HPLC YÖNTEMİNDE KOLON SEÇİMİ

... konulu sunumlar: "HPLC YÖNTEMİNDE KOLON SEÇİMİ"— Sunum transkripti:

1 HPLC YÖNTEMİNDE KOLON SEÇİMİ

2 Kolon Verimliliğini Doğrudan Etkileyen Parametreler
Parçacık Boyutu Kolonun Uzunluğu Kolon Dolgu Maddesinin Fiziksel Özellikleri

3 Ters faz (RPC)’da durgun faz apolar iken kullanılan hareketli faz ise polardır. RPC sıvı kromatografinin en çok kullanılan türüdür ve hidrofobik türlerlerin ayrımı için kullanılmaktadır.RPC çalışmalarda end-capping işlemi olmuş kolonlar tercih edilmelidir. Normal faz (NPC)’da durgun faz polar iken kullanılan haraketli faz apolardır. Kolon dolgu maddesi olarak saf silika kullanılmaktadır. Kullanılan diğer durgun fazlar ise siyano ve aminodur. HILIC olarak bilinen hidrofilik etkileşim kromatografi türün de ise durgun faz polar yapıdayken, haraketli faz ise daha az polarlıktadır. Bu kromatografik tür normal faz ile ters faz türlerinin bir bileşimidir. Kullanılan durgun faz normal faz ile hareketli faz ise ters fazınki ile aynı türdedir.

4 KROMATOGRAFİK ANALİZ YÖNTEMLERİ
GIDALARDA RENK KATKI MADDELERİ HAZIRLAYAN: AYKUT ERSOY

5 DOĞAL RENKLENDİRİCİLER
Kantaksantin: Koyu menekşe renginde kristaller veya kristalin toz halinde bulunur.Oksijene ve ışığa karşı duyarlıdır. Anatto: Güney Amerika, Doğu Afrika ve Hindistan’da yetişen Bixa orellana ağacının tohumlarından elde edilen ve turuncu-sarı renkli yağda çözünen doğal bir renklendiricidir.

6 Klorofiller: Çimen, ısırganotu gibi çeşitli bitkilerden ekstraksiyonla elde edilen yağda çözünen pigmentlerdir. Mg içeriğine bağlı olarak zeytin yeşilinden koyu yeşile kadar değişen renk tonlarında bulunurlar. Karotenler: Anatto, havuç, palmyağı gibi karaton içeren çeşitli bitkisel kaynaklardan ve yenilebilir yağlardan ekstraksiyonla elde edilirler.

7 İYON DEĞİŞİM KROMATOGRAFİSİ İLE BALIK PROTEİNLERİNİN SAFLAŞTIRILMASI

8 İYON DEĞİŞİM KROMATOGRAFİSİ
Proteinleri, üzerlerinde taşıdıkları net yüklere göre ayırır. Durağan faz genellikle selüloz, dekstran ve reçine gibi polimerlerden oluşmaktadır. Mobil faz ise tampon+örnek bulunan yüklü moleküllerdir. Kolon pozitif (anyon değiştirici) veya negatif (katyon değiştirici) yüklü bağlayıcı gruplar içeren reçineyle doldurulur. Protein karışımı düşük iyonik güçteki bir tamponla kolon boyunca taşınır. Bu tamponun pH’sı hedef proteinin reçineye bağlanmasını teşvik edecek değere sahip olmalıdır.

9 Eğer tampon pH’sı proteinin pI’dan (izoelektrik noktası) daha küçük tutulursa proteinin yükü pozitif olur ve bir katyon değiştirici ile bağlanır. Bunun tersine tampon pH’sı proteinin pI’dan daha küçük tutulursa proteinin yükü negatif olur ve bir anyon değiştirici ile bağlanarak kolonda tutulur. Elektriksel iletkenlik dedektörü ile iyonların algılanması sağlanır ve sinyale dönüştürülüp kaydedilir. Saflaştırma işleminin başarılı bir şekilde gerçekleştirilmesinde; Mobil fazın pH değeri Kolon akış hızı ve sıcaklığı önemli faktörlerdir.

10 Yüksek Performans Sıvı Kromatografi Yöntemi ile Şaraplarda Sorbik Asit Tayini
Sorbik asit sulu ortamda pKa değeri 4.75 olan zayıf bir asittir. Sorbik asit tuzları, maya ve küflere karşı antimikrobiyal olarak kullanılan bileşiklerdir.

11 Sorbik asit, gıdanın biyolojik olarak bozulmasını önler ve çoğu zaman kimyasal bozulmayı önleyen antioksidanlarla birlikte kullanılır. Farklı gıda ürünlerinde sıklıkla kullanılmasına karşın izin verilen düzeylerin üzerinde kullandığında zararlı olabilmektedir. Kullanılması düzenlenmiş ve belli sınırlar getirilmiş olan bu bileşiğin belirlenmesi ve kantitatif tayini oldukça önemlidir.

12 Sorbik asit tayininde önceleri titrimetik yöntemlerden yararlanılmıştır. Son zamanlarda HPLC yöntemi (UV veya floresans dedektörle birlikte) bu bileşiğin tayini için kullanılan en yaygın yöntemdir. Keza iyon çifti oluşturucu HPLC tekniği de sorbik asit tayini için kullanılabilmektedir. Sorbik asitin tayininde misaller elektro kinetik kapilar yöntemde kullanılmaktadır.

13 BİYOJEN AMİNLER VE hplc yöntemİ BİYOJEN AMİN ANALİZİ

14 Bİyojen Amİn Analİz Yöntemlerİ
Histamin ve diğer biyojen aminlerin nitel ve nicel tayinleri için kromatografi, florimetri, kapiler elektroforez v.b. teknikler kullanılmaktadır. Bunların içerisinde kromatografik yöntemler en uygun yöntemlerdir. Yüksek performans sıvı kromatografisi (HPLC), ince tabaka kromatografisi (TLC) ve gaz-sıvı kromatografisi (GLC) biyojen amin analizlerinde yoğun bir şekilde kullanılan kromatografik yöntemlerdir . Bunlar içinde HPLC en çok kullanılan yöntemdir.

15 Kromatografİk Koşullar
Akış hızı : 1 ml/dakika Pompa : Dereceli elüsyon pompası Enjeksiyon Miktarı : 10 μl Kolon : Phenomenex, Bondocolone C18, 10 μ, 3,9x300 mm Sıcaklık : 21oC, 25oC ve 30oC Ara Yüzey : HP Dedektör : Waters 486, UV dedektör, λ=254 nm Hassasiyet : 0,5 A.U.F.S. Mobil Faz : (A) Metanol: Su (55:45, v/v) (B) Metanol

16 HPLC İLE BENZOAT ANALİZİ

17 Kabul edilebilir günlük alım miktarı: 5 mg/kg vücut ağırlığı
Benzoik asit (E210) Kaynağı:  Benzoik asit, benzoatlar ve benzoik asit esterleri genellikle meyvelerin çoğunda, özelliklede kirazda bulunur. Kızılcık benzoik asitin oldukça zengin bir kaynağıdır. Meyvelere ek olarak, benzoatlar mantarlarada, tarçında, karanfilde ve bazı süt ürünlerinde ( bakteriyel fermentasyon sonucu) doğal olarak bulunurlar. Ticari amaçlar için, benzoik asit toluenden kimyasal olarak hazırlanır. Fonksiyon ve Özellikleri:  Benzoik asit ve benzoatlar asidik gıdalarda ,hem mayalara hem de mantara karşı koruyucu olarak kullanılır. Bakterilere karşı çok etkili değildirler ve pH 5 in üzerindeki ürünlerde ( zayıf asidik veya nötr ) etkisizdirler. Yüksek konsantrasyonları sonucunda ekşi tat ortaya çıkar, bu uygulamaları sınırlandırır. Daha iyi çözünebilmesine bağlı olarak, benzoatlar sıklıkla hazırlanır. Ürünler:  Benzoik asit ve benzoatlar geniş bir aralıktaki asidik ve zayıf asidik ürünlerde kullanılır. Kabul edilebilir günlük alım miktarı:  5 mg/kg vücut ağırlığı Yan etkileri:  Kullanılan konsantrasyonlarda yan etkileri yoktur. Bazı insanlarda benzoik asit ve benzoatlar histamini serbest bırakabilir ve böylece yalancı alerjik reaksiyonlara neden olur.

18 PRENSİP Benzoik asit deney numunesinden MeOH ve su karışımı ile ekstrakte edildikten sonra ters faz yüksek işlevli sıvı kromotografi ile tespit edilmesi ilkesine dayanır. METOT Örneğin Hazırlanması Ekstraksiyon Ekstraktın temizlenmesi Ekstraktda bulunan maddelerin ayrılması (HPLC Enjeksiyon) Ayrılan maddelerin tanımlanması Miktarın tespiti Veri ve kayıtların tutulması

19 HPLC YÖNTEMİ İLE GIDALARDA ŞEKER ANALİZİ

20 ŞEKER Şeker veya sakkaroz çoğu bitkinin bünyesinde bulunur.
Fakat bünyesinde ekonomik olarak şeker elde edilebilecek kadar şeker bulunduran iki bitki vardır:                    Şeker kamışı, şeker pancarı. Şeker kamışının bünyesinde yaklaşık olarak %12-16 şeker bulunur.

21

22 AROMA MADDELERİNDE GAZ KROMOTOGRAFİSİ
Gaz kromotografisi süt, peynir, et, meyve, sebze, meyve suyu ve şarap gibi bir çok gıda ürünündeki aroma bileşenlerinin tanımlanması ve bu bileşenlerin gıdanın tüm aroması üzerine etkilerinin ortaya konması amacıyla yaygın kullanılır. Gıdalarda aroma aktif bileşenlerin belirlenmesi için kullanılan en yaygın metot ilk defa 1964 yılında Fuller ve arkadaşları tarafından önerilen Gaz Kromatografisi- Olfaktometri (GCO) tekniğidir.

23 GCO sistemi iki kısımdan oluşur
GCO sistemi iki kısımdan oluşur. Birinci kısım kromatografik kısım olup aroma maddelerinin örneklenmesi, ekstraksiyonu, ayrımı ve aletsel olarak belirlenmesini içerirken, ikinci kısım ise insan kısmı olarak adlandırılmakta ve aroma maddelerinin kalitesini, yoğunluğunu, zamana bağlı değişimlerini ve tanımlanmasını içermektedir. GCO’ da temel prensip gıdalardan izole edilen aroma ekstraktının gaz kromatografisine enjekte edilmesi ve ekstraktın kolon çıkışında eşit bölünerek hem kimyasal dedektöre gönderilerek aroma maddelerinin kromatografik olarak tespit edilmesine hem de koklama ünitesine gönderilerek aroma kalitesinin belirlenmesine dayanır.

24 GCO ANALİZ METOTLARI Dilüsyon analiz metodu
Belirleme sıklığı analiz metodu Zaman-Yoğunluk metodu Koklama sonrası yoğunluk belirleme

25 MEYVE SULARINDA HPLC İLE
PATULİN ANALİZİ ESRA KARAKİRAZ GIDA MÜH.(NÖ)

26 Patulin elma çürüme küfü olan Penicillum expansum da dahil farklı Penicillum ve Aspergillus türleri tarfından sekonder bir metabolit olarak üretilen bir mikotoksindir. Patulin bitki ve hayvan hücreleri ve dokuları için yüksek toksik etkiye sahip olduğu söylenmektedir (Stott ve Bullerman 1975, Engel ve Teuber 1984). Deri altına şırınga edilmiş patulinli deney farelerinde injeksiyon yerlerinde tümörler üremiştir (Dıckens ve Jones 1961).

27 Kimyasal Analiz Ekstraksiyon, temizleme ve HPLC analizi MacDonald ve ark.(2000)’a göre yürütüldü. Kısaca örnekler etil asetatla ekstrakte edildi, sodyum karbonat ile saflaştırıldı ve mobil faz olarak destile su kullanıldı. Hazırlanan örnekler 272 nm UV dedektörde C18 kolonlu bir HPLC ile analiz edildi.

28 MEYVE VE SEBZELERDE PESTİSİT ANALİZLERİ TALİMATI

29 İŞLEM Örnek Hazırlama:  Meyve ve Sebzelerde Pestisit Tayini (Luke Method):
2 kg örnek içinden 50 g’ı tartılır. 200 ml aseton ekleyip homojenize edilir ve süzülür. Süzüntü ölçülür ve 80 ml’si alınır. Sodyum sülfattan süzerek ayırma hunisine aktarılır. Üzerine 100 ml petrol eteri ml diklormetan, bir miktar NaCl konularak iyice çalkalanır. Üstteki faz alınır diğer bir ayırma hunisine aktarılır, alttaki faz 2 kere daha diklormetenla çalkalanıp, diğer ayırma hunisine aktarılır. Toplanan ekstrakt bir balona konularak 450 C ’yi geçmeyecek şekilde evaporatörde uçurulur.        Florosil kolonda clean-up yapılır ve Mass dedektörle hem organik klorlu hem de organik fosforlu pestisitler saptanır. ECD ile organik klorlular sentetik pyrethroitler, NPD ile de organik fosforlu pestisitler saptanılır.

30  HESAPLAMA : Kalibrasyon kurvesi kullanılarak analiz edilen numunede bulunan kalıntı konsantrasyonu hesaplanır. Hesaplama sırasında geri alma yüzdesi dikkate alınmalıdır. Analiz Miktarı (ppm) = (A2 / A1) x (c1 / C2) x 100 x SF A2 : Numunenin pik alanı A1 : Standardın pik alanı c1 : Standardın konsantrasyonu (ppm)                         C2 : Tartılan örnek miktarı (g) SF : Seyreltme Faktörü REFERANS : Pesticide Analytical Manual Volume 1,

31 HPLC YÖNTEMİ İLE AFLATOKSİN ANALİZİ
Aflatoksin , Aspergillus flavus ve Aspergillus parasiticus tarafından üretilen zehirli ve kanserojen maddelerdir.

32 İNCİRDE AFLATOKSİN PRENSİBİ
Numunedeki Aflatoksinin Metanol ile muamele edilerek organik faza alınması Süzülüp bunun sulandırılması, belli miktarda alınan süzüntünün immunoaffinite kolonunda geçirilerek Aflatoksinlerin antijen antikor ilişkisiyle kolonda tutulmaları Derişik Metanol ile kolonun muamele edilerek serbest hale geçirilip Metanol çözeltisine alınması Buradan HPLC cihazına verilerek, kobraselde bromlu türevlerine dönüştürülmesi Hazırlanan kalibrasyon eğrisi yardımıyla miktarının tespit edilmesi ilkesine dayanır.

33 Enjeksiyon Safhası UYGULAMA
UYGULAMA Hazırlanan numuneden 25 g tartılarak 5 g tuz ilave edilir. Hazırlanan Metanol + su karışımından 125 ml ilave edilir. İki dakika yüksek devirde blender edilir. İçinde alt kısmında kantitatif süzgeç üstünde de adi süzgeç kâğıdı bulunan huni yardımıyla 100 ml lik mezüre filtre edilir. Süzüntüden 5 ml alınarak içinde 10 ml Bidistile saf su bulunan enjektöre aktarılır. İmmunoaffinite kolonundan 1 damla/sn şeklinde geçirilir. Kolondan bir defa 2 damla/sn şeklinde 20 ml Bidistile saf su geçirilerek kolon yıkanır. Kolon iyice kurulanır. İmmunoaffinite kolonu 2.5 ml lik balon jojeye yerleştirilir. 1 ml HPLC Gradient Grade Metanol ilave edilerek 1 damla/sn şeklinde geçmesi sağlanır. Bidistile saf su ile 2.5 ml ye tamamlanarak tüp karıştırıcısında iyice karıştırılır. Pastör pipeti yardımıyla 1.5 ml lik viale alınır. Enjeksiyon Safhası İçinde 1 ml Metanol bulunan balon joje bidistile saf su ile 2.5 ml ye tamamlanarak 1.5 ml lik viale alınır. Vial HPLC auto samplerine yerleştirilerek 100 µl enjekte ettirilir.

34 ALKOLSÜZ İÇECEKLERDE ETANOL ANALİZİ
HADİYE ASLAN

35 ALKOLSÜZ İÇECEKLERDE NEDEN ETİL ALKOL KULLANILIR?
Örneğin; bütün gazozlarda tat veya koku verici esanslar kullanılır. Bu esanslar, yağ cinsinden maddeler olup suda çözünmezler. Bunları suda çözünür hale getirmek için hem su ile hem de yağlarla tam karışabilen (çözünebilen) ara çözücülere ihtiyaç olur. Bu hususta en bol, en ucuz ve en yaygın olarak kullanılan ara çözücü de etil alkoldür.

36 TGK ALKOLSÜZ İÇECEKLER TEBLİĞİNDE ETİL ALKOL ORANI
Eski: 5/k “Alkolsüz içeceklerde etil alkol miktarı en çok 5.0 g/l, olmalıdır” şeklindedir. Yeni: 5/b “Bu Tebliğ kapsamında yer alan içeceklerde üretimin doğasından kaynaklanabilecek etil alkol miktarı en çok 3,0 g/L olmalıdır” Eski ile yeni arasında iki temel fark vardır. Birinci fark 5.0 g/l, 3.0 g/l’ye düşülerek AB mevzuatı ile uyum sağlamıştır. İkinci fark ise etil alkolün varlığı üretimin doğası koşuluna bağlanmıştır.

37 Meyve sularında Fumarik Asit ve Laktik Asit Tayini

38 Laktik Asit Kimyaca adı alfa hidroksipropanoyik asittir.
Kimyasal formülü CH3CHOH-COOH Laktik asidin temel kaynağı, glikojen olarak adlandırılan, karbonhidratın yıkımı sonucu oluşan bir yan üründür.

39 ANALİTİK KOŞULLAR: KH2PO4: Potasyum dihidrojen fosfat

40 Damıtık ve fermente alkollü içkilerde gc cihazı ile metanol tayini

41 ALKOL NEDİR? Karbon atomuna doğrudan doğruya -OH grubunun bağlı olduğu organik bileşiklere verilen genel addır. CH3-OH metanol (metil alkol) C2H5-OH etanol (etil alkol) C3 H7-OH propanol (propil alkol) C4 H9-OH bütanol (butil alkol) METİL ALKOL (metanol, karbinol): CH3-OH (Kn:64,7ºC) ( 30 ml'nin üstünde ölüm meydana geldiği rapor edilmiş. Ama genel olarak mL.si öldürücüdür.)

42 METANOL ZEHİRLENMESİ Metil alkolün kendisi zehirli değildir.
Vücutta asıl zehirli olan atılamayan ürün Metil Alkol değil vücutta Metil Alkolün metabolize olması sonucu meydana gelen formaldehit ile formaldehitinde çok kısa sürede metabolize olması ile meydana gelen formik asittir. Formik asit önce göz sinirlerine etki ederek körlüğe neden olur sonra metabolik asidoz sonucunda ölüme neden olur. Oysa Etil alkolden oluşan Asetaldehid vücuttaki Aldehit dehidrogenaz enzimi tarafından asetik asite metabolize olur. Ancak asetik asit zehirli değildir. Asetik asitte karbondioksit ve suya kadar metabolize edilip atılır.

43 konu:kağıt kromatografisi ile mürekkebi bileşenlerine ayırma

44 Kağıt Kromatografisi Kağıt kromatografisi, özellikle ayırmak küçük miktarlardaki maddeleri ayırmak için kullanılan, partisyon kromatografisinin bir çeşididir. Selüloz filtre kağıdı, durağan faz olarak adsorplanmış su içerir. İkinci çözücünün kapiler etkisiyle filtre kağıdı boyunca ilerler. Böylelikle, bileşikler farklı hızlarda kağıt boyunca ikinci çözücü tarafından taşınırlar.

45 1.Prensibi Üzerine mürekkep damlatılmış süzgeç kâğıdı, içerisinde su bulunan bir behere konulduğunda kâğıt dipten su alarak mürekkebi bileşenlerine ayırır.

46 Gc ile yağ asitleri ve sterolleri kompozisyonu tayini

47 Yağ asitleri Yağ Asitlerinin genel yapısı karbon ve hidrojen atomlarından oluşan, değişik boyda alkil zincirleri ve yağ asitlerinin asit fonksiyonunu tayin eden bir karboksil grubu (-CO-OH) ile karakterize edilir. Doğal olarak oluşan birçok yağ asidi vardır. Yağ asitleri, zincirlerinin uzunluğuna göre ayrılma yanında, karbon grupları arasında basit (-CH2-CH2-CH2-CH2-) ya da çift bağlar (-CH2-CH=CH-CH2-) içerip içermediğine bakarak, doymuş ya da doymamış olarakta ayrılır.

48 Sterol kompozisyonu ve alıkonma zamanları tablosu

49 BALDA HMF ANALİZİ

50 BALDA HMF OLUŞUMU Balda HMF oluşumu PH, sıcaklık, ısıtma süresi ve şeker konsantrasyonuna bağlı olduğundan balın kalitesini belirlemede kullanılan en önemli kriterlerdendir HMF taze ballarda az miktarda bulunur. Balın uzun süre depolanması ve yüksek sıcaklıkta ısıtılması sonucu bu oran miligram/kilogram a yükselirken bazen bu sınırları da aşabilmektedir. Bu oranın l50 miligram/kilogram dan büyük olması bala invert şeker katıldığının bir belirtisidir HMF nin balda ki sınırı en çok 40 miligram/kilogram dır

51 HPLC VE SPEKTROFOTOMETRENİN AVANTAJ VE DEZAVANTAJLARI
HPLC daha doğru sonuç verir. HPLC maliyeti yüksektir. HPLC de kimyasal çözeltiler fazla miktarda kullanılır. HPLC de atık kimyasal çözeltinin imha edilmesi için maliyet gerekli . Spektrofotometri yönteminin hassas sonuç vermez. Spektrofotometri yönteminde fazla miktarda kimyasal çözelti kullanılmaz. Spektrofotometri de fazla miktarda atık çözelti oluşmaz.

52 ANTİOKSİDAN MADDE NEDİR?
Antioksidan: İnsan sağlığı için bilimsel olarak ispat edilmiş öneme sahip ve vücut içerisindeki miktarlarının sürekli yenilenmesi gereken moleküllerdir. Antioksidanlar, serbest radikallerin ortaya çıkmasını, hücredeki oksidasyonu durdurur ve sağlık problemlerinin oluşmasını engellerler.(kanser vb.)

53 PRENSİP Örnekteki antioksidanlar hekzan ile çözülerek, asetonitril ile ekstrakte edilir ve konsantre edilmiş olan çözelti, eşit hacimdeki isopropanol ile seyreltilerek HPLC cihazına verilir.

54 HESAPLAMA Kalibrasyon eğrisi kullanılarak analiz edilen numunede antioksidan madde konsantrasyonu ; Antioksidan (mg/kg) = (Ro / Rs) x (Cs/Co) x D Cs: Analize alınan antioksidan standardının konsantrasyonu (mg/kg)  Co: Analize alınan örneğin konsantrasyonu (mg/kg)(10 ml örnek ekstraktında bulan miktar)  Ro: Analize alınan örneğin pik yüksekliği veya alanı Rs: Analize alınan antioksidan standardının pik yüksekliği veya alanı D: Seyreltme faktörü.

55 HPLC YÖNTEMİ İLE HUBUBAT VE HUBUBAT ÜRÜNLERİNDE OKRATOKSİN-A ANALİZİ

56 . Ülkemizde 29 Aralık 2011 tarihinde yayımlanan no’lu Resmi Gazete’nin Türk Gıda Kodeksi Bulaşanlar Yönetmeliği Ek -1 Bölüm 2’de Okratoksin A için belirtilen ‘müsaade edilen en yüksek değerler’ tahıllarda Tablo 2’deki gibidir.

57 HPLC’nin çalışma şartları;
Kolon: µ Bondapak C18 (3.9x300mm, 125 A°, 10 µm) HPLC kolon (Waters, Chromatograph Division 1 Milipore Corporation) (Supelco). Dedektör: Floresans dedektör (Em: 465 nm, Ex: 340 nm) (Waters 470 Scanning Fluorescence Detector) (Supelco) Mobil faz: Metanol/0.01M o-fosforik asit (58:42 v/v) karışımı Mobil faz akış hızı: 1 ml/dk Enjekte edilen örnek miktarı: 5 µl

58 BALDA NİŞASTA ANALİZİ

59 5.4. METOT PERFORMANSI (VALİDASYON):
5.4.1.İlgili Bileşiklerin En Düşük Tespit Edilebilir ve En Düşük Hesaplanabilir Limiti: LOD ve LOQ signal-to-noise oranına göre hesaplanır. LOD : Signal-to-noise oranı olarak, bilinen aktif konsantrasyonun test sonucunun, blank numune test sonucu ile karşılaştırılarak minimum konsantrasyonun tespit edilmesiyle hesaplanır. Genellikle 3:1 kabul edilebilir orandır. LQD : Signal-to-noise oranı olarak, bilinen aktif konsantrasyonun test sonucunun, blank numune test sonucu ile karşılaştırılarak minimum konsantrasyonun hesaplanmasıyla tespit edilir. Genellikle Signal-to-noise oranı 10:1’dir. En az 5 farklı derişimde numune enjeksiyonu gözlenmesi gerekmektedir. LOD ve LQD hesaplanması amacıyla 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2 ppb’ lik standartlardan 5’er kez enjeksiyon yapılacak(5X5=25) ve en az beş farklı konsantrasyonda gözlemlenerek sonuç 0.1 ppb olarak tespit edilmiştir. Linearity(Doğrusallık) : Belirlenen derişimler arasında (genellikle numune derişim inin % 60-% 140) 5 ayrı standart hazırlanarak her standart 2 defa enjeksiyon yapılarak dedektör yanıtına göre derişim/alan grafiği çizilir. Bu derişim aralığının lineer olduğu ve çalışma derişiminin lineer aralığın içinde bulunduğu gösterilir. 1, 2, 3, 5, 10 ppb’ lik sandarttan 5’ er kez enjeksiyon yapılacak (5X5=25) Belirlenen derişimler arasında kalibrasyon grafiği çizilerek bu derişimlerin linear olduğu ve çalışma derişim inin linear aralığın içinde olduğu gösterilecek. Aynı zamanda minimum ve maksimum linear aralık belirlenecek. Specivity (Seçicilik) : Placebo (naphtaline içermeyen) numunesi metotta belirtildiği gibi hazırlanarak numune gibi analiz yapılır. Naphtaline piki alıkonma zamanında placebo’ dan gelen herhangi bir pik olmadığı rapor edilir. Precision (Kesinlik) : Numunelerden 6 tartım alınarak ayrı ayrı numuneler hazırlanır ve analiz edilir. Bu işlem farklı günlerde, farklı cihaz ve kolon kullanılarak iki analist tarafından yapılır.

60 Repeatability (Tekrarlanabilirlik) : Aynı numuneden en az 10 tane olmak üzere toplam 10 adet örnekten 2’ şer paralel hazırlanarak, aynı kişi tarafından 2’şer kez cihaza enjeksiyon yapılacak.(10 X2=20 adet örnek, 20X2=40 enjeksiyon) Standart sapma hesaplanacak. Reproducibility (Tekrar Üretebilirlik): Aynı örnekler farklı kolonda veya farklı kişiler tarafından analiz edilecek. Accurity (Doğruluk) : Numune hazırlığında belirtildiği gibi aktif madde içeriği teorik naftalin miktarının % 80, % 100, % 120’ si olacak şekilde placebo’ ya ilave edilerek numuneler hazırlanır: Recovery yapılarak geri alım oranları %80 - %120 arasında olacak şekilde 1, 3, 5, 10, 20 ppb’ lik standarttan örneğe ilave edilerek % verim bulunacak. Bu işlem 5 adet balda ayrı ayrı yapılacak ve 5’ er kez tekrarlanarak 2’şer enjeksiyon yapılacak. Her farklı standart konsantrasyondan recovery madde 13’ deki gibi %’si hesaplanacak. 6.HESAPLAMA : Nafatalin standardında ve analiz edilen numunede bulunan naftalin konsantrasyonu hesaplanır. Hesaplama sırasında geri alma yüzdesi dikkate alınmalıdır. Analiz Miktarı (ppm) = (A2 / A1) x (c1 / C2) x 100 x SF A2 : Numunenin pik alanı A1 : Standardın pik alanı c1 : Standardın konsantrasyonu (ppb) C2 : Tartılan örnek miktarı (g) SF : Seyreltme Faktörü 7.REFERANS : In House Method

61 İÇEÇEKLERDE HPLC İLE KAFEİN ANALİZİ

62 İçeçeklerde kafein miktarı TGK’YA göre ne kadar olmalı?
Alkolsüz içecekler, tiplerine özgü tat, koku, renk ve görünüşte olacaklar,yabancı tat ve koku içermeyecektir. Alkolsüz içeceklerdeki kafein miktarı en fazla 150 mg/L olacaktır. Aynı tebliğde enerji içecekleri için de kafein sınırı 150 mg/L olarak belirtilmiştir.

63 Kafein tayinde hangi metotlar kullanılır?
Kafein miktar tayini için geleneksel olarak en çok kullanılan yöntemler, Yüksek Performans Likit Kromatografisi (HPLC) ve UV spektrofotometrik tayin metodlarıdır. Ayrıca, kapiler elektroforez ve gaz kromatografisi (GC) gibi metodlar, Kütle spektroskopisi (MS) ve fourier dönüşüm infrared spektrometresi (FTIR) gibi tayin metodları ile birleştirilerek kullanılır.

64 HPLC YÖNTEMİ İLE GIDALARDA ASKORBİK ASİT TAYİNİ

65 ANALİZ Örneklerin analize hazırlanması:
Meyve suyu örnekleri, askorbik asitin stabilizasyonunu sağlamak için %3’lük metafosforik asitle belli oranda karıştırıldıktan sonra0.45 mikronluk membran filtreden geçirilerek HPLC cihazına enjekte edilir. Kromatografi koşulları: Kolon: Nucleosil 100-C18 (250x4.6 mm, ID)(HICHROM, Theale, Reading) Mobil faz: 0.2 M KH2PO4 (pH’sı H3PO4 ile 2.4’e ayarlanmıştır) Akış hızı: 0.5mL/dak Dedektör: 254nm PDA Enjeksiyon hacmi: 20 μL Basınç: kgf

66 Dedektör FOTODİYOT ARRAY DEDEKTÖRÜ (Photodiode array dedector-DAD):
UV/VIS dedektörden farkı, 512 elementten oluşan bir yüzeyde, her elementin ayrı bir dalga boyundaki absorbansı eş zamanlı olarak ölçebilmesidir. Bu sayede 3 boyutlu kromatogramlar almak ve istenilen her pikin çok hızlı spektrum taramasını görebilmek olasıdır. Ayrıca istenilen dalga boyu aralığında çalışılabilmesi bu dedektörün sağladığı bir diğer önemli avantajdır. Kullanılan ışık kaynağı döteryum veya tungsten lambadır.

67 AKRİLAMİD Akrilamid günlük yaşamımızda kullandığımız birçok ürünün içinde farklı şekilde yer alan çok yönlü organik bir bileşiktir. Akrilamid, monomer ve polimer olan poliakrilamid olmak üzere iki şekilde bulunur.

68 Tek formda olan akrilamid, sinir sistemi için toksiktir ve insanlar için kanserojen olduğu düşülmektedir. Çoklu formda olan akrilamidin toksik etkisi bilinmemektedir.  Erime noktasında ve UV ışınlarına maruz kaldığında kolaylıkla polimerize olur. Katı akrilamid oda sıcaklığında stabildir. Fakat eridiğinde veya oksidasyon ajanlarına maruz kaldığında polimerize olur. 

69 Eşanlamlıları 2-Propenamid; etilen karboksiamid; akrilik amid; vinil amid Moleküler ağırlığı 71.09 Kimyasal formülü CH2CHCONH2 Kaynama noktası 125°C Erime noktası 87.5°C (183°F)

70 SEBZELERDE NİTRİT ve NİTRAT ANALİZİ
Sevban Aydurmuş

71 Bu çalışmada, bir basit, hızlı, hassas ve duyarlı, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) yöntemi, bir UV detektör kullanılarak sebze nitrat ve nitrit miktarlarının belirlenmesi için geliştirilmiştir. Optimal koşullar bulundu ve kullanılarak uygulanan 0.8 mL / dk akış hızında mobil faz pH 7,0 sulu% 30, 0.01 M metanol. Tek numune analizi için toplam süre 10 dakikadır. Nitrat ve nitrit geri kazanımları 105,7% kadar% 96.6 arasında bulunmuştur. HPLC yöntemi aynı zamanda sebze nitrat ve nitrit düzeylerinin belirlenmesi için de geçerlidir. Uygulama için, 12 pazarlanan sebze nitrat ve nitrit miktarları bu HPLC metodu ile belirlenmiştir. Sonuçlar sırasıyla 225 ~ 4410 mg / kg aralığında ve <5 ~ 200 mg / kg, değişen nitrat ve nitrit içeriğini göstermiştir.

72 NUMUNE HAZIRLAMA 12 taza meyve alındı. Örnek 100 mL'lik volumetrik bir şişede 1g tartılır . Şişe daha sonra 20 dakika boyunca kaynar su banyosuna taşındı. 80˚C , yukarı sarsılmış ve soğuyana kadar masaya yatırdı , ve daha sonra 100 mL'lik nihai bir hacme kadar seyreltik su ile deiyonize edildi . (Bu içinden süzme ile izlenmiştir 0.45 mikron şırınga filtresi) . 3 mL ilk filtre ürünü olan numuneden 1 mL aşağıdaki süzüntü toplandı Nitrat ve nitrit saptanması için kullanılmıştır

73 ASPARTAM Besin değeri olmayan, enerji içermeyen tatlandıcılardır.
Çay şekerine göre 200 kat daha tatlı bir madde. Tüm dünyada yılda 9 bin ton üretiliyor. 2004'te 146 milyon ton olan dünya şeker tüketiminin bir kısmını karşılayan tatlandırıcılar aslında gıda sektöründe önemli bir açığı kapatıyor. Tatlandırıcıların ana maddesini oluşturan aspartamın zehir olduğu iddiası da dilden dile dolaşıyor.

74 Kimyasal ad N-(L-α-Aspartyl)-L-fenilalanine, 1-metil ester Kimyasal formülü C14H18N2O5 Moleküler ağırlığı g/mol Erime Noktası °C

75 ASPARTAM ANALİZLERİ Aspartam gıdalarda sıvı kromatografisi (HPLC),
IR Spekroskobisi , Kapiler Elektroforez ile analiz edilmektedir.

76 GC ANALİZ AMAÇLI TÜREVLENDİRME YÖNTEMLERİ
HAZIRLAYAN: YASEMİN KILIÇ

77 TÜREVLENDİRME Uçucu olmayan maddelerin (numunelerin) gaz fazına geçebilen esterleri hazırlanarak bu bileşenler, önce uçucu, sıcaklığa dayanıklı ve dedektörde tespit edilebilir hale getirilmelidir. Örneğin çeşitli gıdalarda yağ asitleri analizi yapabilmek için türevlendirme, sabunlaşma ve metilleşme gibi bazı ön işlemler yapılması gerekir.

78 En çok kullanılan türevlendirme teknikleri:
Hidrür oluşturma tekniği: Yalnızca arsenik (As), antimon (Sb), bizmut (Bi), kalay (Sn), kurşun (Pb), selenyum (Se), tellür (Te) ve germanyum (Ge) gibi hidrür oluşturan elementlere uygulanır. Alkilleme: Genellikle, di ve trialkilkurşun, mono-, di- ve trialkilkalay gibi iyonik organometalik türlere uygulanır. Bütün bu türevlendirme teknikleri, orjinal metal-karbon bağlarının bütünlüğünü değiştirmeksizin, yalnızca bileşiklerin uçuculuğunu değiştirir.