Lactobacillus acidophilus DSM 20079 tarafından üretilen acidocin D20079 bakteriyosininin saflaştırılması ve karakterizasyonu Makale Sunumu.

... konulu sunumlar: "Lactobacillus acidophilus DSM 20079 tarafından üretilen acidocin D20079 bakteriyosininin saflaştırılması ve karakterizasyonu Makale Sunumu."— Sunum transkripti:

1 Lactobacillus acidophilus DSM tarafından üretilen acidocin D20079 bakteriyosininin saflaştırılması ve karakterizasyonu Makale Sunumu

2 Giriş Gıda işleme sektöründe biyoteknoloji; mikroorganizmaların ve ürünlerinin geliştirilmesi ve seçiminin yanı sıra biyoişlenmiş ürünlerin kalitesi, süreç kontrolü ve güvenliğini de geliştirmeyi amaçlamaktadır. Geçtiğimiz on yılda, gıda katkı maddelerinin kullanımını azaltmak için genel bir tüketici talebi geliştirmiştir.

3 Giriş Böylece birçok çalışmada, istenmeyen mikroorganizmaların inhibisyonu için gıda fermentatif bakteriler tarafından salgılanan doğal antimikrobiyal maddelere odaklanılmıştır. Kısmen benzer etkileri sağlayan terapötik antibiyotiklerin yan etkilerinden dolayı yasaklanmasının ardından bu doğal, koruyucu antimikrobiyal etkiye sahip katkı maddelerinin kullanımı artmış ve gıda güvenliği ve korunmasında önemli bir marka haline gelmiştir.

4 Giriş Bakteriyosinler, doğal ticari gıda koruyucuların bünyesinde geniş bir alt grubu oluşturmaktadır. Bakteri tarafından üretilen ve antibiyotik özellik içeren bu maddeler, insanlar tarafından normal terapötik antibiyotik olarak algılanıp yanlış kullanım sonucu alerjik reaksiyonlara yol açmaması için bakteriyosin olarak adlandırılmıştır.

5 Giriş Bakteriyosinler, terapötik antibiyotiklerden farklı protein maddeler olup proteazlar tarafından midede hızlıca sindirilebildiğinden şöyle anılmaktadırlar: " Bir veya birbiriyle yakından ilgili birkaç suş üzerinde bakteriyosidal aktiviteye sahip, hücre dışına salınan bakteriyel ribozomal sentezin primer veya modifiye ürünleridir."

6 Giriş Doğal gıda katkı maddelerinin önemli bir kolu olan antimikrobiyal peptitlere karşı artan ilgi, geleneksel gıda uygulamalarında insanlar tarafından kullanılmış olan bakterilerden birçok yeni peptitlerin izolasyonu ve karakterizasyonunu içeren çalışmaların artmasına neden olmuştur.

7 Giriş Laktik asit bakterileri (LAB) ve metabolitleri, yüksek miktarlarda herhangi bir yan etki görülmeden kültür gıdalarında kullanılmış ve sayısız insan tarafından tüketilmiştir. Bu sebeple LAB bakteriyosinleri gıda alanında kullanılan bakteriyosinlerin lokomotifi niteliğindedir. Gıda fermentasyonu ve korunmasındaki artan bu ilgi nedeniyle yeni çalışmalarda özellikle doğal mikroflora ve başlangıç kültürlerin bileşeni olarak kullanılmaktadır.

8 Giriş Birincil yapısı, moleküler kütlesi, ısı stabilitesi ve moleküler organizasyonuna göre, LAB tarafından üretilen bakteriyosinler dört sınıfa ayrılır; Lantibiyotik-grubu olarak adlandırılan birinci sınıf, dehidre rezidüler (dehidroalanin, dehidrobütilin) içeren küçük peptitler içerirler (lantionin, beta- metil lantionin). İkinci sınıfta, ısıya dayanıklı lantionin ihtiva etmeyen küçük peptidler bulunur. Üçüncü sınıfı geniş ısı değişkenliğine sahip bakteriyosinler oluşturur. Dördüncü sınıfı ise bir veya daha fazla kimyasal bileşikle birleşmiş protein parçacıklarından oluşan kompleks bakteriyosinler oluşturur.

9 Giriş Lactobacillus acidophilusis bakteriyosin üreten LAB bakterilerinden biridir. Bu, patojenik olmayan bir Gram-pozitif bakteridir ve normal bağırsak mikroflorasının bir üyesidir. Bu, yaygın olarak fermente süt ürünlerinin üretimi için kullanılır. Probiyotik alanındaki son çalışmalar Lactobacillus acidophilusis‘in fonksiyonel ve destek gıda uygulamalarında probiyotik bir madde olarak dünya pazarında kullanımını sağlamıştır.

10 Giriş LAB' nin L. acidophilus grubu tarafından üretilen bakteriyosinlerin çoğunluğu ısıya dayanıklı, düşük molekül ağırlığına sahip, ikinci sınıfa ait lantibiyotik içermeyen peptidlerdir. Bu mevcut çalışmada elde edilen değerler neticesinde L. acidophilus DSM suşuna ait yeni bir bakteriyosinin izolasyonu, pürifikasyonu ve kısmi karakterizasyonuna dayalı çalışmalar yapılmış ve bakteriyosinin adının acidocin DSM olması için öneride bulunulmuştur.

11 Materyal ve Metotlar

12 Materyal ve Metotlar Tabloya ek olarak;
Lactobacillus acidophilus DSM 20079 L. delbrueckii subsp. lactis DSM 20076 L. delbrueckii subsp. bulgaricus DSM 20080 Leuconostoc paramesenteroides DSM 20288 L. sakei NCDO 2714 Enterococcus faecium T136 E. faecium B13 Pediococcus acidilactici 347 Listeria ivanovii Li4 (pVS2)

13 pH kontrolü olmadan bakteriyosin üretimi
Üretici suş, yalnızca MRS besiyerinde PEG 3350 nin farklı konsantrasyonları (5–20%, w/v) kullanılarak 37◦C de pH kontrolü olmadan 14 saat çoğaltıldı.

14 pH kontrollü bakteriyosin üretimi
2 defa çoğaltılmış üretici suş, 2,5 litre broth medyumla biyoreaktörde inoküle edildi (%1 inokülüm). Kültivasyon sıcaklığı 37◦C ye sabitlendi ve 150 rpm de çalkalandı. pH, otomatik pH kontrol cihazı ile amonyum hidroksit çözeltisi kullanılarak titrasyon yapılıp 6’ya sabitlenmiştir. 10 ml'lik numuneler aktivite deneyleri için çıkarıldı.

15 pH kontrollü bakteriyosin üretimi
12 saat sonra, kültür pH'ı hidroklorik asit ile 5' e ayarlandı ve bu noktada hücreler santrifüjleme ile çıkarıldı (4000 x g 10 dakika süre ile) ve bakteriyosin analizi ve saflaştırılması başlayana kadar süpernatant -20◦C'de saklandı.

16 Bakteriyosin aktivite deneyi
Kültür süpernatantındaki Lactobacillus delbrueckii alttür lactis DSM20076 suşu indikatör suş olarak bakteriyosin aktivitesi için MRS agarda tahlil edildi. Her bir indikatör tüpte 5ml MRS soft agarda (0.75%) ml 10 kat dilue edilmiş overnight kültür bulunmaktadır.

17 Bakteriyosin aktivite deneyi
Bakteriyosin örnekleri 0,45 µm por genişliği olan selüloz asetat filtreden geçirilerek sterilize edildi. indikatör suşun büyümesi için kullanılan medyum içerisinde iki kat seri dilüsyon gerçekleştirilmiştir.

18 Bakteriyosin aktivite deneyi
Temiz bir inhibisyon bölgesi gösteren örneklerin aktivitesi, karşılıklı en yüksek seyreltme değerleri alınarak belirlenmiştir. Bakteriyosin çözeltisinin titresi AU/ml (Activity Unit/ml) cinsinde (1000/d)*D ile hesaplanmıştır. Burada D; seyreltme faktörü, d ise; bakteriyosin çözelti miktarıdır.

19 Bakteriyosinin sıcaklık, pH ve proteolitik enzimlere karşı duyarlılığı
L.acidophilus DSM suşundan salınan ve santrifüj sonrası süpernatantta elde edilen bakteriyosinler farklı ısı,proteolitik enzim ve ph değerlerinde analiz edilmiştir. Bakteriyosin testi spot test yöntemi uygulanarak gerçekleştirildi. Spot testinden önce 70 ve 100◦C de 15, 30, 45, 60 dk ve 121◦C de 30 dk ısıtıldı.

20 Bakteriyosinin sıcaklık, pH ve proteolitik enzimlere karşı duyarlılığı
Proteazlara duyarlılığı test etmek için, 1 mllik bakteriyosin alikotlarına tripsin, ficin, pepsin, papain ve proteinaz K ile muamele edildi. Lizozim için duyarlılık 6 saat boyunca 37◦C'de 1 mg/ml 'lik bir konsantrasyonda test edildi. Hidrojen peroksit vasıtasıyla inhibitör aktivitesini tam olarak ortadan kaldırmak amacıyla hücre kültür süpernatantına 1 mg/ml katalaz ile muamele edilmiştir.

21 Bakteriyosinin sıcaklık, pH ve proteolitik enzimlere karşı duyarlılığı
İşlem görmemiş kültür ekstraktı ve yalnızca tampondaki proteaz kontrol olarak kullanılmıştır. PH etkisini test etmek için, hücre kültür süpernatantı HCl veya NaOH kullanılarak 3 ile 10 arasında değişen çeşitli pH değerlerine ayarlanmış ve 37◦C de 20 dakika boyunca inkübe edilmiştir. pH optimizasyonu uygulanmış örnekler rezidüel bakteriyosin aktivitesi ölçümünden önce pH 6 ya nötralize edilmiştir. Bu testte 3-10 arası pH değerlerinde MRS broth kontrol olarak kullanılmıştır.

22 Bakteriyosin pürifikasyonunun homojenitesi
Yukarıda tarif edildiği gibi , L. acidophilus DSM büyütüldükten sonra , hücreler santrifüj ile çıkarıldı. Süpernatant fraksiyonundaki mevcut bakteriyosin , amonyum sülfat çökeltmesi (400 g/l) ile konsantre edilmiştir.

23 Bakteriyosin pürifikasyonunun homojenitesi
Karışım 4◦C de geceboyu kaldıktan sonra oluşan çökelti 10,000g de 30 dk santrifüj sonrası pellete dönmüştür. Toplanan çökelti daha sonra 0.05M pH 5.0 sodyum asetat tamponu içinde çözülmüş ve 1kDa’luk ayırma membranı kullanılarak 4◦C de geceboyu diyaliz edilmiştir (Fraksiyon 1).

24 Bakteriyosin pürifikasyonunun homojenitesi
Fraksiyon 1, 1 ml/dk‘ lık bir akış hızında 0.05M pH 5.0 sodyum asetat tamponu ile dengelenmiş bir karboksimetil (CM) sefaroz kolonu üzerine (2 cm x 8.5 cm) uygulanmıştır. Kolon 280 nm'de hiçbir absorbans değeri görülmeyene kadar 0.073M pH 5.0 sodyum asetat tamponu ile yıkandı. Aktivite, kademeli gradyan elüsyon ile elüe edilmiştir (0.073M sodyum asetat tamponu içinde 0-0,6 M NaCI).

25 Bakteriyosin pürifikasyonunun homojenitesi
3 mllik fraksiyonlar toplandı ve antimikrobiyal aktiviteler belirlendi. Aktif fraksiyonlar toplandı ve 20 mM pH 5.8 sodyum fosfat tamponuna karşı diyaliz edildi (Fraksiyon 2). Fraksiyon 2'ye amonyum sülfat eklenerek son konsantrasyon %10 amonyum sülfat içerecek şekilde ayarlandı ve Oktil Sefaroz CL-4B kolondan (1 cm x 6,5 cm) geçirilip 20 mM pH 5.8 sodyum fosfat tamponu içeren %10 luk amonyum sülfatla dengelenmiştir. Dengeleme tamponuyla kolon yıkandıktan sonra; aktivite, 20 mM pH 5.8 sodyum fosfat tamponu içinde % 50 etanol ile yıkandı.

26 SDS-PAGE Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezinde (SDS-PAGE) Schagger ve von Jagow yöntemi kullanıldı. Stacking jel %4 akrilamid ve %0,5 bisakrilamid, seperating jel de %16,5 akrilamid ve %0,5 bisakrilamid içermektedir. Elektroforez stacking jelde 35mA, ayrılmada da 50mA de yürütülmüştür.

27 SDS-PAGE 15µllik bakteriyosin örnek alikotları iki defa konsantre edilmiş 15µllik örnek buffer ile karıştırılıp 15 dk 60◦C de ısıtıldı. Moleküler kütle standartları BioRad’dan alınmıştır. Bir jel gümüş boyama ile boyandığında diğer jelde daha önce bahsettiğimiz antibakteriyel aktivite ölçüldü.

28 İzoelektrik nokta tayini
Bakteriyosin içeren süpernatantın preparatif izoelektrik odaklaması Rotofor preparatif izoelektrik odaklama cihazı (IEF) ile yapılmıştır. Phastsystem, üreticinin talimatlarına göre, bir IEF 3-9 jel kullanılarak yeniden çözünür bakteriyosin kristallerin izoelektrik nokta tayini için kullanılmıştır.

29 Kütle spektrometre analizi
Saflaştırılmış bakteriyosinin moleküler kütlesi dik bir matris destekli lazer çıkarma/iyonlaşma (MALDI) kaynağı ile donatılmış olan QSTAR® hibrid pulsari aleti kullanılarak MALDI-TOF kütle spektrometrisi (MS) ile tespit edilmiştir. Kullanılan nitrojen lazerin yoğunluğu %35 ve iyon ivme gerilimi 20kV tır.

30 Kütle spektrometre analizi
Saflaştırılmış bakteriyosin örneklerinin 5er µllik kristal süspansiyonları dikkatli bir şekilde aynı miktarda Alfa -siyano- hidroksisinamik asit ( CHC) ile karıştırılmıştır. Hazırlanan çözeltinin bir µllik kısmı perspektif 10 x 10 MALDI plaka üzerine tespit edildi ve analiz edilmeden önce 10 dakika boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakıldı.

31 Kütle spektrometre analizi
Sekans analizi için, saflaştırılmış bakteriyosin örneklerinin triptik sindiriminde Jensen ve arkadaşlarının methodu kullanıldı. Elektrosprey iyonizasyon (ESI) için bir nano-kaynak kullanıldı. Kılcal nano-sprey uygulanmadan önce, örnekler bir C18 ZipTip® kullanılarak tuzdan arındırıldı. Sindirilen örnekler %50 asetonitril içeren %0,1 lik 10µl trifluoroasetik asit ile atırıldı.

32 Kütle spektrometre analizi
Nanosprey kaynak 800V gerilim kaynağıyla pozitif iyon moduna ayarlandı. Meydana gelen peptidlerin parçalanması 12 ile 60 arasında değişen eV çarpışma enerjisi kullanılarak argon basıncı altında gerçekleştirildi. Elde edilen amino asit dizisi Mascot arama programı ve NCBI BLAST programı kullanılarak karşılaştırılmıştır.

33 Sonuçlar Bakteriyosin Üretimi:
L. acidophilus DSM suşundan bakteriyosin üretiminde ekim ilk olarak MRS medyum içeren karıştırma flasklarında yapıldı. Bu koşullarda bakteriyosin aktivitesi görülmedi. Büyüme medyumunda PEG’in farklı konsantrasyonlarının varlığı da yine üretimi etkilemedi, ve hücrelerden uzak süpernatant herhangi bir bakteriyosin aktivitesi göstermedi.

34 Bakteriyosin üretimi Bakteriyosin üretimi genellikle pH’dan etkilendiği için üretimi kolaylaştırma adına fermentatif besiyerinde manipülasyon ve pH kontrolü yapılmıştır. Ekimler, oksijenasyonu önlemek için düşük ajitasyon altında pH kontrollü 2.5 lt otomatik karıştırmalı tank reaktör içinde büyütülmüştür.

35 Bakteriyosin üretimi pH 5-6 arasında gerçekleştirilen bakteriyosin üretimi bakteriyosin aktivitesi açısından daha verimli sonuçlar sağlamıştır. Eksponansiyel büyüme fazında aktivite görülmedi fakat eksponansiyel fazdan durgun faza geçerken aktivite görülmektedir (Figür1).

36 Bakteriyosin üretimi

37 Bakteriyosin üretimi Belirgin aktivite 10 saat sonra, en yüksek aktivite titreleri de saat sonra tespit edildi. 23 saat kadar uzun inkübasyon sırasında bakteriyosin titresi çok düşük değerlere ulaştı ve sonraki aşamalarda tespit edilemeyecek kadar düştü. Aynı koşullar altında tekrar eden ekimler aynı aktivite paternlerini gösterdiğinden bakteriyosinin en yüksek titresini elde etmek, karakterizasyonunu ve saflaştırmasını sağlamak için 12 saat sonra ekimler toplandı.

38 İnhibitör aktivitenin spektrumu
Farklı bakteri suşlarına karşı acidocin D20079 inhibisyon aktivitesi spot on lawn methodu ile test edildi. L. acidophilus DSM tarafından üretilen bakteriyosin inhibitör spektrumu oldukça dar ve hassas, ayrıca Lactobacillus cinsi ile sınırlıdır (Tablo1).

39 İnhibitör aktivitenin spektrumu
Inhibitör aktivite belirgin bir şeklide yalnızca L. delbrueckii subsp. lactis DSM suşuna karşı değil aynı zamanda L. bulgaricus DSM ve L. sakei NCDO 2714 suşlarına da karşıdır. Çalışılan diğer patojenik suşlarda herhangi bir aktivite tespit edilmemiştir. En yüksek duyarlılık göz önüne alındığında bakteriyosin aktivitesinin kantitatif tayininde L. delbrueckii subsp. lactis DSM suşu kullanılmıştır.

40 L. acidophilus DSM 20079 suşunun ürettiği acidocin D20079’un stabilitesi
Organik asitlerin olası etkisini (pH’ın 6.5 a ayarlanması) ortadan kaldırmak için ve hidrojen peroksit varlığında (katalaz muamelesi) bir inhibisyon etkisini ortadan kaldırmak için inhibe edici ajanın aktivitesi belirlenen koşullarda test edilmiştir. Ne pH ayarlaması ne de katalaz muamelesi bakteriyosin aktivitesini etkilememiştir.

41 L. acidophilus DSM 20079 suşunun ürettiği acidocin D20079’un stabilitesi
Acidocin D20079 ‘un ısı muamelesine duyarlılığının oluşturduğu inhibitör aktivite 70°C ve 100°C de 60 dk dan sonra herhangi bir değişiklik göstermemektedir. Ayrıca, aktivite 121°C de 30 dakika sonra % 50 oranında azalmıştır. Bu sonuçlar L. Acidophilus DSM tarafından üretilen antimikrobiyal maddenin güçlü ısıya dayanıklı olduğunu göstermektedir .

42 L. acidophilus DSM 20079 suşunun ürettiği acidocin D20079’un stabilitesi
Kültür süpernatantındaki bakteriyosin aktivitesinin pH stabilitesi 3 ile 10 pH değerleri arasında incelenmiştir. Aktivite genellikle 4 ile 9 pH arası değerlerde değişmezken daha düşük ve daha yüksek değerlerde oldukça düşmektedir. Antimikrobiyal maddenin protein yapısında belirlemek için, bakteriyosin aktivitesi bazı proteolitik enzimlerin (tripsin, proteinaz K, ficin, papain ve pepsin) etkisiyle test edilmiştir.

43 L. acidophilus DSM 20079 suşunun ürettiği acidocin D20079’un stabilitesi
37°C de 6 saat inkübe edilen örneklerde bu enzimlerin her biri tamamen antimikrobiyal aktiviteyi ortadan kaldırmıştır. Lizozim muamelesi diğer çalışmalarda test edilmiş ve bakteriyosin aktivitesi üzerine bir etkisi görülmemiştir. 4°C de 2 ay veya dondurulmuş olarak 6 ay saklamanın aktiviteyi etkilemediği tespit edilmiştir.

44 L. acidophilus DSM 20079 suşu tarafından üretilen bakteriyosinin saflaştırılması
Bakteriyosin tablo 2 deki 3 aşamalı saflaştırma protokolü uygulanarak homojen hale getirildi. İlk olarak amonyum sülfat presipitasyonu uygulandı. Yaklaşık olarak 8 kat konsantre edilmiş ve %94 oranında geri kazanılmış bakteriyosin elde edildi. Saflaştırmanın ikinci aşamasında CM Sefaroz kolon ile farklı NaCl konsantrasyonları ile antimikrobiyal aktivite kontrol edildi.

45 L. acidophilus DSM 20079 suşu tarafından üretilen bakteriyosinin saflaştırılması
Maksimum aktivite 0,4 M NaCl konsantrasyonunda elde edildi ve aşama sonrası verim %65 civarındaydı. Son saflaştırma safhasında ise %50 lik etanol ve hidrofobik Oktil-Sefaroz kolonu kullanılarak kolon presipitasyonu sağlandı. Fakat en büyük kayıp bu aşamada gözlendi (%16 verim).

46 L. acidophilus DSM 20079 suşu tarafından üretilen bakteriyosinin saflaştırılması
Aktif bakteriyosin fraksiyonları yüksek moleküler ağırlığa sahip bir vaziyette iki bant olarak elektroforezde gözlenmiştir. SDS-PAGE de bakteriyosin peptidi tespit edilemedi. Bunun sebebi 0,01 ng/ml konsantrasyondan daha yüksek konsantrasyonların kristalleşmesi veya acidocin D20079 un asidik izoelektrik noktasından dolayıdır.

47 L. acidophilus DSM 20079 suşu tarafından üretilen bakteriyosinin saflaştırılması

48 İzoelektrik nokta (pI), moleküler kütle ve kısmi sekans tespiti
Yeniden çözünen kristallerin analitik olarak izoelektrik odaklanması ile bakteriyosinin izoelektrik noktası yaklaşık olarak 3-3,5 arasında elde edilmiştir. Daha önceki çalışmalarda L. acidophilus N2 suşunun ürettiği lactatin B bakteriyosinin değerleriyle aynı olarak bu çalışmada da IEF analizi bakteriyosin aktivitesinin geniş bir pH aralığına yayıldığını göstermiştir.

49 İzoelektrik nokta (pI), moleküler kütle ve kısmi sekans tespiti
Moleküler kütle tayini için fraksiyonlar preparatif IEF’ten toplanıp tripsin-SDS-PAGE’ e tabi tutuldu. Bakteriyosinin jeldeki pozisyonu aktivite analizi ile teyit edilmiştir(Figür 2A ve 2B) ve moleküler kütle yaklaşık olarak 6kDa olarak belirlenmiştir.

50 İzoelektrik nokta (pI), moleküler kütle ve kısmi sekans tespiti
Jel gümüş boyamaya tabi tutulmuştur. Soldaki ilk 4 kuyu farklı süpernatant grupları içermektedir. 5 ve 6. kuyular sırasıyla triosefosfat izomeraz kDa, miyoglobin kDa, laktalbümin kDa ve aprotinin 6512 kDa standartları içermektedir. Sağ taraftaki kuyular ise IEF analizine tabi tutulmuş kısmen saflaştırılmış fraksiyonları içermektedir. Bakteriyosin bantlarını doğrulamak için jel L. delbreckii subsp. lactis DSM hücreleri ile kaplanmış ve MRS soft agarda inkübe edilmiştir. 37◦C de bir gece inkübasyon sonrası gümüş boyanmış inhibisyon bölgeleri görülmektedir.

51 İzoelektrik nokta (pI), moleküler kütle ve kısmi sekans tespiti
Hem kristalize örnek hem de çözünür haldeki homojenize örnek MALDI-TOF-MS ile analiz edildi ve her ikisi de 6,6 kDa noktasında pik verdi (Figür 3).

52 İzoelektrik nokta (pI), moleküler kütle ve kısmi sekans tespiti

53 İzoelektrik nokta (pI), moleküler kütle ve kısmi sekans tespiti
Triptik sindirilmiş aynı çözünür örneğin Nano-ESI-MS e tabi tutulmasıyla özellikle iki pik göze çarpmaktadır. Bu iki pik sırasıyla 1031,5 kDa ve 5561,1 kDa dur. Bu örneklerin toplam moleküler kütlesi acidocin D20079 un moleküler kütlesi (6,6 kDa) ile benzerlik göstermektedir.

54 İzoelektrik nokta (pI), moleküler kütle ve kısmi sekans tespiti

55 İzoelektrik nokta (pI), moleküler kütle ve kısmi sekans tespiti

56 İzoelektrik nokta (pI), moleküler kütle ve kısmi sekans tespiti
1031,5 kDa luk pik MS/MS fragmentasyona tabi tutuldu ve 9 rezidüden oluşan sekans elde edildi (Leu, Val, Ser, Leu, Val, Asp, X, Val, Arg). Bu dokuz aminoasitlik acidocin D20079 kısmi sekansı kayıtlı sekanslar ile karşılaştırıldı ve belirgin bir benzerlik gözlenmediğinden bu peptidin yeni bir peptid olduğuna karar verildi.

57 Tartışma L. acidophilus bakteri türleri , Johnson ve arkadaşları tarafından altı DNA homoloji gruba ayrılmıştır (1980). L. acidophilus DSM A1 homoloji grubu altında yer almaktadır ve bu grup her bir üyesi farklı patern ve karakteristiğe sahip bakteriyosin üreten bir takım suşu içermektedir.

58 Tartışma Bu, üretilen bakteriyosinin L. acidophilus suşlarının sınıflandırılmasında kullanılamayacağını göstermekte ve ilgili suşların üzerinde yeni peptidler için araştırma yapılmasını teşvik etmektedir. Örneğin; L. acidophilus JCM 1132 suşunun ürettiği L1132 bakteriyosini ısıya dayanıklı iki bileşenli bir yapıya sahiptir ve patojenik olmayan suşlara karşı dar bir inhibisyon aktivitesine sahiptir.

59 Tartışma L. acidophilus ATCC 4356 suşunun ürettiği tek bileşenli 3,1 kDa luk bakteriyosin patojenik suşlara karşı erken logaritmik büyüme fazında oldukça etkilidir. Acidocin DSM a patern olarak benzerlik gösteren L.acidophilus N2 suşunun ürettiği lactacin B, logaritmik fazın geç evresinde ortaya çıkmaktadır. Her iki suş da dar bir inhibisyon spektrumuna sahip ve bacteriyosin üretimi için pH kontrollü bir üretime ihtiyaçları vardır.

60 Tartışma L. acidophilus DSM nin yanısıra L. acidophilus TK9201 suşunun ürettiği acidocin A ve L. acidophilus 88 suşunun ürettiği lactacin F nin de pH kontrolüne ihtiyaç duyması bu cinsin üyelerinin pH kontrolüne ihtiyaç duyduğu izlenimini oluşturmaktadır.

61 Tartışma Eğer 24 saate kadar uzanan uzun kültivasyon süreleri uygulansaydı; önceki çalışmalarda amylovorin L 471, leuconocin S, enterocin 1146'da olduğu gibi lactacin B, acidocin A ve acidocin 20079'da da protein degradasyonu, bakteriyosin adsopsiyonu ve çevresel şartlarda değişikliğe sebep olurdu. Bu da bakteriyosin titresini düşürdüğünden aktivite deneyinde elde edilen sonuçları düşürmüş olurdu.

62 Tartışma L.sakei NCDO 2714 suşu dar spektrumlu inhibisyona sebep olan bakteriyosin üreten suşlar arasında en duyarlı olan olarak tespit edilmiştir. Genellikle vakumlu poşetlerdeki etlerde bulunan bu suş eğer spesifik hidrojen sülfit üretirse bakteriyosinler degrade olup kısa zamanda anaerobik bozulmaya yol açabilir.

63 Tartışma L. acidophilus DSM peptid saflaştırması sırasında , en iyi verim amonyum sülfat presipitasyonunda elde edilmiştir. Burada uyguladığımız 3 aşamalı saflaştırma protokolü diğer lactobacillus temelli saflaştırma metotlarından belirgin bir şekilde daha kısadır. Analiz sırasında MRS besiyerinde bulunan tween 80 deterjanı bakteriyosinin saflaştırılmasında yardımcı rol üstlenmiştir.

64 Tartışma Tween 80 bakteriyosin üretimi, saflaştırılması ve tespitinden önemli bir deterjandır. Fakat gassericin A ve reutericin 6 gibi bazı bakteriyosinlere affinitesi olduğundan bunlarla etkileşime girip degrade eder. DSM da N-terminaldeki aminoasitlerin sekanslanması mümkün olmamıştır.

65 Tartışma Belki de bu acidophilin 801 ve GM005 bakteriyosininde olduğu gibi N-terminalin bloklanmasının bir sonucu olabilir. Bu da modifiye aminoasitlerin bulunma ihtimalini göstermektedir. İkinci sınıftaki bakteriyosinlerin yüksek hidrofobik karakteristiğe sahip olmasından ötürü bakteriyosin saflaştırması sıklıkla uzun ve zahmetli geçmektedir.

66 Tartışma Ayrıca bu çoğunun biraraya gelerek agrege olmasının da bir sebebi olabilir. Aslında agregasyon direkt olarak bu bakteriyosinin saflaştırılması esnasında bir problem teşkil etmemektedir fakat diyaliz esnasında rastgele gerçekleşen kristalizasyon agregasyona sebep olduğundan ve geri dönüştürülemeyen bir süreç olduğundan saflaştırma kısmen de olsa etkilenmiştir.

67 Tartışma Bu neden IEF cihazı ile tam bir izoelektrik nokta değeri alamadığımızın da sebebi olarak düşünülmektedir. Kristalizasyonun bir artısı ise sedimentasyona sebep olarak geniş bir pH aralığına yayılarak aktivite göstermesini sağlamaktır. Lactacin B ye IEF cihazı ile izolektrik odaklama uygulandığında çökelti oluşmasının sebebi de yine kristalizasyon olarak düşünülmektedir.

68 Tartışma DSM da kristallerin yeniden çözülmesinin ardından yapılan IEF analizinde izoelektrik noktanın kristalizasyon öncesine göre daha asidik çıkmasının sebebi ise yüksek oranda aminoasit kompozisyonu içermesine bağlı görünmektedir.

69 Tartışma Bütün bu biyokimyasal özellikler göz önüne alınırsa Lactobacillus acidophilus DSM suşunun ürettiği acidocin D20079‘un sınıf 2 LAB bakteriyosinlerine ait olduğu görünmektedir (<10 kDa, ısıya dayanıklı, proteazlara karşı duyarlı, agrege olmaya eğilimli).

70 Referans Sahar F. Deraz, Eva Nordberg Karlsson, Martin Hedström, Maria M. Andersson, Bo Mattiasson - Purification and characterisation of acidocin D20079, a bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus DSM Journal of Biotechnology 117 (2005) 343–354

71 Teşekkürler