Moleküler Lüminesans Spektroskopi Yüksek Kimyager Hasan ÖZ

... konulu sunumlar: "Moleküler Lüminesans Spektroskopi Yüksek Kimyager Hasan ÖZ"— Sunum transkripti:

1 Moleküler Lüminesans Spektroskopi Yüksek Kimyager Hasan ÖZ
Floresans ve Fosforesans Uygulamaları Etkin Kimyagerler Eğitimleri Faydalı olması dileğiyle… Yüksek Kimyager Hasan ÖZ 1

2 Çalışma ilkesi: Bu yöntemlerin her birinde, analit molekülleri, emisyon (floresans, fosforesans ve kemilüminesans) spektrumları kalitatif veya kantitatif bilgiler sağlayacak şekilde uyarılır. Floresans, floresanstan sorumlu elektronik enerji aktarımının elektronun spininde bir değişiklik oluşturmaması ile fosforesanstan ayrılır. Bunun bir sonucu olarak, floresans hemen yok olan (< s) bir lüminesans olup, kısa ömürlüdür. Buna karşılık fosforesans emisyonları ile ilişkili elektron spinindeki bir değişme, ışınlamanın bitmesinden sonra kolayca tespit edilebilir bir süre kadar, genellikle birkaç saniye veya daha uzun, ışımanın sürmesine sebep olur. Bir çok durumda, floresans veya fosforesans olarak foto lüminesans emisyonu, onu uyarmak için kullanılan ışımanınkinden daha uzun dalga boyundadır. 2

3 FLORESANS Ve FOSFORESANS Floresansın en basit tipi, seyreltik atomik buharların gösterdiği floresanstır. Örneğin, buhar halindeki sodyum atomlarının 3s elektronları, 589,6 ve 589 nm lik dalga boylarındaki ışınların absorpsiyonu ile 3p enerji seviyesine uyarılabilir s sonra, elektronlar temel duruma geri döner ve her yöne doğru, aynı iki dalga boyunda ışın yayar. Frekansta değişiklik olmaksızın absorplanan ışının yeniden yayılmasını kapsayan floresansın bu tipi rezonans ışıması veya rezonans floresansı olarak bilinir. paramanyetik olarak adlandırılır. 3

4 Birçok moleküler tür, rezonans floresansı da gösterir
Birçok moleküler tür, rezonans floresansı da gösterir. Bununla beraber çok sık olarak, moleküler floresans veya fosforesans bantları rezonans çizgisinden daha uzun dalga boylarında merkezlenmiş olarak bulunur. Bu uzun dalga boylarına veya düşük enerjilere kayma stokes kayması olarak ifade edilir. Uyarılmış elektronik; halin enerji kaybetmesi, fosforesans yoluyla da olabilir . Triplet bir halde sistemler arası geçişten, sonra, iç veya dış dönüşüm veya fosforesans ile biraz daha sönüm olabilir. 4

5 Elektron Spini Pauli dışarlama prensibi, bir atomdaki iki elektron için dört kuantum sayısının hepsinin birden aynı olamayacağını belirtir. Bu sınırlama, bir orbitalde iki elektrondan daha fazla elektron bulunmamasını ve ayrıca iki elektronun da zıt spinli olmasını gerektirir. Bu şartlar altında, spinler eşleşmiştir. Spin eşleşmesi sebebiyle, moleküllerin çoğu net manyetik alan göstermez ve bu yüzden diamanyetik olarak adlandırılır. Yani bunlar, durgun manyetik alan tarafından ne çekilir ne de itilirler. Buna karşılık, eşleşmemiş elektronlar içeren serbest radikallerin bir manyetik momenti vardır ve bunun sonucu olarak bir manyetik alan tarafından çekilir. Bu yüzden serbest radikaller paramanyetik olarak adlandırılır. 5

6 Singlet/ TripIet uyarıImış Haller Bütün elektron spinlerinin eşleşmiş olduğu bir moleküler elektronik hal; bir singlet hal olarak adlandırılır ve molekül bir manyetik alana maruz bırakıldığında elektronik enerji seviyelerinde hiçbir yarılma meydana gelmez. Diğer taraftan, bir serbest radikal için temel hal bir dublet halidir. Çünkü, tek elektronun bir manyetik alan içinde, sisteme çok az farklı enerjilerde katkı yapan iki yönlenmeye sahip olduğu kabul edilebilir. Bir molekülün bir çift elektronundan biri daha yüksek bir enerji seviyesine uyarılırsa ya bir singlet ya da bir triplet hal meydana gelir. 6

7 Seçim Kuralları S  S T  T S / T 7

8 Uyarılmış triplet halinin ,karşısına gelen uyarılmış singlet halden daha düşük olduğuna dikkat edilmelidir. Singlet/triplet geçişinin,karşı gelen singlet/singlet geçişine göre önemli derecede daha az mümküdür. Bunun sonucu olarak,bir uyarılmış triplet halinin ortalama ömrü 10-4 s'den birkaç saniyeye kadar uzayabilir. Bir uyarılmış singlet halinin ortalama ömrü ise ile 10-8 s kadardır Temel haldeki bir molekülün ışınla , uyarılmış triplet hale uyarılması ,düşük bir olasılığa sahiptir ve bu işlem sonucu oluşan absorpsiyon piklerinin şiddeti ,benzer şekilde singlet/singlet geçişine karşı gelenlerininkinden bir kaç kat ondalık mertebesi daha düşüktür. Bazı moleküller ,bir uyarılmış triplet haline geçebilir.Bu olayın nihayi sonucu,genellikle fosfersanstır. 8

9 Şekil tipik bir fotolüminesans molekülünün kısmi bir enerji seviyesi diyagramıdır.En alttaki koyu yatay çizgi ,normal olarak singlet haldeki ,molekülün temel hal enerjisinş göstermekte olup,So ile gösterilmiştir.Oda sıcaklığında ,bu hal,bir çözeltideki moleküllerin hemen hemen tamamının enerjisini gösterir.En üstteki koyu çizgiler,üç uyarılmıl elektronik halin temel titreşim halleri için enerji seviyelerini göstermektedir.Soldaki iki çizgi,(S1)ve ikinci(S2) elekktronik siglet halini gösterir.Sağdaki tek çizgi (T1)birinci elektronik triplet halinin enerjisini gösterir.Normal olarak ,birinci uyarılmış triplet halin enerjisi ,karşı gelen singlet halin enerjisinden daha düşüktür. Daha ince yatay çizgilerle gösterilen çok sayıdaki titreşim enerji seviyesi ,dört elektronik halin her biri ile ilişkilidir.Şekilde görüldüğü gibi ,bu molekülün uyarılması,biri yaklaşık ƛ1 dalga boyunda(S0S1)ve ikincisi de daha kısa dalga boyu,ƛ2 ( S0S2 )civarında merkezilenmiş iki ışın bandın absorpsiyonu ile meydana gelebilir.Uyarılma işleminin ,molekülün çok sayıda uyarılmış titreşim halinden birinine dönüşü ile sonuçlandığına dikkat ediniz.Triplet hale doğrudan uyarılma da gösterilmemiştir.Çünkü bu işlem multiplisitede bir değişmeyi gerektirir ve önceden de bahsedildiği gibi bu geçişin olma olasılığı düşüktür.(bu tip düşük olasılıkla bir geçişe yasaklanmış denir.) 9

10 Absorpsiyon ve Emisyon Hızları
Bir ışın fotonunun absorplanma hızı çok büyüktür. ( s) Fakat floresans emisyonu önemli derecede daha yavaş hızda oluşur. Burada, uyarılmış halin ömrü, uyarılma işlemine karşılık gelen absorpsiyon pikinin molar absorptivitesi ile ters orantılıdır. Bu nedenle, aralığındaki molar absorptiviteler için uyarılmış hallerin ömrü s'dir. . Tripletten singlete geçişin ortalama hızı, buna karşılık gelen singlet-singlet geçişininkinden daha azdır. Bu nedenle, Fosforesans emisyonu – 10 s veya daha fazla bir süre gerektirir. Absorpsiyon ve Emisyon Hızları 10

11 Titreşimsel Durulma Elektronik uyarılma sırasında bir molekül birçok titreşim seviyesinden herhangi birine uyarılabilir. Bununla beraber, çözeltide, aşırı titreşim enerjisi, uyarılmış türlerin molekülleri ile çözücü molekülleri arasındaki çarpışmalar sonucu hemen kaybedilir; sonuç, bir enerji aktarımı ve çözücü sıcaklığındaki çok az bir artıştır. Titreşim enerji seviyeleri bakımından uyarılmış bir molekülün ortalama ömrü10-12 s veya daha az olup, bu süre elektronik olarak uyarılmış bir halin ortalama ömründen önemli derecede daha kısa olduğundan, durulma işlemi çok etkilidir. Sonuç olarak, çözeltiden floresans olduğu zaman, bu floresans daima uyarılmış bir elektronik halin en düşük titreşim seviyesinden bir geçiş ile ilgilidir. Bununla beraber, elektron, temel halin titreşim seviyelerinden herhangi birine dönebileceği için, birbirine yakın birçok pik oluşur. Daha sonra, daha fazla titreşimsel durulma ile elektron, hızla temel elektronik halin en düşük titreşim seviyesine dönecektir. 11

12 İç dönüşüm İç dönüşüm terimi, bir molekülün, ışın yaymadan daha düşük bir elektronik enerji seviyesine geçmesi ile ilgili molekül içi olayları ifade eder. Bağıl olarak çok az bileşiğin floresans göstermesi bunların genellikle çok etkili olduklarının açık göstergesidir. 12

13 13

14 İki elektronik enerji seviyesi,titreşim enerji seviyelerinde bir örtüşme gösterecek kadar birbirlerine yakınsa;iç dönüşüm özellikle etkilidir.Bu durum şekilde gösterilmiştir.Gösterilen örtüşmelerde; uyarılmış iki halin potansiyel enerjisi aynıdır;bu eşitlik açık olarak etkili bir geçişe izin verir. 14

15 Dış Dönüşüm Uyarılmış bir elektronik halin sönümlenmesi, uyarılmış molekül ve çözücü veya diğer çözünenler arasındaki etkileşimi ve enerji aktarılmasını içerebilir. Bu olaylara topluca dış dönüşüm veya çarpışma ile sönüm denir. Dış dönüşüm için delil, çözücünün floresans şiddeti üzerindeki, kuvvetli etkisini içerir; ayrıca tanecikler arasındaki çarpışma sayısını azaltan koşullar (düşük sıcaklık ve yüksek viskozite) genellikle floresansı azaltır. Dış ve iç dönüşümler, fosforesans ile o kadar başarılı bir, şekilde rekabet ederler ki, normal olarak bu tür emisyon, sadece düşük sıcaklıklarda; çok viskoz ortamlarda veya katı yüzeyle absorplanmış moleküllerde gözlenir. 15

16 Sistemler Arası Geçiş Sistemler arası, geçiş, uyarılmış bir elektronun spininin ters döndüğü bir olaydır ve molekülün multiplisitesinde bir değişme olur. İç dönüşümde olduğu gibi, eğer iki halin titreşim seviyeleri, örtüşürse/bu geçişin olasılığı artar. Singlet/triplet geçişi buna bir örnektir; burada, en düşük singlet titreşim seviyesi, daha yüksek triplet titreşim seviyelerinin biri ile örtüşmektedir ve böylece spin halinde bir değişme daha muhtemeldir. Sistemler arası geçiş, iyot veya brom gibi ağır atomları içeren moleküllerde çok yaygındır. 16

17 FLORESANS VE FOSFORESANSI ETKİLEYEN DIŞ DEĞİŞKENLER
KUANTUM VERİMİ Floresans veya fosforesans için kuantum verimi veya kuantum verimi oranı basit olarak lüminesans yapan moleküllerin sayısının toplam uyarılmış molekül sayısına oranıdır.Floresin gibi oldukça floresans bir molekül için bazı şartlar altındaki kuantum verimi bire yaklaşır.Önemli derecede floresans yapmayan kimyasal türler sıfıra yakın verimlere sahiptir. kf =floesresans bağıl hız sabiti ks= sistemler arası geçiş “ “ kdd= dış dönüşüm “ “ kid= iç dönüşüm “ “ köa= ön ayrışma “ “ ka = ayrışma “ “ 17

18 Floreasansta Geçiş Tipileri
Floresans (veya fosforesans) ışını elede etmede kullanılan ışınların dalga boyları genel olarak ; 250 nm'den daha büyük olmalıdır.(Çünkü daha küçük dalga boylu ışınlar molekülde dissosyasyon(ayrışma) ve hatta parçalanmalara neden olur.Dissosyasyon da floresansı azaltan bir olaydır.) Floresans ışınları genel olarak ; π*  π π* n geçişlerinden meydana gelir. Bu iki geçişten de daha çok π*  π geçişlerinden meydana gelir. Böyle geçişlerden meydana gelen floresanslar aynı zamanda şiddetli olan floresanslardır.Bunların kuvantum verimi de yüksektir. 18

19 Floresans ve Yapı En şiddetli ve en faydalı floresans, düşük enerjili  * geçişlerine sahip aromatik fonksiyonel gruplan içeren bileşiklerde görülür. Alifatik ve alisiklik karbonil grupların veya fazla sayıda konjüge çift bağlı yapılar içeren bileşikler de floresans gösterebilir, ancak bunların sayısı aromatik sistemlerin sayısı ile karşılaştırıldığında daha azdır. Sübstitüe olmamış bir çok aromatik hidrokarbon çözeltide floresans yapar.Kuvantum verimi genellikle halka sayısı ve kondensasyon derecesi ile artar. 19

20 Piridin ,furan ,tiyofen ve pirol gibi heterosiklik maddeler floresans göstermezler.
20

21 Azotlu heterosiklikler de en düşük enerjili elektronik geçişin,hızlıca triplet hale dönüşen ve floresansı önleyen n π* sistemi ile ilgili olduğu kabul edilir.Bunula beraber ,bir heterosiklik çekirdek oluşturmak üzere benzen halkalarının birleşmesi absorpsiyon pikinin molar absorptivitesinde bir artışa sebep olur.Böyle yapılarda uyarılmış bir halin ömrü daha kısadır;bu yüzden kinolin,izokinolin ve indol gibi bileşikler için floresans gözlenir. 21

22 Benzen halkasındaki sübstitüsyon absorpsiyon maksimumunun dalga boyunda kaymaya ve karşı gelen floresans piklerinde değişmelere sebep olur.Sübstitüsyon genellikle floresans verimini etkiler,bu etkilerin bazıları çizelgede benzen türevleri için verilmiştir. Halojen sübstitüsyonunun etkisi dikkate değerdir;halojenin atom numarası arttıkça floresansın azalmasının ,triplet hale sistemler arası geçiş olasılığını arttıran ağır atom etkisinden dolayı olduğu düşünülür.İyodobenzen ve nitro türevlerinde de önayrışmanın önemli bir rol oynadığı düşünülür,bu bileşikler;bu bileşikler ;iç dönüşümden sonra uyarma enerjisini absorplayabilen kolayca kopan bağlara sahiptir. Bir aromatik halkaya bir karboksilik asit veya karbonil grubunun sübstitüsyonu genellikle floresansı durdurur.Bu bileşiklerde, n π* geçişinin enerjisi, π  π* geçişinkinden daha azdır,n π* sistemin floresans verimini normal olarak düşürür. 22

23 Benzenin Floresansına Sübstitüsyonun Etkisi (Etanol çözeltisinde)
23

24 YAPISAL RİJİTLİĞİN ETKİSİ
Floresans rijit yapılara sahip moleküllerde özellikle daha fazla olduğu ampirik olarak bulunmuştur.Örneğin ;floren ve bifenil için kuvantum verimleri ,benzer ölçme koşullarında sırasıyla yaklaşık 1.0 ve 0,2'dir.Davranıştaki bu farklılık ,başlıca florendeki metilen frubunun köprü yapmasıyla oluşan rijit artışının bir sonucu olarak ortaya çıkar. 24

25 Rijitliğin,bir metal iyonu ile kompleks oluşturdukları zaman şelat oluşturucu bazı organik maddelerin floresansındaki artışından sorumulu olduğu düşünülmektedir.Örneğin 8-hidroksikinolin floresans şiddeti çinko komplesinden çok daha azdır. 25

26 FLORESANS ÜZERİNE GRUPLARIN ETKİSİ
Elektron donörü olan -NH2 ,-OH gibi gruplar floresansı arttırdığı halde, elektron akseptörü olan -NO2 ,-X(halojenürler) -COOH, - CHO, -N=N- gibi gruplar floresansı azaltır ve bazen ortadan kaldırır. 26

27 SICAKLIK ve ÇÖZÜCÜ ETKİLERİ
Bir çok molekülde floresansın kuavntum verimi sıcaklık arttıkça azalır. Yüksek sıcaklıklarda çarpışma frekansının artması dış dönüşüm ile sönme olasılığını arttırır.Çünkü viskositesindeki azalma da benzer şekilde dış dönüşümü artırır ve aynı sonuca götürür. Bir molekülün floresansı ,ağır atomları veya yapılarında bu atomların olduğu diğer çözünenleri içeren çözücüler varlığında azalır;karbontetrabromür ve etiliyodür buna örnektir.Bu etki ,ağır atomların floresans yapan bileşiklerde sübstitüent olarak bulunduğu durumdakine benzer;orbital spin etkileşimleri triplet oluşum hızında bir artışa ve dolayısıyla floresansta bir azalışa sebep olur. 27

28 FLORESANSA pH'nın ETKİSİ
Asidik veya bazik sübstitüentleri içeren bir aromatik bileşiğin floresansı genellikle pH'ya bağlıdır. Bileşiğin iyonlaşmamış ve iyonlaşmış halleri için dalga boyu ve emisyon şiddetinin her ikisi de farklıdır.Fenol ve anilin için bu etkiyi gösteren veriler Çizelge de verilmiştir.Bu tip bileşiklerin emisyonundaki değişmeler moleküllerin asidik ve bazik formları ilgili rezonans türlerinin farklılığından kaynaklanır.Örneğin,anilinyumun bir tane iken anilinin bir çok rezonans hali vardır: 28

29 İlave rezonans formları daha kararlı birinci uyarılmış hale yol açar;bunun sonucunda ultraviyole bölgede floresans olur. Floresansa dayanan analitik işlemlerde genellikle sıkı bir pH kontrolü gerekir. 29

30 ÇÖZÜNMÜŞ OKSİJENİN ETKİSİ
Bir çözeltide,çözünmüş oksijenin varlığı,genellikle floresans şiddetini azaltır.Bu etki,floresans yapan türlerin fotokimyasal olarak yükseltgenmesinin bir sonucu olabilir. Yaygın olarak moleküler oksijenin paramanyetik özellikleri sonucu olarak sönüm meydana gelir ve sistemler arası geçiş ve uyarılmış moleküllerin triplet hale geçişi artar. Diğer paramanyetik türler de floresansı azaltma eğilimindedir. ÇÖZÜNMÜŞ OKSİJENİN ETKİSİ 30

31 Derişimin Etkisi Floresans şiddeti F, düşük derişimlerde derişim ile orantılıdır. F=KC Yüksek derişimlerde kendi kendine sönüm ve kendi kendine absorpsiyon nedeniyle negatif sapma gösterir. 31

32 EMİSYON VE UYARMA SPEKTRUMLARI
Bağıl şiddet nm nm 32

33 Bir uyarma spektrumu, uyarma dalgaboyu değiştirilirken, sabit dalgaboyunda lüminesansın ölçülmesiyle elde edilir. (aynı şartlarda elde edilen absorpsiyon spektrumu ile aynıdır). Floresans ve fosforesans spektrumları dalgaboyunun bir fonksiyonu olarak emisyon şiddeti kaydedilirken sabit dalgaboyunda uyarılmayı kapsar. Fotolüminesans genellikle uyarma dalgaboyundan daha uzun dalgaboylarında olur. Ayrıca fosforesans bantları floresans bantlarından daha uzun dalgaboylarında olur. Çünkü triplet uyarılmış enerji seviyesi genelde singlet uyarılmış enerji seviyesinden daha düşük enerjilidir. 33

34 Uranil nitrat [UO2 (NO3)2] çözeltisinin spektrumu da örnek olarak verilebilir.Bunu için tuzun M'lık bir çözeltisi hazırlanır ve absorpsiyon spektrumu alınır.Bu spektrumdan maddenin en çok absorpsiyon yaptığı dalga boyu(250 nm)tespit edilir.Bundan sonra bu 250 nm'lik ışınla(monokromatik)uranil nitrat çözeltisi devamlı olarak ışınlanır.Yayınlanan ışınlar bir florometrede kayedilir.Böylece maddenin emisyon spektrumu elde edilir. Şekilde görüldüğü gibi uranil nitrat 450 nm'den sonra emisyon yapmaya başlar ve emisyon yaklaşık 700 nm'ye kadar devam eder.Madde en şiddetli emisyonu 515 nm de(yeşil ışın) yapar. Teorik olarak bir maddenin uyarılma spektrumunun bittiği yerde floresans spektrumu onun bittiği yerde de fosforesans spektrumu başlar. 34

35 FLORESANS VE FOSFORESANS ÖLÇÜMÜ İÇİN CİHAZLAR
Numuneden gelen ışın, önce floresans uyaracak ışınları geçiren fakat floresans emisyonunun dalga boyundaki ışınları dışarıda tutan veya sınırlayan bir uyarılma filtresinden veya bir monokromatörden geçer. Floresans numuneden bütün yönlere doğru olur, fakat en uygun şekilde floresans uyarma ışınına dik açıdan gözlenir. Yayılan ışın, ölçme için floresansı ayıran ikinci bir filtreden veya monokromatörden geçtikten sonra bir dedektöre ulaşır. Referans ışın demeti ise, ışığın gücünü yaklaşık olarak floresans ışınlarınkine azaltan bir azaltıcıdan geçer . Referans ve numune fotoçogaltıcı tüplerden gelen sinyaller, sonra çıktıyı bir metreye veya kaydedici ile gösteren bir fark yükselticisine gönderilir. 35

36 36

37 37

38 FLOROMETRE VE SPEKTROFLOROMETRELERİN BİLEŞENLERİ
IŞIK KAYNAKLARI Lambalar: Düşük basınçlı civa ark lambaları ve yüksek basınçlı ksenon ark lambaları kullanılır.Filtreli Florometreler için erimiş silika pencereli,düşük basınçlı civa buhar lambası kullanılır. Lazerler:Uyarma kaynağı olarak pulslu azot gazı lazeri veya Nd:YAG lazeri ile pompalanan ayarlanabilir boya lazerleri kullanılabilir. 38

39 FİLTRE VE MONOKROMATÖRLER
Hem uyarma demetinin hem de oluşan floresans ışının dalga boyunun seçilmesi için,floremetrelerde girişim ve absorpsiyon filtrelerinin her ikisi de kullanılır.Spektroflorometrelerin çoğu en az bir bazen iki optik ağlı monokromatörle donatılmıştır. 39

40 DEDEKTÖRLER Tipik lüminesans sinyali düşük şiddetlidir,ölçülebilmeleri içim yükseltilmeleri gerekir.Duyarlı foloresans cihazlarda fotoçoğaltıcı tüpler en yagın kullanılan transduserlerdir. Spektroflorometreler için diyor-serili ve yük aktarma dedektörleri önerilmektedir.Bunlar hem uyarma hem de emisyon spektrumlarının hızlı kaydına izin verir ve kromatografik ve elektroforezde özellikle faydalıdır. 40

41 HÜCRELER VE HÜCRE BÖLMELERİ
Floresans ölçümleri için cam veya silisten yapılmış hem silindirik hem de dikdörtgen prizması şeklindeki hücreler kullanılır. Cilt yağları genellikle floresans yaptığı için hücreler üzerindeki parmak izinin önlenmesi ,absorbans ölçümlerinden daha önemlidir. 41

42 CİHAZ TASARIMLARI Tipik Bir Fotometre 42
Filtreli fotometreler kantitatif floresans analizlerinin gerçekleştirilmesi için nispeten basit ve ucuz bir yoldur.Uyarma ve yayılan ışınların dalga boylarını sınırlamak için ,ya absorpsiyon yada girişim filtreleri kullanılır.Genellikle florometreler küçük,dayanıklı ve kullanımı kolaydır. Şekilde floresans uyarımı için bir civa lambası ve transduser olarak bir çift çoğaltıcı tüpün kullanıldığı tipik bir filtreli florometre şematik olarak gösterilmiştir.Kaynak ışını,kaynak yakınıda bir referans ışın ve numune ışınına ayrılır.Şiddeti hemen hemen floresans şiddeti ile aynı olsun diye,referans demeti aralık diski ile zayıflatılır.Her iki demet birincil filtreden geçer.Referans ışın daha sonra referans fotoçoğaltıcı tüpe yansıtılır.Numune ışını bir mercek çifti ile numuneye odaklanır ve floresans emisyonuna sebep olur.Yayılan ışın ikinci bir filtreden geçer ve sonra ikinci fotoçoğaltıcı tüpe odaklanır.İki transduserin elektrik çıktıları ,analit değişken olarak kullanılan numune şiddetinin referans şiddetine oranını hesaplama için analog bölücüye beslenir. Tipik Bir Fotometre 42

43 SPEKTROFLOROMETRİ Bir çok cihaz yapımcısı ,hem uyarma hem de emisyon spektrumlarını verebilen spektrofotometreleri piyasaya sunmuşlardır.Bunlardan iki optik ağlı monokromatörün kullanıldığı bir cihazın tasarımı şekilde gösterilmiştir.Birinci monokromatörden gelen ışın,bir referans çoğaltıcıdan ve numuneden geçenn kısım olmak üzere ikiye ayrılır.İkinci monokromatör ile dispersiyondan sonra oluşan floresans ışın,ikinci bir fotoçoğaltıcı ile tespit edilir.Şekilde gösterilene benzer bir cihaz;kantitatif analiz için çok tatminkar spekrum oluşturur.Bunula beraber ,elde edilen emisyon spektrumları ,diğer cihazlardan elde edilen spektrumlarına tam olarak benzemez.Çünkü çıktı ,sadece floresans şiddetine değil ,aynı zamanda lambanın itransduserin ve monokromatörün özelliklerine bağlıdır.Bu cihazların tüm özellikleri dalga boyu ile değişir ve cihazdan cihaza farklıdır.Cihaz etkilerden bağımsız gerçek floresans spektrumu düzeltilmiş spektrum elde etmek için çok sayıda yöntem geliştirilmiştir. 43

44 FOSFORİMETRELER Fosforesans çalışmaları için kullanılan cihazlar,tasarım bakımından ilave iki bileşen gerektirmesi dışında ,florometreler ve spektroflorimetrelere benzerler.Faklı olarak; 1-Sırayla numuneyi ışıyacak ve uygun bir geciktirmeden sonra fosforesans şiddetini ölçecek bir düzenktir. 2-Aynı numuneden kaynaklanabilecek olan uzun ömürlü fosforesans emisyonu ile kısa ömürlü fosforesans emisyonu arasında fark oluşturmak için ,zaman gecikmesi gereklidir. Mekanik hem de elektronik cihazlar kullanılır ve birçok ticari cihazın fosforesans ölçümleri için aksesuarları bulunmaktadır. 44

45 45

46 CİHAZIN AYARLANMASI Cihazlar tekrarlanabilirlik bir duyarlılık seviyesine ayarlanır.Ayarlama genellikle,kararlı bir floroforun bir standart çözeltisi ile yapılır.Bunlara florofosfor maddeler denir. Bu amaçla ,en yaygın kullanılan reaktif ,derişimi yaklaşık M olan kinin sülfatın bir standart çözeltisidir. (genellikle 350 nm'deki ışınla uyarılır ve 450 nm'de ışın yayar.) Salisilik asit de bu amaçla kullanılabilir.(308 nm dalga boyunda bir ışınla uyarılırsa,o da 450 nm dalga boyunda,bir floresan ışın demeti verir.) Bu amaçla çok kullanılan bir başka ayar maddesi de asetil salisilik asittir(ASA).(Bu madde 278 nm dalga boyunda bir ışınla uyarılırsa 335 nm dalga boyunda şiddetli bir floresans ışını verir.) 46

47 UYGULAMALAR ve FOTOLÜMİNESANS YÖNTEMLERİ
Floresans ve fosforesans yöntemleri absorbansa dayalı spektrofotometrik ölçümlerden daha düşük derişim aralıklarına uygulanabilir. Floresans oluşturan kompleks oluşturarak metal iyonlarının emisyonu ölçülebilir. Florometik analizin organik ve biyokimyasal türlere çok sayıda uygulaması vardır. Florometrenin en önemli uygulamaları, gıda ürünleri, ilaç, klinik numuneler ve doğal ürünlerin analizidir. Fosforesans ve floresans yöntemleri birbirlerini tamamlama eğilimindedirler. 47

48 Fosforimetri, nükleik asitler, amino asitler; pirin ve pirimidin, enzimler, petrol hidrokarbonIarı ve pestisitler gibi maddeleri de kapsayan çok çeşitli organik ve biyokimyasal türlerin tayini için kullanılmıştır. Fosforimetri, florometri kadar yaygın kullanım aIanı bulmamıştır. (Çünkü düşük sıcaklıklara ihtiyaç duyulur ve fosforesans ölçmeleri daha zayıf kesinliğe sahiptir.) Fosforesans işlemleri potansiyel olarak daha yüksek seçiciliği sahiptir. (Davranıştaki bu farkın sebebi, etkili fosforesansın uyarılmış triplet haldeki molekül sayısını artırmak için hızlı sistemler arası geçişe ihtiyaç duyması, dolayısıyla uyarılmış singlet derişimini ve böylece de fosforesans şiddetini azaltmasıdır.) 48

49 İNORGANİK TÜRLERİN FLOROMETRİK TAYİNLERİ
İnorganik florometrik yöntemler iki tiptir: 1-Doğrudan yöntemler floresans yapan bir şelat oluşumunu ve onun emisyonunun ölçümünü içerir. 2-Tayin edilecek maddenin söndürme etkisiyle floresanstaki azalmaya dayanır. İkinci teknik anyon analizleri için yaygın olarak kullanılır. 49

50 Katyon analizleri için en başarılı florimetrik reaktifler,metal iyonu ile şelat oluşturmayı sağlayan iki veya daha fazla elektron verici fonksiyonel gruba sahip aromatik yapılardır.Yaygın dört reaktifin yapısı aşagıda verilmiştir: 50

51 Çizelge :İnorganik Türler için seçilmiş Florimetrik Yöntemler
51

52 ORGANİK TÜRLERİN FLOROMETRİK TAYİNLERİ
Florimetrik analizin organik ve biyokimyasal türlere çok sayıda uygulması vardır. Örneğin,Weissler ve White ,çok çeşitli organik bileşikler,enzimler ve koenzimler,tıbbi maddeler bitkisel ürünler ,steroider ve vitaminleri içeren 200'ün üzerindeki maddenin tayini için yöntemler verilmiştir. Florometrinin en önemli uygulamaları,gıda ürünleri,ilaç,klinik numuneler ve doğal ürünlerin analizleri ile ilgilidir. 52

53 FLOROMETRİ VE FOSFOROMETRİNİN SIVI KROMATOGRAFİSİNDE DEDEKTÖR OLARAK KULLANILMASI
Fotolüminesans ölçmeleri,kromatografik veya kapiler elekroforez kolonlardan çıkan bir numunenin bileşenlerinin tespiti ve tayini için önemli bir yöntem sağlar. Bunların çoğunda floresans,uyarıcı ışına 90 derece yerleştirilmiş bir fotoelektrik dedektör yardımıyla gözlenmektedir. 53

54 KEMİLÜMİNESANS A + B  C' C'  C +hv
Burada,C' ,C türünün uyarılmış halini göstermektedir.Bu olayda lüminesans spektrumu ,reaksiyon ürünü C'in spektrumudur. Kimyasal reaksiyon,temel haline dönerken,ışık yayan veya enerjisini daha sonra emisyon yapan veya enerjisi daha sonra emisyon yapacak başka türe aktaran ,elektronik olarak uyarılmış bir tür verildiği zaman kemilüminesans meydana gelir.Kemilüminesans reaksiyonlarına çok sayıda biyolojik sistemde rastlanır ve bu olaya genellikle biyolüminesans adı verilir.Biyolüminesans gösteren türler için örnekler ,ateş böceği ,deniz menekşeşi ve bazı deniz anası bakteriler,tek hücreli hayvanlar ve kabuklu hayvanlardır. 54

55 KEMİLÜMİNESANSIN ÖLÇÜLMESİ
Kemilüminesans ölçmeleri için cihaz,oldukça basittir ve sadece uygun bir reaksiyon kabı ve bir fotoçoğaltıcı tüpten ibaret olabilir.(Genel olarak ,tek ışın kaynağı ,analit ile reaktif arasındaki kimyasal reaksiyon olduğundan ,dalga boyu seçici cihaza gerek yoktur.) Zamanın bir fonksiyonu olarak ,bir kemilüminesans deneyinden elde edilen tipik sinyal ,reaktif ve analitin karıştırılması tamamlandığında ,hızla en yüksek değere ulaşır,sonra sinyalin daha az veya daha çok üstel bozunması takip eder. 55

56 Reaktifler karışıtırıldıktan sonra,zamanın bir fonksiyonu olarak kemilüminesans emisyon şiddeti
Kantitatif analiz için ekseriya sinyal sabit bir zaman periyodu için inrtegre edilir ve aynı yolla işlem görmüş standartlar ile karışılaştırılırlar.Alternatif olarak,pik yükseklikleri ile kullanılır.Sinyal ve derişim arasında ,geniş bir derişim aralığında genellikle doğrusal bir ilişki vardır. 56

57 KEMİLÜMİNESANSIN ANALİTİK UYGULAMALARI
Gazların Analizi: Ozon,azot oksitler ve kükürt bileşikleri gibi atmosferik kirleticilerin tayini için yüksek duyarlılık ihtayacı sonucu gaz bileşiklerinin tayini için kemilüminesans yöntemleri ortaya çıkmıştır.Bu yöntemlerin en yaygın kullanılanılanlarından biri,azot monooksit tayini için olanıdır;reaksiyon şöyledir: NO + O3  NO2* + O2 NO2*  NO hv ( = ) 57

58 Azot oksidin ozon ile reaksiyonu,azotun daha yüksek oksitlerinin tayini için de uygulanmıştır.Örneğin otomobil egsoz gazındaki azot dioksit içeriği,gazın bir çelik tüp içerisinde 700 santigrat derecedde termal bozunması ile tayin edilmiştir.Reaksiyon şöyledir: NO  NO O Numuneler ,azotun kantitatif olarak azotmonookside dönüştüğü koşullar altında oksijen atmosferinde ısıtılarak parçalanır;sonra oluşan azot monoksit ilgili yöntemle ölçülür. Diğer bir önemli kemilüminesans yöntemi atmosferik ozonun izlenmesinde kullanılır.Bu durumda,tayin,analit bir aktif silikajel yüzeye absorbe olmuş rodamin-B boyası ile reaksiyona girdiği zaman oluşan lüminesansa dayanır.Bu işlem 1 ppb'den daha az ozona duyarlıdır,cavap 400 ppb'lik ozona kadar doğrusaldır.Ozon ,analit edilenle reaksiyona girdiği zaman oluşan kemilüminesansa dayanılarak gaz fazında da tayin edilebilir.Her iki reaktifin de ozon için spesifik olduğu belirtilmiştir. 58

59 Başka önemli bir gaz kemilüminesans yöntemi ,hidrojen sülfür ,kükürt dioksit ve merkaptanlar gibi atmosferik kükürt bileşenlerinin tayini için kullanılmaktadır.Burada ,numune bir hidrojen alevinden bir kükürt dimeri oluşturmak üzere yakılır.Dimer sonra ışık emisyonu ile bozunur. 4H2 + 2SO2 S2* + 4 H2O S2*  S2 + hv Burada ,384 ve 394 nm'de pikleri olan mavi renkte ışın oluşur.Işının şiddeti uyarılmış kükürt dimerinin derişimi ile orantılıdır.Benzer şekilde,hidrojen alevinde fosfor bileşiklerinin yanması da HPO*'dan dolayı 526 nm'de emisyon yapar. 104'lük bir derişim aralığında doğrusal bir çalışma grafiği elde edildiği belirtilmiştir.Bu alev kemilüminesans tekniklerinin her ikisi de ,gaz kromatografi kolonlarından çıkan gazda kükürt ve fosfor türlerinin tespiti için kullanılmıştır 59

60 Sıvı Fazda İnorganik Türlerin Analizi
Sıvı fazda yürütülen analizlerin bir çoğu , kemilüminesans gösteren organik maddelerden faydalanılır.Bu reaktifler ,oksijenle ,hidrojen peroksitle ve diğer bir çok kuvvetli yükseltgen maddelerle kemilüminesans yükseltgenme ürünü vermek üzere reaksiyona girerler.Lüminol bu bileşiklerin en yaygın örneğidir.Onun,kuvvetli bazik ortamlarda oksijen,hidrojen peroksit ,hipoklorit iyonu ve permanganat iyonu gibi kuvvetli yükseltgenlerle reaksiyonu aşağıda verilmiştir.Bu raksiyonun yeterli bir hızda ilerlemesi için genellikle katalizöre ihtiyaç duyulur.Oluşan emisyon ,ürünün yani 3-aminoftalat anyonunun floresans spektrumuna uyar;kemilüminesans mavi olarak görülür ve yaklaşık 425 nm civarındadır. 60

61 Belirli sınırlar içinde lüminolun kemilüminesans şiddeti,yükseltgenin,katalizörün ya da lüminol derişimi ile doğru orantılıdır.Sonuç olarak ,bu reaksiyon türlerin herhangi birinin tayini için duyarlı bir yöntem verir.Örneğin,yükseltegen olarak hidrojen peroksit kullanılarak Co+2 katalizörü 0,01 nmol/L'ye , Cr+3 ,0,5nmol/L'ye ve Cu+2 ise 1 nmol/L'ye kadar olan derişimlerde tayin edilebilir.Bazı katyonlar lüminesansı azaltır,böyle durumlarda şiddetteki azalma derişim tayinin yapılmasını sağlar. 61

62 Organik Türlerin Analizi:
Analitin substrat olduğu ve ürünlerden birinin kemilüminesansla tespit edildiği bir enzim reaksiyonundan sonra bir kemilüminesans basamağının yürütülmesi yaygın bir uygulamadır.Bu tutuklanmış enzim içeren kolonlu akış sistemlerinde yaygın olarak kullanılır.Bununla beraber ,son yıllarda optik fiberlere tutturulmuş enzimlerin kullanıldığı biyosensör tasarımlarına önem verilmektedir. Ön tespit basamağında H2O2 oluşturan oksidaz enzimleri yaygın olarak kullanılmaktadır.Bir çok farklı kemilüminesans sistemlerle sadece H2O2 tayin edilemez,bir çok numunede ,özellikle sulu çözeltilerinde halihazırda bulunan gerekli yükseltgen (O2'de tayin edilebilir.Enzimin kantitatif olarak dönüştüğü düşünülerek,substratlar, H2O2'nin tayin edilebildiği nM'a kadar tayin edilebilir.Bu şekilde tayin edilen substratlar,glukoz,kolestrol,kolin,ürik asit ,amino asitler,aldehitler ve laktatı kapsar. 62

63 Ürik asit + O2 üreaz allontoin + H2O2
Bu yaklaşım,analiti tamamen eşdeğer miktardaki kemilüminesans ürününe dönüştürmek için ard arda enzim basamaklarının kullanımıyle geniletilebilir.Bu yolla,glikozdan başka şekerler,glukozidler,kolestrol esterleri,kreatin ve asetilkolin tayin edilmiştir. Sakkaroz + H2O invertaz α -D-glukoz + Fruktoz α - D-glukoz mutarotaz β-D-glukoz β-D-glukoz + O glukoz oksidaz glukonik asit + H2O2 H2O2 tayini için lüminol ve bir peroksidaz katalizörü optimum bir sistem olarak görülmektedir.Kemilüminesans şiddeti yaklaşık 100 ms'de en yüksek olur,çözücü suludur,fakat bazı organik bileşenlerle uyumludur; 103 veya 104 derişim aralığında doğrusallık gösterir ve bu bölgede gözlenebilme sınırı 0,1 pM'dır 63

64 LABORATUAR ÇALIŞMALARI
KİNİN TAYİNİ(Florimetrik): Kinin floresans özelliği çok büyük olan maddelerden birisidir.Bu özelliğinden yararlanılarak maddenin tayini yapılabilir.Tonik sulardaki kinin aşağıdaki metodla tayin edilebilir. Standart çözelti ;445 nm'de çözeltilerin floresansları ölçülür.Bunlarla kalibrasyon grafiği çizilir.Ancak ölçme basit florimetre ile yapılıyorsa;primer fitre olarak LF2 ,sekonder filtre olarak da bir jelatin kullanılır ve ölmeler ondan sonra yapılır. Bundan sonra ml de 0, ve 0, mg kinin ihtiva eden iki çözelti hazırlanır.Bunların floresansları ölçülür ve kalibrasyon grafiğinde konsantrasyonları bilinmiyormuş gibi tayin edilir. 64

65 Tonik sulardaki kinin konsantrasyonu tayin edilmek istenildiğinde tonik suyun gazının uzaklaştırılması gerekir.Bunun için numune bir behere alınıp dakika şiddetle karıştırılır.Bu şekilde gazı uzaklaştrılan tonik sudan 12,5 ml ,25 ml lik dereceli bir balona alınır ve hacmi 0,1 M sülfürik asitle 25 ml ye tamamlanır.Bu çözeltiden belirli hacimde kısımlar alınarak 0,05 ml lik sülfürik asitle belirli oranlarda seyreltilir ve floresansları ölçülür.Seyreltme tonik suyun floresansının kalibrasyon grafiği konsantrasyon aralığına girmesine kadar devam edilir.Tonik suyun bu andaki floresansı ölçülür.Kalibrasyon grafiği kullanılırak konsatrasyonu hesaplanır(Kontrol) Hesaplamada daha önce konsatrasyonu belli çözeltilerde(0, ve 0, mg/ml)hangi oranda bir düşük veya hangi oranda bir fazla değer bulunmuşsa tonik suyu konsantrasyonu tayin edilirken de aynı oran kullanılmalıdır.Örneğin ,kalibrasyon grafiğinden 0, mg/ml yerine 0, mg/ml bulunmuşsa 0,000027/0,000025=1,08 lik bir faktör bulunur.Bu faktör bulunan tonik sudan bulunan konsatrasyonla çarpılır.Faktör olarak örneğin 0,98 değeri bulunmuşa;tonik suyun konsantrasyonu 0,98 ile çarpılır.Bu çok önemli bir işlemdir unutulmamalıdır. 65

66 ALÜMİNYUM TAYİNİ Eriokrom mavi-siyah RC'den yararlanılır.Reaksiyon;pH'sı 4,8 olan bir tampon çözeltide gerçekleştirilir.Böyle bir ortamda berilyum floresans vermez.Ortamda demir,krom,nikel,kobalt ve bakır varsa;floresansı maskeler.Florür varsa;uzaklaştırılması gerekir.(alüminyumla çok sağlam kompleks verir)İçinde 10 ml amonyum asetat ,1 ml seyreltik sülfürik asit ve 3 ml erikrom mavi-siyah RC çözeltisi bulunan 100 ml'lik dereceli kaplara iyi kalibre edilmiş bir büretten (15,0),(20,0),(25,0),(30,0),(35,0),(40,0) ve (45,0) ml standart alüminyum çözeltileri ilave edilir.Bundan sonra çözeltilerin pH'sı 4,6 +/- 0,2 ye ayarlanır ve 100 ml'ye tamamlanır.Çözeltiler 1 saat kendi haline bırakılır. Alüminyum konsatrasyonu 0,0045 mg/100 ml olan standart alınarak,çözeltilerin floresans değerleri 590 nm de ölçülür.Primer filtre olarak,genelde Corning 5543 veya 5874,sekonder filtre olarak da Corning kullanılabilir.(gerekliktiği halde)Ölçülen floresans değerleriyle bir kalibrasyon grafiği çizilir.Litresinde yaklaşık 0,020 mg alüminyum ,ihtiva eden numunesinin konsatrasyonu tayin edilir. 66

67 FLORESANS VE FOSFORESANS YÖNTEMLERİ KULLANILMIŞ ÇALIŞMA ÖRNEKLERİ
1-Hücre içi serbest Ca+2 ve Zn+2 derişimlerinin spektroflorometrik olarak ölçülmesi (DENEYSEL D iYABET K KARD iYOM YOPAT iDE HÜCRE İÇİ SERBEST İYON DER İŞİMİ -Murat AYAZ/Doktora Tezi -Ankara Üniversitesi-2004) Hücre içi serbest Ca+2 ve Zn+2 ölçümleri için her iki iyona da duyarlı bir floresans boya olan fura 2 kullanılmıştır. Gözlenen Ca derişimine ait sinyallerin ölçümü PTI (Photon Technology Internetional) RatioMaster marka mikrospektroflorimetre ile yapılarak Felix (PTI) programı ile bilgisayara kaydedilip değerlendirilmiştir. 67

68 Şekil: Zn+2 için hücre içi minimum ve maksimum floresans oranlarının belirlenmesi:Maksimum [ Zn+2]i için ZnPt (1 μM), minimum değeri için ise TPEN (30 μM) kullanılarak alınmıştır. Oklar kimyasalların uygulama noktalarını temsil etmek için kullanılmıştır. 68

69 2-Tabletlerde Mebendazolün Spektroflorimetrik Tayini
(GÜ, Gazi Eğitim Fakültesi Dergisi, Cilt 24, Sayı 3 (2004) ) Bu çalışmada, tabletlerde mebendazol (MBZ) ilaç etken maddesinin tayini için spektroflorimetrik bir yöntem geliştirilmiştir. Bu amaçla, mebendazol ilaç etken maddesinin çeşitli çözücülerde floresans spektrumları alınarak en uygun çözücünün dimetil sülfoksit ve bu çözücü ortamında uyarma (λuy) ve emisyon (λem) dalga boylarının sırasıyla 390 nm ve 473,6 nm olduğu belirlenmiştir. Kalibrasyon grafikleri çizilmiş ve bunların 0-2,5 mg/L derişim aralığında doğrusal olduğu görülmüştür. Doğrudan kalibrasyon grafiklerinden ve standart katma yöntemiyle Vermazol tabletindeki mebendazol miktarı ayin edilmiştir. 69

70 Kalibrasyon eğrileri ile Ölçüm Mebendazol için kalibrasyon eğrileri 0, ,95 mg/L derişim aralığında çizilmiştir. Bu amaçla DMF ve DMSO çözücüleri kullanılarak Stok mebendazol çözeltilerinden bir seri çözeltiler hazırlanmış ve en uygun uyarma ve emisyon dalga boylarında floresans şiddetleri kaydedilmiştir. Mebendazol derişimine karşı floresans şiddetleri grafiğe geçirilerek kalibrasyon eğrileri elde edilmiştir. 70

71 Standart Katma Yöntemi Kullanarak Tabletteki Mebendazol Miktarı Tayini DMSO ortamında Vermazoldeki mebendazolün standart katma yöntemi ile tayini için 5 adet 25,0 mL′lik ölçülü balona 6,0′şar mL Vermazol kullanılarak hazırlanan DMSO’li çözelti konmuştur. Bu ölçülü balonlara stok mebendazol çözeltisinden sırasıyla 0,0; 2,0; 4,0;6,0 ve 8,0 mL ilave edildi ve hacimleri DMSO ile 25,0 mL′ye tamamlanmıştır. Her bir çözeltinin uygun uyarma ve emisyon dalga boylarında floresans şiddetleri kaydedilerekkatılan standartların derişimine karşı grafiğe geçirilmiş. Çizilen doğrunun derişim eksenini kestiği noktadan yararlanarak tabletlerdeki mebendazol miktarları hesaplanmıştır. 71

72 vermazol tablet ve (d) katkı maddeleri.
Dimetil sülfoksit ortamında ortamında λuy= 390 nm uyarma dalga boyundaki floresans spektrumları: (a) çözücü, (b) standart mebendazol çözeltisi, (c) vermazol tablet ve (d) katkı maddeleri. 72

73 Sulu çözeltideki 9,10-phenanthrenequinone'nin fosforesansı üzerine çözücü ve sıcaklık etkisi
(Rosaly S. Silva , David E. Nicodem ,Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry 162 (2004) 231–238) 73

74 Sıcaklık sabit çözünün etkisi incelenmiştir
Sıcaklık sabit çözünün etkisi incelenmiştir.MeCN spektrumu arttırmıştır.Burada çözünücün fosforesans spektrumuna etkisi gösterilmeye çalışılmıştır.Düşük sıcaklıkta daha ayrıntılı pikler görülebilmiştir.Sıcaklık arttıça kuantum verimi azaldığı için böyle bir durum gözlenir. 74

75 KOLLODİAL ORTAMDA KUMARİN-120'NİN FLORESANS ENERJİ TRANSFERİNİN İNCELENMESİ (Murat ACAR ,Yüksek Lisans Tezi ,Prof. Dr. Yavuz ONGANER Floresansa F= K'(Io-I) eşitliğine göre doğru orantılıdır.Düşük konsantrasyonda linnerdir.Bu çalışmada bu durum gösterilmiştir. 75

76 76

77 Kaynaklar 1-Enstrümental Analiz İlkeleri;SKOOG-HOLLER-NIEMAN,Bilim Yayıncılık,1997. 2-İnstrumental Analiz,Prof.Dr.Turgut Gündüz,Gazi Kitapevi,9.Baskı,2005. 3-Enstrümental Analiz,Prof.Dr.Atilla Yıldız,Prof.Dr.Ömer Genç,Hacettepe Üniversitesi Yayınları,A- 64,1993. 4- DENEYSEL D İHÜCRE İÇİ İDERİŞİİ-AYAZ/Doktora Tezi -Ankara Üniversitesi-2004. 5-Tabletlerde Mebendazolün Spektroflorimetrik Tayini,Ü, Gazi EğFakültesi Dergisi, Cilt 24, Sayı 3 (2004) 6-Sulu çözeltideki 9,10-phenanthrenequinone'nin fosforesansı üzerine çözücü ve sıcaklık etkisi,S. Silva , David E. Nicodem ,Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry 162 (2004) 231–238. 7-KOLLODİORTAMDA KUMARİ'NİFLORESANS ENERJİ İNİİİ,ACAR ,Yüksek Lisans Tezi ,. Dr. Yavuz ONGANER,2007. 77