MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARI

Mikrobiyoloji lab da Bakterilerin morfolojik özellikleri incelemek amacıyla fikse edilen ve boyanan preparatlar kullanılır

BAKTERİLERİN BOYANMA AŞAMASI 1-Örneğin lam üzerine yayılması 2-Fiksasyon (tespit etmek) 3-Boyama

FİKSASYON (TESPİT ETMEK) Tespit işlemi ile sıvı içinde süspansiyon şeklindeki bakteri hücrelerinin lama yapışması sağlanır.Üzerlerine uygulanacak sıvılarla lamdan akıp gitmeleri önlenir FİKSASYON 2 şekilde yapılır 1-Fiziksel tespit 2-Kimyasal tespit

FİZİKSEL TESPİT 2 ŞEKİLDE YAPILIR 1-Alevden Geçirme 2- (18-20) saat oda ısısında bekletme

Lam üzerine alınan örneğin kuruması beklendikten sonra, FİZİKSEL TESPİT Lam üzerine alınan örneğin kuruması beklendikten sonra, Lamın kenarından pensetle tutularak alt yüzeyinden 3 kez alevden geçirilir (Sıcaklık ile proteinlerin pıhtılaşarak lama yapışması sağlanır) Veya 18-20 saat oda ısısında bekletilir

Alkol-aseton karışımı KİMYASAL TESPİT Direkt dokudan hazırlanan preparatlarda hücre yapısının bozulmasını önlemek için yapılır Örn. İnfekte doku kesitleri,kan gibi sıcağa duyarlı hücreler içeren örnekler Bu amaçla Alkol-eter karışımı Metil alkol Alkol-aseton karışımı Aseton (fluoresan mik.için hazırlanan pre.da kullanılır) Absolu alkol

ÖZENİN ALEVDE YAKILARAK STERİL EDİLMESİ

STERİL ÖZE YARDIMIYLA ÜREMİŞ KÜLTÜRDEN TEK KOLONİ ALINMASI

MRSA BACTERİA

STERİL ÖZE YARDIMIYLA ÜREMİŞ KÜLTÜRDEN TEK KOLONİ ALINMASI

İNCELENECEK ÖRNEĞİN LAM ÜZERİNE YAYILMASI

İNCELENECEK ÖRNEĞİN LAM ÜZERİNE YAYILMASI

ÖRNEK SÜRÜLMÜŞ OLAN LAMI ALEVDEN GEÇİRMEK SURETİYLE TESPİT ETMEK

BOYALAR, BAKTERİLERİN BOYANMASI Boyama mikrobiyolojik tanıya yardımcı Mikroorganizmalar renksiz oldukları için ışık mik.da görülmeleri boyanmadan zordur Boyanarak incelemenin 2 avantajı vardır 1-Bakteri hücreleri boyanarak daha iyi görünür hale gelirler 2-Farklı bakteri cinsleri için farklı boyanma özellikleri bir kriter oluşturur

Doğal boyalar BİTKİSEL ve HAYVANSAL kaynaklı olabilir. Bunlardan bitkisel kaynaklı olanlara hematoksilen ve orcein hayvansal kaynaklı olanlara ise carmen örnek gösterilebilir. Doğal boyalar daha çok histolojide kullanılmaktadır.

2-SENTETİK BOYALAR Serbest asit ve bazlar suda çok az eridiklerinden sentetik boyalar daima nötr tuzlar halinde kullanılır Bunların sayıları oldukça çoktur asit fuksin, metilen mavisi, bazik fuksin, safranin eosin,toluidin mavisi,safranin,kongo kırmızısı,light green,vansiyan viyole örnek gösterilebilir.

2-SENTETİK BOYALAR Asit boyalar Bazik boyalar Nötr boyalar olmak üzere 3 gruba ayrılır

ASİT BOYALAR(asit fuksin,oranj G,kongo kırmızısı) BAZİK BOYALAR (kristal viyole metilen mavisi,bazik fuksin) NÖTR BOYALAR (Giemsa,Wright)

Bakteri hücreleri nükleik asitten zengin fosfat grupları nedeniyle negatif yüklüdür ve BAZİK boyalarla boyanırlar Asit boyalar zemin boyamak için kullanılır Giemsa parazit incelemede ideal boyadır ve Hematolojide kan preparatlarının boyanmasında kullanılır

1-BASİT BOYAMA 2-DİFERNSİYEL BOYAMA 3-NEGATİF BOYAMA BOYAMA YÖNTEMLERİ 1-BASİT BOYAMA 2-DİFERNSİYEL BOYAMA 3-NEGATİF BOYAMA

Bu yöntem ile bakterilerin boyanmasında tek bir boya kullanılmaktadır. BASİT BOYAMA Bu yöntem ile bakterilerin boyanmasında tek bir boya kullanılmaktadır. Basit boyamada Loeffler’in metilen mavisi, kristal violet, sulu fuksin ve safranin gibi boyalar kullanılabilir Bakteriler boyamada kullanılan boyanın rengini alır. Örneğin kristal violet ile boyanan bakteriler mor renkli görünür.

BASİT BOYAMA AŞAMALARI ŞUNLARDIR 1-Preparat hazırlanır (yayma, kurutma, tesbit) 2- Preparatın üzeri kullanılan boya çözeltisi (metilen mavisi, kristal violet, sulu fuksin)ile kaplanarak 1 dakika bekletilir 3- Boya dökülerek preparat su ile yıkanır 4-Kurutulan preparat mikroskopta immersiyon objektifi ile incelenir.

uygulanması ile gerçekleştirilen bir boyama şeklidir. Örnek Gram boya DİFERNSİYEL BOYAMA İki farklı renkteki boyanın aynı preparat üzerinde belli tekniklerle ve art arda uygulanması ile gerçekleştirilen bir boyama şeklidir. Örnek Gram boya

GRAM BOYA 1-Preparat hazırlanır (yayma, kurutma, tesbit) 2- Preparatın üzerine kristal viyole kaplanarak 1 dakika bekletilir 3- Boya dökülerek preparat su ile yıkanır 4- Preparatın üzerine lugol kaplanarak 1-2 dakika bekletilir su ile yıkanır 5-Asit-Alkol karışımı ile renksiz sıvı akana kadar renk giderilir (DEKOLARİZASYON) 6-Su ile yıkanır 7- Preparatın üzerine Sulu fuksin veya safranin kaplanarak 30 saniye beklenir 8-Su ile yıkanır 9-Kurutulan preparat mikroskopta immersiyon objektifi ile incelenir.

KRİSTAL VİYOLE

SU İLE YIKAMA

LUGOL

LUGOL

SU İLE YIKAMA

SU İLE YIKAMA

DEKOLARİZASYON

SULU FUKSİN

SU İLE YIKAMA

GRAM BOYA SONUCU İmmersiyon objektifi ile incelendiğinde Mor renkli boyanan bakteriler G+,Pembe renkli boyanan bakteriler G- olarak değerlendirilir G+ bakterilerde peptidoglikan yapı kalın olduğu için aldığı boyayı dekolarizasyon sırasında geç bırakır

EHRLİCH ZİEHL NEELSEN BOYAMA YÖNTEMİ ARB BOYAMA Mycobacterium tuberculosis,Lepra gibi bazı bakteriler aside dirençli boyanma özelliği gösterirler Dekolarizasyonda renkleri gitmez

1-Preparat hazırlanır (yayma, kurutma, tesbit) AARB BOYA 1-Preparat hazırlanır (yayma, kurutma, tesbit) 2-Karbol fuksin damlatılır,Preparatın altından kaynamamasına özen gösterilerek 2-5 dk ısıtılır 3-Asit-Alkol ile dekolarizasyon 4-Metilen mavisi ile 1 dk boyanır 5-Su ile yıkanır 6-Kurutulan preparat mikroskopta immersiyon objektifi ile incelenir.

Asido Rezistan Bakteriler Mavi zeminde Kırmızı renkte görülürler AARB BOYA Asido Rezistan Bakteriler Mavi zeminde Kırmızı renkte görülürler Materyal balgam,çeşitli vücut sıvıları …

sırasında çini mürekkebi veya nigrosin boyası kullanılır. NEGATİF BOYAMA Mikroorganizmaların morfolojilerini incelemek için uygulanan ve mikroorganizmaları değil, bunların yayıldığı ortamı (zemini) boyamayı amaçlayan bir yöntemdir. Bu yöntem daha çok bakterilerde KAPSÜL varlığını ortaya koymak için uygulanmaktadır. Boyama işlemi sırasında çini mürekkebi veya nigrosin boyası kullanılır.

Lamın üzerine ince yayma gibi yapılır Havada kurutulur KAPSÜL BOYAMA Lamın üzerine konan 1 damla çini mürekkep içinde bakteri süspansiyonu yapılır Lamın üzerine ince yayma gibi yapılır Havada kurutulur Alevden geçirilerek tespit edilir Üzerine herhangi bir BAZİK boya konur Mikroskopta incelenir (FAZ KONTRAST MİK)

KAPSÜL BOYAMA Bakteri lam üzerine konmuş bazik boya renginde,zemin siyah,kapsül boyasız olarak görünür

ve endospor olarak adlandırılan özel formlar oluşturur. SPOR BOYAMA Bazı bakteriler, belli koşullarda, hücre içerisinde dış etkenlere karşı daha dirençli olan ve endospor olarak adlandırılan özel formlar oluşturur. Endospor oluşumundan sonra bakteri hücresi ölebilir veya dağılabilir. Bu durumda endosporlar serbest hâle geçer. Bunlara “serbest spor” ya da kısaca “spor” denir.

kimyasal maddelere karşı vejetatif hücrelerden daha dayanıklı olması, SPOR BOYAMA Sporların soğuk, sıcak, UV (ultraviyole), osmotik basınç gibi fiziksel etkilere ve kimyasal maddelere karşı vejetatif hücrelerden daha dayanıklı olması, kimyasal ve fiziksel yapılarının farklılığından kaynaklanmaktadır ,

Sporların üç önemli özelliği vardır: SPOR BOYAMA Sporların üç önemli özelliği vardır: Kimyasal maddelere karşı geçirgensizlik (impermeabilite) Sıcaklığa karşı dayanıklılık (termostabilite) Kırılma indisinin artması (refraktibilite) Sporların bu özellikleri, özel spor boyama yöntemlerinin geliştirilmesine neden olmuştur

SPOR BOYAMA Sporların normal çevre sıcaklıklarında boyaları içlerine almaya karşı dirençleri vardır Ancak boya çözeltisinin sıcaklığı yaklaşık 100˚C’ye yükseltildiğinde sporların bu direnci kırılmakta ve sporlar boyayı içlerine alarak boyanmaktadırlar.

Preparat boya ile alttan ısıtılır SPOR BOYAMA Preparat boya ile alttan ısıtılır Boya olarak Malaşit Yeşili kullanılır Soğuduktan sonra yıkanır Dekolarizasyon yapılmadan kontrast boya olarak safranille 20 saniye boyanır İmmersiyon objektifle incelenir Sporlar YEŞİL,bakteri kırmızı,pembe görülür

KİRPİK BOYAMA Bakteri kirpikleri mikroskopla bile görülemeyecek kadar ince (12-30 nonometre) oldukları için özel yöntem gerekir Tannik asitle muamele edilir.Bu madde kirpik üzerinde çökerek,kirpik ve bakteri çeperi gözlemlenebilir kalınlığa ulaşır Ve boya yapılır İncelenir

RIA (radyoaktif madde ile işaretlenmiş antikorlar) VİRUSLARIN BOYALARI Elektron mikroskobu Floresan mikroskobu İşaretli antikorlar, inkülüzyon cisimcikleri(sitoplasma, nukleusdaki boyama) Western blood Elisa RIA (radyoaktif madde ile işaretlenmiş antikorlar)

Boyasız preparat hazırlamada serum fizyolojik PARAZİT BOYALARI Boyasız preparat hazırlamada serum fizyolojik Boyalı preparat hazırlamada Eozin ve Lugol kullanılır Eozin ile parazit yumurtaları soluk pembe,zemin kırmızı Lugol ile parazit yumurtaları sarı-kahverengi görülür

Niçin Mikroskop Kullanıyoruz? Çıplak insan gözü; Cisimlere ancak ~25cm yaklaşabilir ve 0.2 mm’den daha küçük cisimleri göremez.

Işık Mikroskobu Mekanik bölüm Optik bölüm Mikroskop ayağı Preparat tablası Makro ve mikro vida Objektif tablası (Revolver) Tüp Optik bölüm Işık kaynağı Kondansör ve Diyafram Objektifler Oküler

Preparat tablası

Objektif tablası REVOLVER

Objektiflerin görevi Objeden gelen ışık demetlerini toplamak ve büyümüş gerçek görüntü oluşturmaktır.

Oküler Fonksiyonu: Tüp içinde objektif tarafından oluşturulan görüntüyü büyütmek Zahiri görüntüyü hazırlamak, Objektifin ışık kusurlarını düzeltmek.

Kondansör Fonksiyonu: Işığı obje üzerinde odaklamak ve yoğunlaştırmaktır. Böylece ışığın dağılarak görüntüyü bozması önlenir ve rezolüsyon artar. Sıcak lambayı optik bölümlerden ve kullanıcıdan uzak tutar.

Diyafram Işık kaynağından gelen ışık demetinin çapını kontrol etmek için kullanılır. Işık kaynağının üstünde ve kondansörün altında yerleşiktir. Işığın şiddetini azaltmak için değil, en iyi kontrast ve rezolüsyon elde edilecek ışık çapını ayarlamak için kullanılır.