Sunum yükleniyor. Lütfen bekleyiniz

Sunum yükleniyor. Lütfen bekleyiniz

PCR&REAL TIME PCR Araş.Gör.Ayhan ÜNLÜ. 1866.Bitkilerde kalıtımın esasları1953 DNA nın kimyasal yapısı1957 Kornberg: test tüpünde DNA.1963 Sanger :sekans.

Benzer bir sunumlar


... konulu sunumlar: "PCR&REAL TIME PCR Araş.Gör.Ayhan ÜNLÜ. 1866.Bitkilerde kalıtımın esasları1953 DNA nın kimyasal yapısı1957 Kornberg: test tüpünde DNA.1963 Sanger :sekans."— Sunum transkripti:

1 PCR&REAL TIME PCR Araş.Gör.Ayhan ÜNLÜ

2 1866.Bitkilerde kalıtımın esasları1953 DNA nın kimyasal yapısı1957 Kornberg: test tüpünde DNA.1963 Sanger :sekans prosüdürü.1966 Genetik kod1972 Berg:ilk recombinat DNA molekülü.1980s PCR ilk konvansiyonel DNA bazlı deneyler 1990s İlk gen tedavileri2000 Genetik gıda mühendisliği ‘Dolly’ insan genomunun sekanslanması

3 İlk kez 1985'de bilim dünyasına sunulduğundan itibaren polimeraz zincir reaksiyonu (PCR); hem araştırmada hem de klinik laboratuarlarda tanıda yeni bir çığır açmıstır. ABD'de Cetus şirketin'de çalisan Henry A. Erlich, Kary Mullis ve Randall K. Saiki tarafindan gelistirilmistir. Metod basitçe tüpte nükleik asitlerin uygun kosullarda çogaltilmasidir. (Science,1985:230,1350). Bu bulusundan dolayi K.Mullis, 1993 yili Nobel Kimya Ödülüne hak kazanmistir.

4 PCR Reaksiyonu? PCR reaksiyonunda üç temel basamak vardır ve çoğaltılmış ürün miktarı, bu üç adımın tekrarına bağlıdır. 1)Denatürasyon (90-95 °C) 2)Primer bağlanması (50-70 °C) 3)DNA sentezi (70-75 °C) Bu üç adım bir PCR siklüsünü oluşturur (Genetik Kavramlar S-515)

5 İlk adımda, çoğaltılacak DNA denatüre edilerek tek zincirli hale getirilir. Bu DNA temiz olmak zorunda değildir ve genomik DNA, kurumuş kan gibi adli tıp örnekleri, uzun süre saklanmış tıbbi örnekler,, tek bir saç teli, mumya kalıntıları, fosil gibi değişik kaynaklardan elde edilebilir Çift zincirli DNA ısıtılarak tek zincirli hale getirilir. ( Genetik Kavramlar S-515)

6 Sıcaklık 50 ile 70 °C arasında bir değere düşürülür ve primerlerin tek zincirli hale getirilmiş DNA’ya bağlanması sağlanır. Bu primerler yapay oliganükleotidlerdir (15-30 nükleotid uzunluğunda) ve çoğaltılacak DNA kısmının uçlarındaki tamamlayıcı dizilere özgül olarak bağlanır. Bu primerler, kalıp DNA nın sentezi için başlangıç görevi yapar. ( Genetik Kavramlar S-515)

7 DNA polimerazın ısıya dayanıklı bir şekli reaksiyon karışımına ilave edilir ve DNA sentezi 70 ile 75 °C arasındaki sıcaklıkta gerçekleşir. Bu primerler, kalıp DNA nın sentezi için başlangıç görevi yapar. ( Genetik Kavramlar S-515)

8

9

10

11 PCR da kullanılan malzemeler 1)Kalıp DNA 2)Reaction buffer (x 2,5 µl) 3)forward primer (x 0,5 µl) 4)reverse primer (x 0,5 µl) 5)dNTP (x 4 µl) 6)MgCl 2 (x 2,5 µl) 7)Taq Polimraz (x 0,25 µl)

12 PCR’ın Sınırları •Kısa ürünlerin elde edilmesi •Kontaminasyona açık olma •Taq DNA polymerase giderek inaktive olur. Taq DNA Polimerazin, yari ömrü 92.5°'de 130 dk; 95°C'de 40 dk'dir. Bu nedenledir ki PCR'in sonlarina dogru olan sikluslarda aktivitesi sinirlanmaktadir. •Ortamda Fenol kalıntılarının bulunması PCR ı inhibe eder.

13 Real Time PCR Son yılllarda PCR reaksiyonlarında sıcaklık döngüleri sağlamak için kullanılan cihazların (thermocycler) hassas ölçüm aletleriyle birleştirilmesi, real-time PCR olarak adlandırılan yeni bir yöntemin gelişmesine neden olmuştur. Real-time PCR’da ürünlerin analizi reaksiyon sırasında yapılmaktadır. Bu nedenle, agaroz jel elektroforezi, DNA bantlarının mor ötesi ışık altında görüntülenmesi gibi işlemlerin uygulanmasına gerek kalmamaktadır. Real-time PCR ürünlerinin kalitatif ve kantitatif analizlerinde, diziye özgün olmayan floresan boyalardan ya da diziye özgün problardan yararlanılmaktadır.

14 Real-Time PCR Real-time PCR monitors the fluorescence emitted during the reaction as an indicator of amplicon production at each PCR cycle (in real time) as opposed to the endpoint detection Real-Time PCR Real-time PCR Reaksiyon esnasında her bir PCR siklüsünde yeterli miktarda ürünün verdiği floresans ışığa göre çalışıp reaksiyonu aşama aşama sonuna kadar oluşan ürünü kontrol eden bir sistemdir.

15 Gerçek Zamanlı PCR ( Real Time PCR ) Işıma özelliğine sahip moleküller kullanarak PCR’ı oluşurken izleme ve miktar belirleme yöntemidir. Işıma özelliğine sahip moleküller kullanarak PCR’ı oluşurken izleme ve miktar belirleme yöntemidir.

16 Gerçek zamanlı PCR *Sinyal üretimi Amplikon miktarını PCR’ın linear fazında izlemek Primer/prob/amplikonların florojenik moleküllerle İşaretlenmesi *Cihaz Sinyali saptamak ve değerlendirmek Thermal cycler +Eksitasyon- Emisyon sistemleri+Bilgisayar

17 Gerçek Zamanlı PCR DNA’ya bağlanan Fluoroforlar İşaretli Oligoproblar 5’ - eksonükleaz problar Ardışık oligoproblar “Molecular beacon” lar İşaretli primerler

18 GERÇEK ZAMANLI PCR Kantitasyon Erime eğrisi (Tm) analizi Multipleks uygulaması

19

20 KLASİK PCR  PCR sonundaki ürünler (amplikonlar) saptanır; analiz edilir. “REAL TIME PCR” (GERÇEK ZAMANLI PCR)  PCR devam ederken ortaya çıkan ürünler saptanmaya başladığı anda değerlendirmeye alınır.

21 Real-time PCR’ın Prensipleri  Bir flöresan röporterin kantitasyonu ve tanısı üzerine kurulu  PCR ürünlerinin miktarındaki ilk önemli artış (C T - threshold cycle) hedef template’in başlangıç miktarı ile orantılıdr

22  Primer seçimi ve dizaynı  Termalcycler programları  Reaksiyon şartları  Zaman alan analiz işlemleri  Bir testin optimizasyonu  Agaroz jel elektroforezi, Blotlama  Kontaminasyon riski Klasik PCR’da Problemler

23 Real-time PCR’ın avantajları  Spesifik olmayan amplifikasyonlardan etkilenmiyor  Reaksiyon boyunca veri toplanarak aynı anda analiz imkanı  PCR sonrası ürünlerin ikincil bir işlemi gerekmiyor (yüksek verimlilik,düşük kontaminasyon riski) (yüksek verimlilik,düşük kontaminasyon riski)  ultra-rapid siklus (30 dak. to 2 saat)  10¹º katı bulan geniş dinamik aralık  İki kat değişikliği hızla tanımlayabilmekte  Spesifik erime eğrisi analizleri ile spesifik amplifikasyonların tanımlanması amplifikasyonların tanımlanması  Duyarlılığı, özgüllüğü ve tekrarlanabilirliği yüksek  Konvensiyonel PCR’dan daha pahalı değil

24 Real-time PCR’ın dezavantajları Real-time PCR’ın dezavantajları  teknik donanım, alt yapı, beceri ve tecrübe gerektiriyor  Yüksek ekipman ihtiyacı  Aynı ve farklı laboratuvar’lar arasında sonuçlar arası faklılıklar  Standardizasyon problemi

25  Tüp içinde oluşan fluorescence saptanır  Amplifikasyon sırasında saptama yapılır Real-Time PCR

26 (www)www

27 Sık kullanılan Real-Time PCR Systemleri

28

29 BioRad iCycler

30 Corbett Research Rotor-Gene 3000

31 SmartCycler

32 MJ Research Chromo4

33 Idaho Technology Rapid Cycler

34 Roche LightTyper & LightCycler

35 Stratagene

36

37  Exponential Faz  Linear Faz (yüksek farklılık)  Plateu Faz (End-point) PCR’ın TEMEL FAZLARI

38

39 Exponential Faz  PCR ürün miktarı her siklusta tam olarak iki kat artar  Reaksiyon spesifik ve tamdır  Reaksiyonun Etkinliği %100 dür  Reaksiyonun tüm bileşenleri tazedir.

40

41

42 Linear Faz (yüksek farklılık)  Reaksiyonun kompanenetleri tükenmeye başlar  Reaksiyon yavaşlar  Oluşan PCR ürünleri değrade olmaya başlar

43

44 Plateu Faz (End-point) •Geleneksel PCR larda jel bazlı tanı •Reaksiyon sonlanmakta •Yeni PCR ürünü oluşmamakta •PCR ürünleri değrade olması artmakta

45

46

47

48

49

50 Floresan Prob Sistemleri  Hidrolizasyon problar • (TaqMan (), Beacons, Scorpions) • (TaqMan ( PE Biosystem ), Beacons, Scorpions)  Hibridizasyon problar (Light Cycler () (Light Cycler ( Roche )  DNA’ya bağlanan (binding) boyalar (SYBR Green) (SYBR Green)

51

52 LightCycler sisteminin bir uygulamasında; yalnızca çift zincirli DNA’ya bağlandıklarında floresans veren boyalar (Cyber green I) kullanılarak, amlifikasyona bağlı DNA artışı, ortaya çıkan floresansın miktarı ile ölçülmektedir. Primerin bağlanmasını takiben gerçekleştirilen uzama aşamasında hedef DNA’nın çift sarmal hale gelmesiyle DNA’ya bağlanan “cyber green” miktarı artmakta ve buna bağlı olarak yayılan floresans miktarında artış gözlenmektedir.

53

54

55 SYBR Green (çift zincirli DNA ya bağlanmakta)  çift zincirli DNA ya bağlanmakta)  çift zincirli DNA ya bağlandıkları sürece floresan emisyonu olmakta  Spesifik olmayan bağlanmalar gerçekleşmekte  yoğun optimizasyona ihtiyacı yok

56 Taqman LightCycler’ın diğer bir uygulama şekli, hedefe özgül problar kullanmaktır. Burada problarla testin özgüllüğü artırılmıştır. Problardan biri 3’ ucundan floresans boya ile işaretli (donör boya), diğeri 5’ ucundan alıcı boya (acceptor dye) ile işaretlenmiştir. Problar hedef amplikonlar üzerinde birbirine yakın (1-5 nükleotit uzaklıkta) yere bağlanmakta ve işaretli uçlar yan yana gelmektedir. İki boyanın yan yana gelmesiyle açığa çıkan enerji ikinci prob üzerindeki alıcı boyayı etkileyerek floresans oluşumuna yol açmaktadır. “Fluoresance resonance energy transfer, (FRET)” olarak adlandırılan bu enerji transferi sonucunda oluşan floresans miktarı, ortamdaki hibridizasyonun derecesine diğer bir ifade ile PCR siklusu süresince oluşan amplikonların miktarına bağlı olarak artmaktadır.

57 TaqMan sisteminde 5’ ve 3’ uçlarından florokrom maddelerle işaretli prob kullanılmaktadır. Prob’un 5’ ucunda raportör florokrom (6-carboxyfluorescein =6- FAM), 3’ ucunda ise baskılayıcı florokrom (6-carboxy- tetramethyl-rhodamine =TAMRA) bulunmaktadır. Prob, tek sarmal hale getirilen hedef molekül üzerinde, primerlerin bağlanma bölgesinin arasında kalan yere bağlanır. Prob-hedef molekül arasındaki hibridizasyon devam ettiği sürece raportör florokrom maddenin sinyal oluşturması, 3’ uçtaki baskılayıcı florokrom tarafından engellenmektedir. Primerlerin hedef nükleik asite bağlanmasını takiben başlatılan primer uzaması prob’un bağlandığı noktaya kadar geldiğinde, sentezin devam edebilmesi için Taq DNA polimeraz enzimi 5’→3’ nükleaz aktivitesini kullanarak probu 5’ uçtan yıkmaya başlar. Böylece raportör florokrom serbest hale geçer ve sinyal oluşturur (Şekil 5). Her siklusta üretilen amplikon miktarına paralel olarak sinyal şiddeti de artmaktadır

58 TaqMan FRET Fluorescent Resonant Energy Transfer

59 Nigel Walker, NIEHS (www) (www)

60

61 Spesifite TaqMan Yüksek spesifiklik SYBR Green Düşük spesifite

62 Molecular Beacons

63 Amplicon molecular beacons A B C FRET real-time real-time Reporter Non-fluorescent Quencher Excitation ANNEALING

64 Scorpion

65

66 Yeni Prob Sistemleri  Peptide nucleic acids (PNAs) nükleikasit anologları (Tm 15) nükleikasit anologları (Tm 15)  Minor Groove Binding (MGB)  Locked Nucleic acid (LNA) Oligonüklotid riboz anoloğları Oligonüklotid riboz anoloğları

67 Threshold Cycle  threshold cycle veya CT değeri  Rn de önemli artışın olduğu ilk siklusu ifade eder

68 nedir C T ?

69 Rn = (Rn+)- (Rn-) (normalize reporter signal)  Rn+ Templatide içeren reaksiyona giren tüm komponentlerin floresan emisyonu  Rn- negatif kontrolün (pasif Boya) ve reaksiyone olmayan örneklerin floresan emisyonu  Rn Rn+ ve Rn- arasındaki fark olup CT Değerinin hesaplanmasında kullanılan temel göstergedir Değerinin hesaplanmasında kullanılan temel göstergedir

70 cycle number RnRn CTCT Threshold RnRn Sample No Template Control Nedir Rn? RnRn RnRn

71 (www)www

72 Geri (“Revers”) Transkripsiyon PCR •RNA PCR olarak ta bilinen RT-PCR iki aşamalı olup RNA’dan tamamlayıcı DNA sentezi (geri transkripsiyon) ve tamanlayıcı DNA(cDNA)’nın da standart PCR yoluyla çoğaltılması aşamalarını kapsar.RT-PCR tek aşamalı bir reaksiyonla da gerçekleşebilir. T.thermophilus (Tth) DNA polimerazı gibi bazı polimerazlar mangan varlığında hem RNA hem de DNA kalıp ipliklerini kullanabildiğinden tüm işlem aynı tüpte tek aşamada yapılabilmektedir. RT-PCR, mRNA veya viral RNA miktarlarının belirlenmesi ile RNA düzeyinde gen anlatımında oldukça duyarlı bir yöntemdir.

73 “IN SITU” PCR PCR ile ilgili çalışmalarda diğer önemli bir aşama, lam üzerine tespit edilen enfekte hücrede bulunan mikroorganizmaya ait hedef DNA’nın amplifikasyonu ve sonucun “in situ” hibridizasyon ile gösterilmesidir. Kısaca; lam üzerine doku veya hücreler konduktan sonra, havada kurutulur ve 105°C’de 30 saniye bekletilir. Paraformaldehitli fosfat tamponlu tuzlu su (%2’lik) ile bir saat işleme alınır. 3 x 0.1 M PBS (Phosphate buffer saline) ile bir kere, 1 x 0.1 M PBS ile üç defa yıkanır. Proteinaz K enzimi (5 μg/ml) ile 55°C’de iki saat muamele edildikten sonra, 96°C’de iki dakika tutularak Proteinaz K inaktive edilir. Lam su ile yıkanır ve havada kurutulur. Sonra lamın üzerine amplifikasyon solüsyonu eklenir ve plastik kapakla kapatılır. Plastik kapağın etrafı oje ile çevrilir. Lam, otomatik termal “cycler” üzerine konulur. Aluminyum kağıt ile kapatıldıktan sonra amplifikasyon başlatılır. Amplifikasyondan sonra lam absolü etil alkol içinde 3-5 dakika tutulur. Sonra 92°C’de 30 saniye denatürasyon sağlanır ve 2 x SSC (Sodyum klorür + Sodyum sitrat)tamponu ile yıkanır. Bunu takiben özgül problarla “in situ” hibridizasyon yapılarak amplifikasyon sonucu gözlenir

74 ÇALIŞMA RAPORU •G-Aktin yapımı 1)G-aktin tamponu hazırandı. - 5 mM K-Fosfat - 0,5 mM ATP - 0,1 mM CaCl 2 - 0,5 mM DTT - 1 mM NaN 3 2)Hazırlanan tamponun içinde Tavşanın çizgili kas hücrelerinden elde edilen lifler 4-5 saat manyetik karıştırıcıda çözülür. 3)Çözülen örnek Tülbent bezden süzüldükten sonra 0,5 lik filtreden geçirildi. 4)Elde edilen örneklerin hacmine göre 10 mM NaCl ve 3 mM MgCl 2 eklenerek gece polimerleşmeye bırakıldı.

75 Aktin Yapımı 5) Örnekler x g de 4 saat santrafüj edildi. 6) Pelet alınır ve üzerine 2,5 ml depolimerleşme tamponu eklenir ve vortex ile pelet tampon içinde çözüldü. 7) x g de 45 dakika santrifüj edilen örneklerden süpernatant alınır. 8) Alınan örnek G aktin tamponunda 4 saat dialize yatırılır. 9) Dializ edilen örnekler elektroforez yapılarak G-aktinin oluşup oluşmadığı gözlendi.

76

77 G-Aktin den F-Aktin eldesi •Elde edilen aktine 10 mM NaCl ve 3 mM MgCl 2 eklenerek polimerleşmeye bırakıldı •Polimerleşme sırasında 0, 5, 10, 20, 60 dakilarda örneğin vizkosluğu ölçüldü.

78 Bakteriden EF-2 Eldesi •1. Daha önceden 180° C'de 2 saat kuru etüvde otoklavlanan cam kap içine 100 ml LS (50 ug/ml ampisilin) kondu. Bug'dan pipet ucuyla alınarak, 100 ml LB (w/amp) içine kontamine edildi. Gece boyunca 37° C'de shakerda sallanmaya bırakılacakdı. •2. Ertesi sabah önceden otoklavlanmış cam kaplar içine 500 ml LB (w/ampisilin) kondu. Gece boyunca çoğalan bakterilerden her 500 ml'ye 1 ml gelecek şekilde konulduktan sonra 37 C'de shakerda sallanmaya bırakıldı. •3. Çoğalan bakterinin yarım saatlik zaman dilimlerinde 600 nm'de OD değerleri ölçüldü. OD değeri 600 nm dalga boyunda 0,5 - 0,6 değerine ulaşınca 0.1 mM olacak şekilde IPTG ve 20 ug/ml olacak şekilde 500 ml ampisilinli LB medyumu içerisine 2 ul chloroamphenicol eklendi. IPTG ve cloroamphenicol eklemeden hemen önce daha sonra poliakrilamid jelde kontrol edebilmek amacıyla 0. saat için 1 ml örnek alındı. •4. Shaker'da 25 C'de 4 saat boyunca inkübasyona bırakıldıktan sonra, 4. saatin sonunda poliakrilamid jelde kullanmak üzere 1 ml örnek alındı. •5. Buz içinde konulan veya santrifüj godelerine aktarılan bakteriler 3500 rpm'de 4 C'de 10 dakika boyunca santrifüj edilip bakterilerin çökmesini sağlandıktan sonra 2 ml lyzis bufferda çözüldü. •6. Sonikatörde buz içindeyken saniye kadar süt beyazı rengine olana dek tutulup daha sonra -20 C'ye kaldırıldı. •7. Poliakrilamid jelde O. saat ve 4.saat için aldığın örnekleri yürütüp coommassie boyama yaparak protein elde edilip edilmediğini kontrol edildi. •8. istenen protein poliakrilamid jelde görüldükten sonra, pürüfikasyon aşamasına geçildi.

79


"PCR&REAL TIME PCR Araş.Gör.Ayhan ÜNLÜ. 1866.Bitkilerde kalıtımın esasları1953 DNA nın kimyasal yapısı1957 Kornberg: test tüpünde DNA.1963 Sanger :sekans." indir ppt

Benzer bir sunumlar


Google Reklamları