PROTEİNLERİN TANIMLANMASI

... konulu sunumlar: "PROTEİNLERİN TANIMLANMASI"— Sunum transkripti:

1 PROTEİNLERİN TANIMLANMASI
Ar.Gör.Özlem ÖZDEMİR

2 Proteinler Tüm organizmalarda kompleks fonksiyonlar ve metabolik reaksiyonların çoğu proteinlerce gerçekleştirilmektedir. kataliz, yapı, hareket, savunma, regülasyon, transport, depo, strese yanıt … Canlı yaşamını ilgilendiren hemen hemen her konuda proteinlerin önemli olması nedeniyle yapılarının ve biyokimyasal özelliklerinin araştırılması zorunludur.

3 Proteinleri tanımlama deneyleri
Proteinleri denatürasyon ve çökme tepkimeleri ile tanımlanma deneyleri Proteinleri renk tepkimeleri ile tanımlanma deneyleri

4 Proteinleri denatürasyon ve çökme tepkimeleri ile tanımlanma deneyleri
Proteinleri sülfosalisilik asit ile çöktürme Proteinlerdeki serbest bazik grupların, sülfosalisilik asit ile, suda çözünmeyen bileşik oluşturmaları prensibine dayanır. Proteinleri konsantre nitrik asit ile çöktürme (Heller’in halka deneyi) Proteinlerin, nitrik asit ile, asit-metaprotein (asit-albümin) bileşiği oluşturmaları prensibine dayanır. Proteinleri triklorasetik asit (TCA) ile çöktürme Proteinlerin, triklorasetik asit (TCA) anyonları ile bağlanarak suda çözünmeyen tuzlar oluşturmaları prensibine dayanır Proteinleri ısıtma ile çöktürme Proteinlerin, ısı etkisiyle denatüre olmaları prensibine dayanır Proteinleri kaynatma-asetik asitle çöktürme Proteinlerin, ısı etkisiyle denatüre olmaları ve asetik asitin proteinlerin denatürasyonunu artırması prensibine dayanır.

5 Proteinleri renk tepkimeleri ile tanımlanma deneyleri
Proteinleri biüret tepkimesi ile tanımlama Proteinlerin, biüret reaktifi ile mor renkli kompleks oluşturmaları prensibine dayanır Proteinleri ksantoprotein tepkimesi ile tanımlama Proteinlerin yapısını oluşturan fenil alanin, tirozin, triptofan gibi aromatik yan zincirli amino asitleri tanımlamadır. Proteinleri kurşun asetat tepkimesi ile tanımlama Proteinlerin yapısını oluşturan ve sülfhidril (tiyol; −SH) veya disülfid (−S−S−) grubu içeren amino asitleri tanımlamadır. Proteinleri Sakagucchi tepkimesi ile tanımlama Proteinlerin yapısını oluşturan ve guanidino grubu içeren arjinin amino asidi ile ilgilidir.

6 Proteinleri ayırma ve saflaştırma yöntemleri
Proteinleri, çözünürlüklerine göre ayırıp saflaştırma yöntemleri Proteinleri elektrik yüklerine göre ayırma ve saflaştırma yöntemleri Proteinleri molekül büyüklüklerine göre ayırma yöntemleri

7 Proteinleri, çözünürlüklerine göre ayırıp saflaştırma yöntemleri
Proteinler, çözünürlüklerine göre ayırılıp saflaştırılabilirler. Sodyum sülfat veya amonyum sülfat ile çöktürme yöntemleri, proteinlerin ayrılmasında ve saflaştırılmasında kullanılan en eski yöntemlerdir.

8 Proteinleri elektrik yüklerine göre ayırma ve saflaştırma yöntemleri
Elektroforez, proteinleri, izoelektrik noktalarından farklı bir pH değerine sahip elektriksel bir alanda farklı göçme hızlarına dayanarak ayırma yöntemidir. Elektroforez işleminde proteinler, pH’ı belli bir tampon çözelti içinde ve bir taşıyıcı materyal üzerinde genellikle anoda doğru göç ettirilirler. Farklı göçme hızlarına göre taşıyıcı materyal üzerinde ayrılan proteinler, boyanarak görünür hale getirilir ve elde edilen elektroforegram, kantitatif olarak değerlendirilir. Elektroforezde kullanılan taşıyıcı materyal, kağıt, sellüloz asetat tabakası, nişasta jeli, poliakrilamid jeli, agar jeli gibi maddeler olabilir; taşıyıcı materyalin çeşidine göre de farklı elektroforez yöntemleri tanımlanır.

9 Elektroforez

10 İzoelektrik fokusyon yöntemi(IEF)
Proteinleri izoelektrik noktalarının farklılığına göre ayırma yöntemidir. Bu yöntem prensipte iki ayırma tekniğinin (izoelektrik noktalarına göre ayrım ve moleküler ağırlıklarına göre ayrım) kombinasyonudur. Elektriksel alandaki pH gradientinde her protein molekülü, izoelektrik noktasına göre uygun bir yere doğru hareket eder; iki yönde etki eden kuvvetlerin eşit olduğu, pH’ın proteinin izoelektrik noktasına eşit olduğu yerde hareketsiz kalır.

11 İzoelektrik fokusyon (Isoelectric focusing - IEF)

12 Proteinleri molekül büyüklüklerine göre ayırma yöntemleri
Ultrasantrifügasyon Jel filtrasyon kromatografisi Affinite kromatografisi

13 Ultrasantrifügasyon, yer çekimi ivmesinin binlerce katına ulaşan çekim alanlarında büyük moleküllerin sedimente olarak (çökerek) ayrılmalarına dayanan yöntemdir. Jel filtrasyon kromatografisi küçük ve orta büyüklükte protein moleküllerinin, kolondaki jelin partiküllerinin oyuklarına girmeleri, daha sonra kolonu uygun bir çözgen yardımıyla yıkama suretiyle dışarı çıkarılmalarına dayanan ayırma yöntemidir. Affinite kromatografisi, proteinlerin çok küçük molekülleri çok spesifik bir şekilde bağlamaları özelliklerine dayanan ayırma yöntemidir. Bu yöntemde bir substrat molekülü, kimyasal bir reaksiyon vasıtasıyla çoğunlukla agaroz gibi bir polisakkarit olan bir taşıyıcı materyale bağlanır ve bir kolona yerleştirilir. Kolondan bir protein karışımı geçirildiğinde substrat, karışımda bulunan kendine spesifik proteini yakalar ve tutar; diğer proteinler kolondan geçerler. Daha sonra kolondan substrat geçirilmesiyle protein kolondan sökülür ve eluat içinde ayrılır.

14 Jel filtrasyon kromatografisi

15 Çöktürme yöntemleri İyonik Şiddetini Değiştirerek Çöktürme
Salting in tuz konsantrasyonu çözünürlük Salting out tuz konsantrasyonu çözünürlük Salting in Çözünme Salting out presipitasyon

16 İyonik şiddeti düşürerek çöktürme ‘salting in’
Düşük konsantrasyonlarda eklenen tuz, yüklü proteinlerin çözünürlüğünü artırır. Protein üzerindeki yük etkileşimleri korunur.

17 İyonik şiddeti arttırarak çöktürme ‘salting out’
Yüksek konsantrasyonlarda nötral tuz ilavesi ile çözünürlüğün azalması; en sık kullanılan method Salting out ; protein yüzeyindeki hidrofobik bölgeye ve molekül kütlesine bağımlıdır.

18 Çöktürme yöntemleri Organik çözgenler ile çöktürme
Ortamın dielektrik sabitini düşürürler , çözünürlük Hidrofobik ve elektrostatik etkileşim Genelde kullanılan organik çözgenler: Etanol Aseton Metanol Propan-1- ol Propanol-2-ol Dioxan

19 DENEY: Yumurtadan ovoglobulin ve ovalbumin saflaştırılması
Yumurtanın bir ucundan delik açılır ve beyazı mezüre aktarıldıktan sonra karıştırılır. Beyaz kısma 1/10 hacimde 1 N asetik asit ilave edilir, karıştırılır, tülbentten süzülür. Süzüntünün üzerine eşit miktarda doygun amonyum sülfat çözeltisi dökülür, 30 dk bekletilir. Santrifüj edilir. (5000 rpm 10 dakika) Pellet kısmı(ovoglobulin) behere alınır ve %0.9 NaCl çözeltisinde çözülür. Supernatant behere aktarılarak bulanıklık gözlenene kadar doygun amonyum sülfat eklenir. Çözelti 10 dk buzdolabında bekletilir. Santrifüj edilir. (5000 rpm 10 dakika) Çökelti halindeki albumin kristalleri üzerine %0.9 NaCl eklenerek çözülür.

20 Biüret Deneyi 1.tüp su 2.tüp albümin çözeltisi
3.tüp çöktürülen ovalbumin çözeltisi 4.tüp çöktürülen ovoglobulin çözeltisi Oluşan renk değişimlerine göre protein miktarları hakkında yorum yapınız.

21 Biüret tepkimesi ile tanımlama
Proteinlerin, biüret reaktifi ile mor renkli kompleks oluşturmaları prensibine dayanır. Biüret reaktifleri %3 CuSO4 %10 KOH Biüret reaktifindeki Cu2+ iyonları, alkalik ortamda, en az iki peptit bağı içeren maddelerle mor renkli kompleksler oluştururlar. Proteinlerin yapısında en az iki peptit bağı bulunduğundan proteinler, biüret reaktifindeki Cu2+ iyonları ile alkalik ortamda, mor renkli kompleksler oluşturmaktadır. Biüret tepkimesi, biyolojik materyalde proteinlerin kantitatif tayini için de sıklıkla kullanılmaktadır.

22 Biüret tepkimesi ile tanımlama

23 Yumurta beyazında başka hangi proteinler var?
Ovoglobulin ve ovalbuminin fonksiyonları neler? Başka hangi yöntemlerle yumurta beyazındaki proteinler izole edilebilir?