Sunum yükleniyor. Lütfen bekleyiniz

Sunum yükleniyor. Lütfen bekleyiniz

DNA PÜRİFİKASYONU. DNA Genetik bilgiyi taşıyan çift sarmal moleküldür. 5C’lu şeker, fosfat ve bazları içeren nükleotidlerden oluşur. Doğadaki canlıların.

Benzer bir sunumlar


... konulu sunumlar: "DNA PÜRİFİKASYONU. DNA Genetik bilgiyi taşıyan çift sarmal moleküldür. 5C’lu şeker, fosfat ve bazları içeren nükleotidlerden oluşur. Doğadaki canlıların."— Sunum transkripti:

1 DNA PÜRİFİKASYONU

2 DNA Genetik bilgiyi taşıyan çift sarmal moleküldür. 5C’lu şeker, fosfat ve bazları içeren nükleotidlerden oluşur. Doğadaki canlıların tümüne yakın kısmında genetik materyal DNA’dır.

3 Çekirdek Mitokondri Kloroplastlarda bulunmaktadır. DNA hücre içerisinde:

4 DNA hücre içersinde serbest halde bulunmaz. Belli bir organizasyonu vardır. DNA nın çok büyük bir kısmı nukleusta, bir miktarı ise mitokondri ve kloroplastta bulunur. DNA molekülleri nukleuslarda da serbest halde bulunmazlar. DNA kromatin iplikçikleri ve sonrada kromatinleri verecek şekilde özel bazı proteinler ve RNA ile bir kompleks yapı meydana getirir. Kromatin yapı taşı ;DNA, histon proteinler,histon olmayan proteinler,HMG proteinler ve RNA dan meydana gelmiştir. ***High Mobility Group- hareket yeteneği yüksek grup olarak adlandırılan proteinler

5 Bazı kimyasal maddeler ve enzimler ile canlı hücrelere ait hücre zarı veya canlı hücre duvarının yıkılıp DNA nın ortaya çıkarılmasına DNA saflaştırılması denir.Buda yukarıda bahsedilen yapıların (histon proteinler,non-histon proteinler,HMGler) hepsinin uzaklaştırılması durumudur.

6 DNA PÜRİFİKASYON YÖNTEMLERİNDE BİRBİRİNİ İZLEYEN ÜÇ TEMEL AŞAMA BULUNMAKTADIR: 1- Hücrenin parçalanması ile yüksek molekül ağırlıklı DNA’nın açığa çıkması, 2-Denatürasyon veya proteoliz ile DNA-protein kompleksinin ayrılması ve DNA’nın çözünür duruma getirilmesi, 3-DNA’nın basit enzimatik ve/veya kimyasal yöntemlerle proteinler, RNA ve diğer makromoleküllerden ayrılması,

7 BAŞARILI BİR DNA SAFLAŞTIRILMASI İÇİN

8 1-Hücresel organellerin açığa çıkması için hücre duvarı kırılmalıdır İlk aşama duvarın zayıflatılmasıdır.Fiziksel olarak dondurup çözme yada kimyasal maddeler kullanılarak yapılır. 2-Hücre membranı parçalanmalıdır. Bu sayede DNA ekstrasyon buffer içinde serbest kalır.Bu genelde SDS gibi deterjanların kullanılması ile olur. 3-DNA nükleazlardan korunmalıdır. EDTA gibi deterjanlar bu yüzden kullanılır.

9 5-DNA’nın kırılması en aza indirilmeli. Solusyon içersindeki DNA çalkalanarak bile kırılabilir. 6-DNA’nın ortamdaki diğer moleküllerden ayrılması. Genelde bu aşama DNA’nın fiziksel yada kimyasal etkilere maruz kalması ile sağlanır.Örneğin DNA kimyasal olarak çöktürülebilir.Bu işlemde en çok kullanılan kimyasal etanol’dür.Fiziksel uygulamada santrifüj yapılır.Santrifüj hızı ve zamanı ayrılması istenilen molekülün ağırlığına göre değişkenlik gösterir. 4-DNA protein kompleksinin çözünmesi. Buffer/doku karışımına kloroform veya fenol karışımı eklenerek DNA’dan proteinlerin ayrılması sağlanır.

10 Enzimler(RNase) RNA’yı yok etmek için, Enzimler (Proteases) DNA molekülüne bağlı olarak bulunan proteinleri yok etmek için, İzopropanol ve etanol: Nükleik asitlerin çöktürülmesinde, Amonyum sülfat ve sodyum sülfat:Proteinlerin çöktürülmesinde, Etil asetat, Toluen, SDS membran yapısını bozmada, Saflaştırılan DNA +4°C’da uzun süre saklanabilir.

11 BakterilerdenMayalardan MemelilerdenBitkilerden Kromozom DNA’sının Saflaştırılması

12 Organizma: E. coli, B. Subtilis Bakterilerden kromozom(genom) DNA’sı pürifikasyonu:

13 Çözelti üzerine Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) ve proteinaz K eklenir ve 37°C’de 1 saat bekletilir (bu aşamada hücreler parçalanır). Süpernatant atıldıktan sonra Tris – EDTA (TE ph:8) tamponu içinde çözündürülür Bakteri kültürünün 1.5 ml’si rpm de 5 dakika santrifüj edilir. LB(Luria Bertani) besiyerine tek koloniden ekim yapılır ve 150 devir/dakika hızda, 37°C’de bir gece bekletilir.

14 Süpernatant ayrı bir tüpe alınarak izopropanol eklenir ve DNA çökünceye alt-üst edilerek karıştırılır.(Bu aşamada DNA’nın iplikçikler şeklinde çökeldiği gözlenir) Süpernatant alınarak üzerine fenol/kloroform/izoamil alkol eklenerek rpm’de 5 dakika santrifüjlenir. Eşit hacimde kloroform/izoamil alkol (CIA) eklenerek rpm’de 5 dakika santrifüjlenir. Üzerine NaCI ile NaCI/CTAB (setil trimetil amonyum bromür) çözeltileri eklenerek 65 °C’de 10 dakika bekletilir.

15 Çökelti Tris-EDTA (pH:8) içinde yavaşça vurularak çözündürülür. Tüpün ağzı açık durumda oda sıcaklığında (10-15 dak.) ya da 60 °C’de birkaç dakika bekletilerek alkol tamamen uçurulur. Pelletin üzerine etanol eklenerek DNA yıkanır ve alkol geri boşaltılır. DNA, rpm’de 10 dakika santrifüjlenir

16 PÜF NOKTALAR:

17 Bitki hücreleri genelde çok sayıda sekonder bileşik içerir, bunun sonucu olarak belirli türlerde yüksek düzeydeki sekonder bileşikler DNA’nın saflığını bozmaktadır.Bu sorunun üstesinden gelmek içinalternatif ekstrasyon bufferleri kullanılır. DNA ekstrasyon bufferlerı ph 8.0 hatta ph 9.0 civarında olmalıdır

18 Kromozom dışı DNA’nın saflaştırılması PlazmidOrganel

19 Kromozom dışı DNA’nın izolasyonu Kromozom dışı DNA olarak bakterilerde plazmid adı verilen, sitoplazmada genom DNA’sından bağımsız replikasyon yapabilen, çift zincirli, genellikle halkasal(ender olarak doğrusal) olan DNA molekülleri bulunmaktadır. Ökaryotlarda ise nukleus DNA’sından bağımsız kalıtım gösteren organel DNA’larına mitokondri (mtDNA) ve kloroplastlarda (ctDNA) rastlanmaktadır. Mitokondri ve Kloroplast DNA’sı, çift zincirli halkasal bir molekül olamakla birlikte boyutu organizmalara göre değişmektedir.

20 Plazmid DNA’sı İzolasyonu Plazmitlerin rekombinant DNA teknolojisi çalışmalarında taşıyıcı DNA(vektör) olarak geniş çapta kullanılması plazmid izolasyon yöntemlerinin gelişmesine yol açmıştır.

21 Organel DNA’sı izolasyonu Organel DNA’sı izolasyonlarında en önemli aşama öncelikle organelin parçalanmamış şekilde ayrılması olduğundan dolayı,bu olay 2 aşamada gerçekleştirilir. ***Organelin izolasyonu ***Organel DNA’sının izolasyonu

22 Mitokondri İzolasyonu Materyal: Somatik hibritlerin çeşitli bitki dokuları Mitokondriyal DNA’nın saflaştırılması

23 Taze dokular (yaprak, çiçek vb.) buzda soğutulmuş uygun tampon içinde parçalanır yada Patates tuberi elektrikli meyve suyu sıkacağından geçirilir ve eşit hacimde uygun tampon eklenir. Naylon bir membrandan filtre edildikten sonra büyük hücre parçalarının uzaklaştırılması için 500×g’de 10’ dakika santrifüj edilir. Plastitlerin uzaklaşması için süpernatant 2600 ×g’de 15’ da 2 kez ve bir kez de 10’ santrifüj edilir. Süpernatant alınır ve mitokondrileri çöktürmek için ×g’de 15’ santrifüj edilir. Lizis olmuş nükleus parçalarını içeren üst sıvı atılır, mitokondrileri içeren çökelti buzda soğutulmuş uygun tampon içinde çözündürülür. Mitokondri çökeltisi sıvı azotta dondurulduktan sonra -80°C saklanır yada doğrudan DNA izolasyonu yapılabilir.

24 Mitokondri DNA’sı izolasyonu

25 Mitokondri çökeltisi lizis tamponu içerisinde çözündürüldükten sonra Proteinaz K eklenerek 37°C’de 1 saat bekletilir. Amonyum asetat ve TE ile doyurulmuş fenol/kloroform eklenerek rpm’de 5’ santrifüj edilir. Süpernatant kısmı ayrı bir tüpe alınarak absolü etanol alınarak eklenerek -20 °C’de bir gece bekletilir ×g’de 20’ santrifüjlemeden sonra çökelti distile su içinde çözündürülür

26 AN İ MASYON

27

28 SORULAR ?


"DNA PÜRİFİKASYONU. DNA Genetik bilgiyi taşıyan çift sarmal moleküldür. 5C’lu şeker, fosfat ve bazları içeren nükleotidlerden oluşur. Doğadaki canlıların." indir ppt

Benzer bir sunumlar


Google Reklamları