Enterik Bakteri İdentifikasyonu (6) Not: enterik : bağırsak orijinli  1-Koloni Morfolojisi Bakteri morfolojisi, makroskobik ve mikroskobik morfoloji olmak üzere iki grupta incelenir. Makroskobik morfoloji, daha çok koloni morfolojisi olarak bilinir. a- Makroskobik Morfoloji Bakteriler aynı besiyerinde, aynı koşullarda üretildiğinde, hep aynı özellikte koloni oluşturur. Aynı bakteri değişik besiyerine ekildiğinde ise farklı koloni yapısı oluşturur. Bu değişik yapıdaki koloniler incelenerek bakteriler tanımlanır. Koloninin büyüklüğü, şekli, kenarlarının ve yüzeyinin düzenli olup olmadığı, koku, renk, parlaklık, saydamlık durumu, viskosite, (bazı kolonilerin özeyle temas edip çekildiğinde, özeye yapışıp sünme özelliği göstermesi) kuruluk, yayılma, çözünürlük durumu, kanlı besiyerine ekilmişse hemoliz yapıp yapmadığı gibi özelliklerine bakılarak koloni tipi belirlenir.

Endo Agar’da Escherichia coli : Büyüme iyi, renk kırmızı, metalik parlaklık var.

Macconkey Agar - Laktozu fermentleyebilmelerine göre Coliformlar ve diğer enterik patojenlerin üretim ve ayırt edilmesinde kullanılır. Enterobacter aerogenes : Büyüme iyi, kırmızı pembe koloni. Escherichia coli : Büyüme iyi, kırmızı pembe koloni, presipitasyon var. Proteus mirabilis : Büyüme iyi, renksiz koloni. Salmonella typhimurium : Büyüme iyi, renksiz koloni. Shigella flexneri : Büyüme iyi, renksiz koloni. Enterococcus faecalis : Büyüme iyi, soluk kırmızı pembe koloni. Staphylococcus aureus : İnhibisyon.

b- Mikroskobik Morfoloji Bakteriler genel olarak şeffaf görünür ve bu nedenle mikroskopta direkt olarak incelenmeleri güçtür. Bakteri tanımlama yollarından birisi onları boyayarak mikroskobik morfolojilerini incelemektir. Böylece, bakterilerin; şekilleri, büyüklükleri, diziliş yapıları, belirli hücre organellerinin varlığı çeşitli boyalara karşı davranışları (gram pozitif-gram negatif), vb. hakkında bilgi elde edilir.   2-Pigment Oluşumu Her bakteri değişik renklerde pigment oluşturur. En çok kırmızı, turuncu, sarı bazende yeşil renkli pigmentlere rastlanır. Bazı bakterilerin pigmenti renksizdir. Oksijen teması ile renk kazanır. Anaerop bakteriler genellikle pigment yapmaz.

4-Laktoz Fermantasyonu 3-Hareket Klebsiella ve Shigella dışında tüm enterik bakteriler hareketlidir. Bir kaç yöntemle bakteri hareket özelliklerini incelemek mümkündür.   4-Laktoz Fermantasyonu EMB(EOZİN METİLEN BLUE)   besiyerine ekilen bir bakteri laktozu kullanabiliyorsa fermentasyon sonucu oluşan asit, ortamın pH’ını düşürür ve indikatörün renk değiştirmesiyle koyu renkli koloniler oluşur. Escherichia coli ve Klebsiella laktoz pozitif bakterilerdir. Eğer bakteri laktozu fermente edemezse asit oluşmaz ve ortamın pH’ı değişmez ve oluşan koloniler renksiz ve şeffaf görünür. Salmonella, Shigella ve Proteus laktoz negatif bakterilerdir. Escherichia coli Negative reaction: Klebsiella

5-Üreaz Enzim Aktivitesi Bazı bakteriler, üreaz enzim aktiviteleri ile üreyi parçalayarak CO2 ve amonyak oluşturur. Oluşan alkali ortam, besiyerinin kırmızıya dönmesine neden olur. Proteus ve Klebsiella üreaz pozitif  bakterilerdir

6-Hidrojen Sülfür (H2S) Yapımı Bazı bakteriler, içerisinde kükürt bulunan aminoasit ya da başka sülfatlı bileşikleri (sodyum tiyosülfat) kullanarak hidrojen sülfit (hidrojen sülfür) oluşturur. Besiyerinin siyahlaşması pozitif olarak değerlendirilir. SS(Salmonella Shigella Agar) besiyerinde Salmonella typhi H2S pozitiftir.  

7-Asit-Gaz Yapımı TSİ (Triple sugar iron agar) besiyeri aynı zamanda asit ve gaz oluşumunu gözleyebilmek amacıyla kullanılır. Gaz oluşumunda besiyeri yukarıya doğru itilir. TSİ besiyerinde, üst kısmın kırmızı, dibin sarı olması, bakterinin tüm şekerleri kullanmadığını gösterir. Bu tip besiyerinde gaz da oluşmamışsa, bakterinin Shigella olma olasılığı vardır. Eğer besiyeri tamamen sarıya dönüşmüş ve gaz olşumu da varsa Escherichia coli düşünülür.

STERİLİZASYON   Sterilizasyon genelde bir ortamdaki bütün mikroorganizmaları öldürme yada ortamdan uzaklaştırma işlemi olarak tanımlanabilir. Mikrobiyolojik açıdan ise laboratuvar ekipmanlarının ve besiyerlerinin, bilinen herhangi bir yöntemler üzerinde veya içinde bulunan mikroorganizmaların vejetatif şekillerinin ve dayanıklı (dirençli) sporlarının öldürülmesi yada ortamdan uzaklaştırılması işlemine sterilizasyon denir. Sterilizasyon işlemi uygulanan materyale steril denir. Sterilizasyonda amaç, en dayanıklı spor formunun bile öldürülmesidir. Ancak her zaman mutlak bir sterilizasyondan bahsedilemez. Besiyerleri veya çeşitli sıvı çözeltilere uygulanan sterilizasyon işlemlerinin, bu ortamların kimyasal veya fiziksel yapılarını hiçbir şekilde değiştirmeyecek şekilde olmasına dikkat edilmelidir.

Sterilizasyon Yöntemleri   A-Fiziksel Yolla Sterilizasyon  1- Isıl işlem uygulaması a- Kuru Sıcaklık a.1 Alevden geçirmek Analiz sırasında steril tüp, erlen, pipet ve balon gibi cam malzemelerin ağız kısımlarının açılıp kapanması esnasında, ayrıca steril pens, bistüri gibi araçlar ve sterilize edilmiş pipetler kullanılırken, çevreden kaynaklanacak yüzeysel kontaminasyonu önlemek amacıyla Bunzen beki alevinden 1-2 defa geçirilir. a.2 Alevde tutmak Özeler kullanımdan önce ve kullandıktan sonra ucu akkor hale gelinceye kadar bunzen beki alevinde tutulur. a.3 Kuru sıcak havada bekletmek Genellikle sterilizasyona hazırlanmış boş ve temiz cam malzemeler(balon, pipet, erlenmayer vb.) ile metal malzemelerin(bistüri, pens vb.) sterilizatörde belli sıcaklık ve sürede tutularak sterilize edilmesidir. Bunun için 160 °C 'da 2 saat veya 170 °C 'da 1 saat tercih edilir.

b- Buharla Sterilizasyon   b.1 Basınçlı buharla sterilizasyon (otoklav) Kuru sıcak havada sterilize edilemeyen araç gereçler ile özellikle besiyerleri ve çeşitli çözeltiler ile eküvyon ve membran filtreler otoklavda sterilize edilir. (Bazı durumlarda sterilizasyona hazırlanmış boş, temiz malzemeler de otoklavda basınçlı buharla sterilize edilebilir.)

b.2 Basınçsız buharla sterilizasyon   -Kaynatma; bazı cam ve metal malzemelerin sterilize edilmesinde kullanılan yöntemdir. Bu amaçla Benmari yada Bunzen beki alevi üzerinde hazırlanan kaynar su banyosu kullanılabilir. Kaynatma ile yeterli bir sterilizasyon için merkez sıcaklığın 95-98˚C’a çıkması ve bu sıcaklıkta en az 10 dakika kalması gerekir. -Tindalizasyon; sıcaklığa duyarlı besiyerlerinin veya çözeltiler kaynar su banyosunda yada Benmaride Tindilizasyon yöntemine göre sterilize edilir. Bu yöntemle çözeltiler ve besiyerleri 3 gün arka arkaya ısıtma ve soğutma işlemi uygulanır. -Doymuş su buharında tutmak: doymuş su buharı elde edilen özel kazanlarda yapılır. Sterilizasyon süresi 100˚C’de yaklaşık 90 dakikadır.

2- Işınlama İle Sterilizasyon   UV gibi ışınların kullanıldığı sterilizasyon yöntemidir. Maddede sıcaklık yükselmediğinden ışınlarla sterilizasyona soğuk sterilizasyon denir. İyonize radyasyon; kullanırken yüksek risk nedeniyle özel güvenlik tedbirleri alınmasını gerektiren bir yöntemdir. Genel olarak radyasyon sterilizasyonu dendiğinde iyonize ışınlar kastedilir. - İyonize olmayan radyasyon; UV ışını ile yapılır. UV ışınları yüzeysel etkili olduğundan, tam sterilizasyon sağlamaz sadece mikroorganizma sayısında azalma meydana getirir. Gıda işletmelerinde hava, su, araç gereç ve oda sterilizasyonunda kullanılır.

3-Mekanik Yöntemler ile Sterilizasyon Filtrasyon; bakterilerin geçemeyeceği kadar küçük gözenekleri olan özel filtrelerin kullanıldığı bir sterilizasyon yöntemidir. Düzenekte bulunan ekipman önceden sterilize edilmelidir. Santrifügasyon; bir çözeltideki katı partiküllerin(burada mikroorganizmaların) yüksek dönme hızına sahip santrifüjlerde belli sürelerde döndürülerek çöktürülmesi prensibine dayanır. Üstteki berrak sıvı genel olarak mikroorganizma içermez, dibe çöken kısımda ise mikroorganizmalar bulunur. Ultrasonik titreşim; bu amaçla ultrasonik titreşim yaratan aygıtlardan yararlanılır. Böylece bakteri hücre duvarları parçalanmaktadır.   B- Kimyasal Yolla Sterilizasyon Dezenfektanlar, Antibiyotikler, Boyalar kullanılmaktadır

Besiyeri Sterilizasyonu   Kullanılacak Besiyeri Sterilizasyonu Kullanıma hazır steril besi yerleri ve besi yeri katkıları dışında laboratuvarda hazırlanan tüm besi yerleri ve besi yeri katkıları sterilize edilmelidir. Besiyeri Sterilizasyonun amacı; Dehidre besiyeri, besiyeri katkıları ve besiyeri hazırlanırken kullanılan cam araç-gereç, hassas terazi, su, pamuk, vidalı kapak vb.den kaynaklanabilecek tüm mikroorganizmaları yok etmektir. Böylelikle besiyerinde yalnızca örnekten veya ana kültürden gelen mikroorganizmaların gelişmesi sağlanır. Besiyerleri yapısına ve özelliğine göre farklı yöntemlerle sterilize edilir. Besiyeri sterilizasyonunda; Ø Isıl işlem (basınçlı buhar(=otoklav), tindalizasyon, kaynatma) Ø Membran filtrasyon Ø Işınla sterilizasyon yöntemleri kullanılır. Hazırlanıp sterilize edilen agarlı besiyeri, steril petri kutularına aseptik koşullarda 15-20 ml dökülür.

Hazırlanıp sterilize edilen agarlı besiyeri, steril petri kutularına aseptik koşullarda 15-20 ml dökülür.

Kullanılmış ve İşi Bitmiş Kültürlerin Sterilizasyonu   Kullanılmış ve işi bitmiş kültür (mikroorganizma içerdiği bilinen veya beklenen çeşitli çözeltiler, dilüsyon sıvıları, vb. dahil) içeren cam malzemeler otoklavda 121oC’de 30 dk sterilize edilir. Sterilizasyon sonrasında cam kaplardaki besiyeri lavobaya dökülür. Cam kaplar fırçalanarak deterjanla yıkanır. Kullanılmış ve işi bitmiş kültürlerin sterilizasyonu kaynar su banyosunda 100oC’de 15-30 dakika tutularak da yapılabilir. Ancak bu işlem sporları öldürmez. Besiyerlerinin Sterilizasyon Sıcaklık Derecesi ve Uygulama Süresi Ø Besiyeri cinsine, Ø Hazırlanan besiyeri miktarına, Ø Besiyerinin sıvı ya da katı oluşuna, Ø Besiyerinin bulunduğu kabın cinsine göre değişir.

Besiyeri cinsi; Besiyerlerinin kullanım kılavuzunda sterilizasyon koşulları belirtilir. Her besi yeri önerilen süre ve sıcaklıkta sterilize edilmelidir.   Hazırlanan besiyeri miktarı: Balondaki 1 L besiyeri ile test tüpündeki besiyerinin ısıl işlem süresi aynı olmamalıdır. Laboratuvarlarda pratik olarak besiyerlerinin 500 ml hacimlerde hazırlanması önerilir. Test tüplerindeki besiyerleri 121 ОC’de 15 dakika sterilize edilirken, 2 litreliklerin 30 dakika sterilize edilmesi gerekir. Besiyerinin Sıvı ya da Katı Oluşu: Agarın ısı iletim katsayısı düşük olduğundan agarlı besiyerleri sıvı besiyerlerinden 5–10 dakika daha uzun süre sterilize edilirler.

Boş Cam Malzemelerin Sterilizasyonu   Boş, temiz ve kuru cam malzemeler sterilizasyon hazırlığından sonra genellikle kuru sıcak hava yöntemiyle Pastör Fırınında (etüv) sterilize edilir. Sterilizasyona Hazırlık Tüpler: İyice temizlenmiş tüplerin ağızları sıvıları emmeyen özel yağlı pamuk (kalaycı pamuğu) ile kapatılarak içinin kontamine olmaması sağlanır. Pamuğun tüp içindeki kısmı 1.5-2 cm, dıştaki kısım ise 1 cm olmalıdır. Tüpler gruplar halinde kağıtla sarılarak sterilizasyona hazırlanır. Balon, erlenmayer gibi geniş ağızlı kaplar: Ağızlarına gazlı bez sarılarak pamuk tamponlar konulduktan sonra ağız kısımları kağıtla sarılarak sterilizasyona hazırlanır. Petri kutuları: yıkama, durulama, saf sudan geçirme ve kurulama işleminden sonra tek tek veya ikili, üçlü gruplar halinde kağıtlara sarılarak veya kağıda sarmadan özel metal kutulara gruplar halinde yerleştirilerek sterilizasyona hazır hale getirilir. Pipetler: Pipetlerin sivri uçları kabın dibine gelecek şekilde madeni pipet kabı içine yerleştirilir ve kapağı kapatılır. Pipet uçlarının kırılmaması için metal kutunun dibine alüminyum folyo yerleştirilir. Pipet kutusu yoksa pipetler kağıtlara sarılarak sterilizasyona hazırlanmalıdır.

BESİYERİ(ORTAM, VASAT) Mikroorganizmaların üretilmesi, canlılıkların devam ettirilmesi, saf kültürlerinin elde edilmesi, makroskobik morfolojilerinin ve biyokimyasal özeliklerinin incelenmesi, biyolojik ve metabolik ürünlerinin elde edilmesi v.b. amaçlarla, uygun olarak genelde mikroorganizmaların gereksinim duyduğu maddeleri ve özellikleri içeren besleyici ortamlara besiyeri denir. Besiyeri mikroorganizmaların gereksinim duyduğu temel bazı maddeleri içerecek şekilde düzenlenmelidir. Genel olarak mikroorganizmaların gereksinim duyduğu, dolayısıyla da besiyeri bileşimlerinde yer verilmesi gereken maddeler şunlardır: 1.Su 2.Karbon ve enerji kaynağı maddeler(çeşitli karbonhidratlar,Karbonhidratların yokluğu ve yetersizliği durumlarında proteinler, v.b.). 3.Azot kaynağı maddeler(proteinler, peptonlar, amino asitler,KNO3 ve (NH4)2PO4 gibi azotlu inorganik tuzlar, v.b) 4.İnorganik maddeler (makro elementler: Na,K,CL,P,S,Ca,Mg,Fe; Mikro elementler: Zn,Mn,Br,B,Cu,Co,Mo,V,Sr,v.b) 5.Üreme faktörleri(vitaminler, amino asitler, pürin ve piriminler, v.b)

BESİYERİ ÇEŞİTLERİ Besiyerleri çeşitli şekillerde sınıflandırabilmektir. 1.Genel ayırım: 1.Canlı besiyerleri: Virüs ve riketsiyarları üretmek için kullanılır.(doku kültürleri, embriyolu tavuk yumurtası, deney hayvanları). 2. Doğal besiyerleri: Bileşiminin tümü veya büyük çoğunluğu üzüm şırası veya malt suyu gibi doğal ürünlerden oluşturulan besiyerleridir. 3. Sentetik besiyerleri: Mikroorganizmaların gereksinim duyduğu maddeler belirli oranlar biraraya getirilerek formüle edilen besiyerleridir. Mikrobiyoloji laboratuvarlarında kullanılan besiyerleri çoğunlukla sentetiktir. Bu besiyerleri kuru formda ve hazır karışım halinde çeşitli firmalar tarafından üretilip pazarlanmaktadır. Diğer taraftan bileşimine giren maddeler yine bu firmalar tarafından tek tek de pazarlanmaktadır. Bu maddeler ayrı temin edilir ve formüle göre bir araya getirilerek besiyeri hazırlanmıştır.

2. Fiziksel Özelliklerine Göre Ayırım: 1. Katı Besiyerleri: İçinde katılaştırıcı bir ajan bulunan besiyerleridir. Katılaştırma ajanı olarak genelde agar kullanılır(jelatin, pıhtılaştırılmış serum, yumurta ile mikroorganizmalar için inert maddeler olan silika jel, karregenanlar, alijinatlar ve poliakrilamidler de çok seyrek de olsa katılaştırıcı ajan kullanılabilmektedir) (Nutrient Agar, EMB Agar). 2. Sıvı Besiyerleri: İçinde katılaştırıcı ajan bulunmayan ve daha çok üremeyi teşvik edici besiyerleridir.

3. KAYNAKLARINA GÖRE AYIRIM 1.Hayvansal kaynaklı besiyerleri: Et suyu, balık unu, yumurta sarısı, karaciğer gibi hayvansal kaynaklar içeren besiyerleridir. 2. Bitkisel kaynaklı besiyerleri: Portakal serumu besiyeri gibi bitkisel kaynaklar içeren besiyerleridir. 4.KULLANIM AMACINA GÖRE AYIRIM: Genel besiyerleri: Birçok mikroorganizmanın üremesine olanak sağlayan besiyerleridir. Nutrient Broth ve Nutrient Agar besiyerlerinde laktik asit bakterileri ve üretimi zor patojen bakteriler haricinde pek çok bakteri üreyebilir. Özel besiyerleri: Belli bir amaç veya belli bir mikroorganizma için kullanılan besiyerleridir. Bu besiyerleri kullanım amacına göre değişik isimlerle anılabilmektedir.

Özel besiyerleri aşağıdaki başlıklar altında sınıflandırılabilir; 2.1 Canlandırma besiyeri: Canlılık oranı çok düşük veya belli bir ortamda hasar görmüş mikroorganizmaların; canlandırıldığı, adaptasyonun sağladığı veya kolaylaştırıldığı sıvı besiyerleridir. Yukarıdaki özelliklere sahip mikroorganizmalar önce bu genel amaçlı sıvı besiyerlerinde geliştirilir, daha sonra buradan uygun bir besiyerine aktarılarak incelemeye alınır.

2.2 Selektif (seçici) besiyerleri: İncelenen örnekteki yalnızca belli bir mikroorganizma veya mikroorganizma grubunun tipik olarak gelişimine olanak sağlayacak şekilde formüle edilen besiyerleridir. Örnekteki diğer istenmeyen mikroorganizmaların gelişimine tamamen veya belli ölçülerde engelleyebilmek için besiyerine bir ya da daha fazla sayıda inhibitör ajan eklenir. Bu ajanlar belirli mikroorganizmaların metabolizma veya enzim sistemlerini olumsuz yönde etkiler. Selektif besiyerlerinde, bu besiyerlerine özgül mikroorganizmalar tipik bir gelişme gösterirken besiyerlerine özgü olmayan mikroorganizmalar ya hiç gelişmezler ya da atipik olarak gelişebilirler. Selektif besiyerleri katı veya sıvı formda olabilmektedir. Besiyerine özgü bir mikroorganizma veya mikroorganizma grubu, besiyeri katı ise burada tipik koloniler oluşturur ve/veya besiyerinde belirli değişimlere (renk değişimi gibi) neden olur. Sıvı besiyerinde ise renk değişimi veya gaz oluşumu gibi değişimler meydana getirirler.

Aşagıda selektif besiyerlerine bazı örnekler verilmiştir; EMB AGAR: Koliform grubu bakterilerin teşhis ve ayırımı SS AGAR: Salmonella ve Shigella cinsi bakterilerin izolasyonu ve teşhisi BAİRD-PARKER AGAR: Staphylococcus aureus’un izolasyonu ve sayımı VİOLET RED BİLE AGAR(VRBA): Koliform grubu bakterilerin teşhisi, izolasyonu ve sayımı. BRİLLANT GREEN BİLE BROTH(BGBB): Koliform bakterilerin teşhisi ve varlığının doğrulanması MacConkey Broth(PURPLE): KOLİFORM BEKTERİLERİN TEŞHİSİ Glucose Azide Broth: Fekal streptokokların belirlenmesi TALYUM ASETAT içeren herhangi bir glukoz agar: Laktik streptokokların izolasyonu.

2.3 Elektif (seçime dönük) besiyerleri: Belli bir mikroorganizmanın minimum beslenme gereksinimlerini karşılayacak şekilde formüle edilen besiyerleridir. Örneğin yabani mayalar bir ortamdan Lizin Agar besiyeri kullanılarak izole edilebilir. Bu mikroorganizmalar tek azot kaynağı olarak lizini kullanabilmektedirler. Aynı şekilde YEAST EXTRACT BROTH, propiyodik bakteriler için elektif bir besiyeridir. 2.4 Differensiyal (farklara dönük) besiyerleri: Belli mikroorganizma türlerinin karekteristik koloniler oluşturarak kolayca tanımlanabilir hale geldiği agarlı besiyerleridir.

2.5.Zenginleştirme Besiyerleri: İzole edilmek istenilen mikroorganizmanın bolca üretilebilmesi amacıyla; bu mikroorganizmanın bir veya birkaç fizyolojik isteğini (pH, besin ögesi gereksinimi, vb.) optimum düzeyde karşılayacak şekilde formüle edilen ve inkübasyon koşullarında da ( inkübasyon sıcaklığı ve süresi ) bu yönde önlemler alınan özel sıvı besiyerleridir. Zenginleştirme besiyerlerinin bileşim özellikleri ve inkübasyon koşulları, incelenen örnekteki istenmeyen mikroorganizmaların gelişimini engelleyecek özelliğe sahiptir. İstenmeyen mikroorganizmaların gelişimi, bu besiyerlerine eklenen inhibitörler ya da oluşturulan ters fizyolojik etkenlerle engellenebilmektedir.

2.6.Biyokimyasal Test Besiyerleri: Bileşimine çeşitli indikatörler ve test edilecek kimyasal maddeler ( karbonhidratlar, arjinin, üre, sitrat vb.) eklenerek hazırlanan sıvı veya katı besiyerleridir. Bu besiyerlerinden mikroorganizmaların test edilen maddeyi biyokimyasal değişime uğratıp uğratmadıklarını belirlemek amacıyla yararlanılır . (Karbonhidrat, fermantasyon test besiyerleri,Üre broth besiyeri, vb.) 2.7. Tamamlama ya da doğrulama besiyerleri: Genel olarak mikroorganizmaların metabolizma ürünleri saptanarak teşhise gidilen besiyerleridir. Metabolizma ürünlerinin meydana gelişi inkübasyondan sonra kültüre ilave edilen indikatör veya ayıraçlarla ( Kovac's ayıracı gibi) saptanır.( Tryptone Water ,Glukoz fosfat broth ).

2.8.İndirgenmiş Besiyerleri: Bileşiminde anaerobik mikroorganizmaların daha iyi gelişimini sağlamak amacıyla tiyoglikolat gibi indirgen maddeler eklenmiş besiyerleridir . İndirgen maddeler besiyerindeki çözünmüş oksijen ile kimyasal olarak etkileşime girer ve anaerob mikroorganizmalar için uygun bir ortam yaratır.