirilen rabbit poliklonal antikor(PBS1/200 dilüe) ile 1saat oda ısısında inkübe edildi. Sonrasında biotinlenmiş goat anti-rabbit IgG antikoru(1/500 dilüsyon) ile 1saat inkübe edildi. Antikorlar avidin-biotin kompleksi ile görünür hale getirildi.

21 Kesitlerin hepsi Olympus mikroskobuyla incelendi. NF-кB aktivasyonunu mikroskopta (×200) değerlendirirken alanlar rastgele seçildi. Aktivasyon gösteren hücreler sarı boyanmıştı. NF-кB pozitif nükleusların yüzdesi spermatojenik epitelde 100 hücre sayılarak tespit edildi.

22 Spermatojenik hücrelerde apopitozun analizi: Testisler %0,9’luk NaCl solüsyonu ile yıkanıp filtre kağdıyla temizlendi. Doku kesitleri 1gün formaldehid solüsyonunda bırakıldı,sonrasında parafine gömüldü. 5 mirometre kalınlığındaki kesitler 1 gün 65 °C’de fikse edildi. Endojen peroksidaz aktivitesi %0,3 H 2 O 2 ile 30 dakika oda ısısında inaktive edildi. Kesitler geçirgen hale getirilmek için permeabilizasyon tamponu içinde 5 dakika 4°C’de bekletildi.

23 İn situ işaretleme nonradioactive fluorescein- dideoxyuridine trifosfattan oluşan In Situ Apoptosis Detection Kit (Boehringer Mannheim Corp, Mannheim, Germany) kullanılarak yapıldı. Doku kesitleri, terminal deoxynucleotidyl transferase ve fluorescein-dideoxyuridine triphosphate ile 37 °C’de 90 dakika muamele edildi. DNA fragmanlarının 3'-OH uçları fluorescein ile işaretlendi. Kesitler 3 kere PBS ile yıkandı. Anti-fluorescein isothiocyanate horseradish peroxidase conjugate ile 30 dakika 37 °C’de inkübe edildi.

24 3 kere PBS ile yıkandı. %0.05 diaminobenzidine ile 15 dakika oda ısısında bekletilerek işaretleme yapıldı. Örnekler 3 kere distile su ile yıkandıktan sonra Mayer hemotoksilen solüsyonu ile 10 dakika muamele edilerek zıt boyama uygulandı ve mikroskop altında incelendi. Apopitoz değerlendirilmesi için mikroskopik alanlar (×200) rastgele seçildi. Apopitotik hücreler sarı renk ile boyandı. Apopitotik spermatojenik hücrelerin yüzdesi (Apopitotik indeks-AI), spermatojenik epitelde 100 hücre sayılarak tespit edildi.

25 İstatistiksel analiz Student’s t-test, ANOVA and the Dunnett t-test kullanıldı.

26 SONUÇLAR

27 NF-кB protein seviyesinin incelenmesi, spermatojenik hücrelerde apopitozun mekanizmasını açıklamak için nükleer ve stoplazmik NF-кB protein seviyeleri incelendi. C ve D gruplarında, nükleer NF-кB protein(t=1.405) ve stoplazmik NF-кB protein(t=1.294) seviyeleri arasında anlamlı fark saptanamadı(P>0.05).

28 A ve C gruplarında, nükleer NF-кB protein(t=1.615) ve stoplazmik NF-кB protein(t=1.144) seviyeleri arasında anlamlı fark saptanamadı(P>0.05). A ve C gruplarıyla karşılaştırıldığında B grubunda nükleer proteindeki NF-кB seviyelerinde anlamlı artış (F=9.56, P<0.01) saptandı. D grubuyla karşılaştırıldığında C grubunda stoplazmik proteindeki NF-кB seviyelerinde anlamlı fark (F=1.92, P>0.05) saptanamadı.

29

30 NF-кB katsayısı Thiele ve arkadaşlarının metoduna göre hesaplandı. C=NU/CY NU: Nükleer NF-кB protein seviyesi. CY: Stoplazmik NF-кB protein seviyesi. NF-кB katsayısı için C ve D grupları arasında(t=0.995, P>0.05) ve A ve C grupları arasında(t=1.182, P>0.05) anlamlı fark yoktu. Buna rağmen A ve C gruplarıyla karşılaştırıldığında B grubunda NF-кB katsayısında anlamlı artış (F=10.27, P<0.01) saptandı.

31

32 İmmünohistokimyasal boyama: Apopitotik olayda NF-кB proteininin rolünü açıklamak için, proteinin ekspresyon seviyesi ve hücresel dağılımı incelendi. Grup A, C ve D’de NF-кB proteininin hemen hemen tamamının stoplazmada olduğu görüldü. B grubunda NF-кB protein seviyesi stoplazmik proteine göre nükleer protein olarak daha fazlaydı.

33

34

35 C ve D gruplarında nükleusu NF-кB-pozitif boyanan hücre oranları arasında anlamlı fark bulunamadı (t=0.834, P>0.05) A ve C gruplarında nükleusu NF-кB-pozitif boyanan hücre oranları arasında anlamlı fark bulunamadı (t=1.711, P>0.05). B grubundaki nükleusu NF-кB-pozitif boyanan hücre oranları A ve C grubuplarıyla karşılaştırıldığında anlamlı artış olduğu görüldü. NF-кB-pozitif nukleuslu hücreler genellikle spermatogonia ya da spermatosit idi, birkaçı sertoli, leydig hücreleri ya da değişime uğramış endotel hücre idi.

36 Apopitozun incelenmesi TUNEL tekniği kullanılarak spermatojenik hücrelerin AI’i incelendi. C ve D grupları arasında(t=0.962, P>0.05) ve A ve C grupları arasında (t=1.699, P>0.05) AI açısından anlamlı farklılık bulunamadı. AI’de A ve C gruplarıyla karşılaştırıldığında B grubunda anlamlı artış olduğu görüldü (F=8.41,P<0.01). Apopitoz spermatogonia ya da spermatositlerde görülmesine karşın sertoli, leydig hücreleri ya da endotel hücrelerinde görülmedi.

37

38

39

40 TARTIŞMA

41 Testiküler torsiyon, testiküler mezorşiyumun yetersiz fiksasyonu, testisin hipermobilitesi sonucu gelişir. Doku hasarının derecesi testiküler iskemi derecesiyle orantılıdır. Deneysel testiküler torsiyon, testiküler iskemiye neden olur. Torsiyonun düzelmesiyle doku tekrar kanlanır. Testiküler torsiyon, iskemi reperfüzyon hasarına neden olur bu da spermatojenik hücrelerin kaybına neden olur. Reperfüzyon sonrası spermatojenik hücrelerin kaybı spermatojenik hücre spesifik apopitoza neden olur.

42 Spermatojenik hücre spesifik apopitoz infertilite ile sonuçlanır. Weins ve Lucchesi’ye göre reperfüzyon hasarı ROS ile oluşur. ROS, parankim hücrelerde yada reperfüze venül duvarlarına yapışmış lökositlerde ksantin oksidaz sisteminin aktivasyonuyla oluşurlar. Torsiyone testislerde torsiyon sonrası oluşan iskemi/ reperfüzyon, adezyon moleküllerinin ekspresyonu ve lökosit migrasyonu artmasına, spermatojenik hücrelerde hasarlanmaya neden olur.

43 ROS reperfüzyonu takiben iskemik dokudan salınır. Dokuda lokal hasar oluşur bu olay da endotel hücre yüzey proteinlerinin yapımının artışıyla sonuçlanır. Endotel kaynaklı proteinlerin ve lokal vazodilatasyonun artması, hasarlı dokuya nötrofillerin infiltrasyonunu ve bağlanmasını kolaylaştırır. Nötrofiller, nekrozu kolaylaştırırlar ve çok miktarda ROS salarak nekroz ve hasarın artmasına neden olurlar.

44 Önceki çalışmalar, iskemi-reperfüzyon hasarında NF- кB’nin önemli rolünün olduğunu göstermiştir. NF-кB, immün cevabın düzenlenmesiyle ilgili transkripsiyon faktörüdür. İstirahat halinde NF-кB, p50 ve p65(RelA) subünitlerinden oluşan bir heterodimerdir. Bu subünitler stoplazmada inhibitör proteinlere bağlı olarak bulunurlar. Bu proteinler IкB olarak isimlendirilirler.

45 IкB’nin fosforile olup yıkılması sonrası NF-кB aktive olur. ROS, IL-1, TNF-α gibi bazı ajanlar, IкB’nin fosforile olmasına neden olur. NF-кB aktive hale geçtikten sonra nükleusa transloke olur. NF-кB, intraselüler adezyon molekülü 1 (ICAM-1), vasküler selüler adezyon molekülü 1 (VCAM-1) ve E- selectin (ELAM-1)’i içeren birçok genin transkripsiyonunu aktive eder. Bu mediatörler reperfüzyon hasarında oluşan inflamatuar olayda önemli rol oynarlar.

46 İskemi-reperfüzyon oluşmuş dokuda her zaman apopitoz gelişir. Doku fonksiyonları değişir. Yapılan bu çalışmada NF-кB’nin testis dokusunda oluşan iskemi-reperfüzyon hasarındaki öneminin incelenmesi amaçlanmıştır. Araştırmacıların hipotezi, testiküler torsiyon boyunca serbest radikal üretiminin arttığı ve bunların da NF-кB’yi aktive ederek spermatojenik hücrelerde apopitozu arttırdığı yönündeydi.

47 Çalışma sonuçları, NF-кB’nin testis iskemi-reperfüzyon hasarında önemli rolü olduğunu ve sülfasalazinin testis torsiyonunu takiben kullanılmasının NF-кB’yi inhibe ettiğini göstermiştir. Sülfasalazin, inflamatuar barsak hastalıklarında ve romatoid artirit tedavisinde güncel olarak kullanılmaktadır. 50 yıldır yaygın olarak kullanılmasına rağmen etki mekanizması tam olarak bilinmemektedir.

48 Yakın zamanda, lökosit ve lenfosit fonksiyonları üzerinde immünsüpressif ve immünomodülatör etkileri olduğu gösterilmiştir. Lenfositlerde IL-2 sentezini ve IL-1 üretimini inhibe eder. Bazı çalışmalar salisilatların IкB fosforilasyonunu inhibe ederek inflamasyonu baskılayıcı etki gösterdiğini göstermiştir.

49 Wahl ve arkadaşları, sülfosalazinin IкB fosforilasyonunu inhibe ederek NF-кB’nin önemli bir inhibitörü olarak görev yaptığını göstermişlerdir. IкB’nin fosforilasyonunu engellenmesiyle NF-кB’nin nükleusa translokasyonu önlenir ve adezyon molekül ekspresyonu azalır. Ayrıca serbest radikal toplayıcısı olarak görev yaptığı gösterilmiştir.

50 C ve D grupları arasında yada A ve C grupları arasında NF-кB katsayısı yada AI arasında anlamlı farklılık bulunamadı. A ve C ile karşılaştırıldığında B grubunda bu parametrelerde anlamlı artış olduğu görüldü. Testiküler torsiyon oluşmadan sülfosalazin verildiğinde(D) NF-кB katsayısı yada AI’de artış görülmedi.

51 Testiküler torsiyon oluşmamış ve sülfosalazin verilmiş grupta(D) NF-кB proteininin stoplazmadan nükleusa transloke olmadığı görüldü. Torsiyon oluşturulmuş grupta(B), NF-кB proteininin aktive olduğu, özellikle nükleer protein seviyesinin arttığı ayrıca apopitotik hücrenin de arttığı gözlendi. Sülfosalazin verilmesi NF-кB’nin aktivasyonunu ve AI’nın artasını önlemiştir(A). Bu bulgular apopitotik süreçte NF-кB’nin önemli olduğunu göstermiştir.

52 Bu bulgular sülfosalazinin testis torsiyonu sonrası NF-кB yolağının aktive olmasını önlediğini ve ROS konsantrasyonunun ve adezyon molekül ekspresyonunun azalmasına neden olduğunu göstermiştir. Yapılan çalışmada sonuç olarak, ucuz ve güvenilir bir ilaç olan sülfasalazinin testis torsiyonunu takiben gelişen infertiliteyi önlemede yararlı olabileceği düşünülmüştür.