Gebe ratlarda metoklopramid maruziyetinin endometrial reseptivite ve gebelik oranlarına etkisi Op.Dr. Yasemin Çekmez TJOD-2015

Amaç Bu çalışmada metoklopramide maruz kalan gebe ratlarda endometriyal integrin β3 düzeylerinin immünhistokimyasal olarak incelenmesi ile ilacın gebelikteki kullanımının gebelik oranları ve endometriyal reseptivite üzerine olan etkisinin araştırılması amaçlanmıştır.

Giriş: Endometriyal reseptivite endometriyum epitelinin yapısal ve fonksiyonel olarak embriyo implantasyonuna hazır olduğu dönemdir.Ratlarda bu süre gebeliğin 4. gününe denk gelir. Endometriyal reseptivite gebelik oranlarını belirlemede primer faktör olarak kabul edilir ve implantasyon dönemindeki Integrin β3 ekspresyonu bu konuda hem insanlarda hem de ratlarda endometriyal reseptivite belirteci olarak kabul görmüştür. Nedeni açıklanamayan infertil kadınlarda endometriyal integrin β3 ekspresyonunda azalmanın etkili olduğu yapılan çalışmalarda gösterilmiştir.

Giriş: Azalmış endometriyal reseptivite konjenital olabileceği gibi çevresel faktörler ve ilaçlara bağlı olarak da görülebilir. Metoklopramid gebelik bulantı ve kusmalarında yaygınlıkla kullanılan hem santral hem de periferik etkileri olan bir ilaçtır.Bu denli sık kullanımına rağmen gebelikte güvenilir olup olmadığına ilişkin bilgiler sınırlıdır. Biz bu çalışmada metoklopramidin endometriyal integrin β3 ekspresyonu üzerine etkisi olup olmadığını inceleyerek endometriyal reseptivite ve gebelik oranlarına etkisini araştırmayı amaçladık

Materyal-metod: Çalışma Ankara Eğitim ve Araştırma Hastanesi hayvan laboratuarı etik kurul onayı alınarak yine aynı laboratuarda yapılmıştır. Deney hayvanlarının seçimi: Çalışma için 150-200 gr arasında toplam 30 sağlıklı dişi rat seçildi.Ratlar çalışma öncesi 1 hafta boyunca rutin olarak beslendi.Vajinal smear methoduna göre tüm ratların estrous dönemi belirlenerek 1:1 olacak şekilde 1 gece boyunca erkek ratlar ile aynı kafeste tutulduktan sonra sabah bakılan smear incelemesinde sperm pozitif olanlar gebe olarak kabul edildi.Toplam 18 gebe rat çalışmaya dahil edilerek 6şar olacak şekilde 3 gruba ayrıldı.

Materyal-metod: Akut toksisitenin belirlenmesi: Çalışmada 0.025kg metoclopramide Hydrochloride toz formu kullanıldı(National Healthcare Pvt.Ltd, Birganj Nepal).3cc salin ile dilüe edilerek bir gecelik açlık sonrası oral olarak uygulandı.Akut toksisite için 10 dişi rat kullanıldı. Ratlar her grupta 2 şer tane olacak şekilde 5 gruba ayrıldı.Gruplara sırasıyla viz.1, 3, 10, 30, 100 mg/kg olacak şekilde artan dozlarda ilaç uygulandı.Ratlar ilk 2 saat ve sonrasındaki 4 saat boyunca gözlendi.Bir gece sonraki mortalite dikkate alındığında 30 mg/ kg dozda toksisite belirtileri izlenmediği görüldü.Tolere edilebilen maksimum dozun(30 mg/kg) 10 da biri olacak şekilde 1mg/ kg ve 3 mg/ kg dozları çalışmada kullanılabilecek güvenli dozlar olarak seçildi.

Materyal-metod: İlaç uygulamaları ve çalışma dizaynı: 6 şar rattan oluşan 3 gruba Kontrol: İlaç yok(kontrol) Düşük doz: Metoklopramid (1mg/kg) oral Yüksek doz: Metoklopramid (3mg/kg) oral olacak şekilde gebeliğin 1. ve 15. günleri arasında metoklopramid uygulaması yapıldı. Tüm ratlar gebeliğin 19. gününde hafif eter anestezisi altında laparotomize edildi.Uterus ve hornlar incelenerek implantasyon sahası sayıları,yaşayan rezorbe olan ve ölü fetus sayıları kaydedilerek gruplar arasında gebelik oranları açısından karşılaştırma yapıldı

Materyal-metod: Endometriyal epitel ve stromanın immünhistokimyasal incelemesi : Streptavidin-Biotin tekniği kullanıldı.1,3 ve 3 mm doku örnekleri alınarak parafin bloklar oluşturulduktan sonra xylene ile yıkanarak dokulardan parafin uzaklaştırıldı.Ardından seri olarak alkol ve PBS (pH:7.2) ile yıkama yapılarak rehidratasyon sağlandı.Mevcut dokular ardından sitratlanarak (pH:6.0)mikrodalga ile 5 dakika ısıtıldıktan sonra rat monoklonal anti-integrin antikorla 25 °C de 60 dakika inkübe edildi.(EPR2417Y, ab75872, abcam, 1:150 dilution) .Konvansiyonel biotin-streptavidin metodu (Thermo, Ultravision anti-Polyvalent HRP/DAB Kit TP-015-HD, United States) uygulanarak sinyal oluşumu sağlandıktan sonra hematoksilen boyaması yapıldı.

İstatistik: Verilerin analizinde SPSS software version 11.5 kullanıldı. The kategorik değişkenlerin karşılaştırmasında Ki Kare testi kullanılırken değerler sayılar ve yüzdeler olarak belirtildi.Sürekli verilerde Kruskall-Wallis ve Oneway ANOVA analizleri kullanılarak değerler median, minimum ve maksimum olarak belirtildi.P < 0.05 değeri istetistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Bulgular: Toplam ve yaşayan fetus sayıları incelendiğinde yüksek doz ilaç uygulanan grupta yaşayan fetus oranlarının diğer gruplara oranla daha düşük olduğu görüldü.(Tablo 1) Tablo 1 * p < 0.05 un-treated vs. high dose **p < 0.05 low dose vs. high dose   Control (n=6) Low dose (1mg/kg,n=6) High dose (3mg/kg,n=6) Number of fetuses Median (Min-max) 10 (0-13) 7.3(0-11) * 3.3(0-8) ** Number of living fetuses 7(0-12) 4(0-9) * 1.3(0-4) **

Bulgular: Özellikle yüksek dozda olmak üzere ilaç uygulanan grupta fetus sayısında azalma ve hornlarda atrofi saptandı. (Fig 1a,1b,1c)

Bulgular: Gruplar arasında endometriyal epitel İntegrin β3 immünhistokimyasal boyamasında anlamlı fark izlendi. Endometriyal stroma incelemesinde , kontrol grubunda integrin β3 ekspresyonu ilaç uygulanan gruplara oranla daha yaygın ve yoğun (> 50% ) olduğu görüldü. Ancak endometriyal epitelde integrin β3 ekspresyonu açısından gruplar arasında anlamlı fark izlenmedi.(Table 2) ( fig 2)

Bulgular: Tablo 2 * p < 0.05 un-treated vs. high dose **p < 0.05 low dose vs. high dose   Control (n=6)% Low Dose High Dose Endometrial epitelium Staining intensity absent Light Dark 0(0.0%) 2(33.3%) 4(66.6%) 0(0.6%) 3(50%) 1(16.6%) Staining universality <=%50 >%50 0(0,0%) 5(83.3%) Endometrial stroma 0(00,0%) 1(16.6%) * 3(50%) * 2(33.3%) * 4(66.6%) ** 2(33.3%) ** 0(12,5%) ** 1(16.6%) * 3(50,0%) * 1(16.6%) **

Bulgular: Figür 2

Tartışma: İmplantasyon başarılı bir gebelik için ilk aşama olup fonksiyonel bir blastokist, reseptif endometriyum ve maternal -embriyonik dokularda senkronizasyon gerektirir.Endometriyal gland ve stroma arasındaki sinyal kaskadı fetusun implantasyonu ve sağlıklı gelişimi için uygun ortamın oluşmasını sağlar. Günümüzde pek çok çalışma ile endometriyal reseptivite ile ilgili pek çok gen ve belirteç olduğu ortaya koyulmuş olup Integrinler endometriyal reseptivite prediktörü olarak kabul gören belirteçlerdendir. integrin αvβ3 kombine çalışmasının özellikle insan endometriyumunda hücreler arası etkileşimle adezyonu tetiklediği kabul edilmektedir. Integrin implantasyon sürecinde özellikle glandüler epitelde eksprese olurlar ve gebelik oluştuktan sonra stromaya doğru yer değiştirirler.

Tartışma: Azalmış İntegrin β3 ekspresyonuna bağlı azalmış endometriyal reseptivite konjenital olabileceği gibi çevresel etkenlerle de olabilir.Germeyer ve ark yaptığı çalışmada açıklanamayan tekrarlı gebelik kayıpları olan olgularda integrin ekspresyonunun sağlıklı gebeliği olanlara oranla anlamlı olarak düşük olduğu rapor edilmiştir. Endometriyozis nedenli infertil olan bayanlarda da integrin αvβ3 azalma olduğu gösterilmiştir. Yine çevresel etkenlere örnek olarak Zhou ve ark SOPH maruziyetinin doz bağımlı olarak endometriyal reseptiviteyi azalttığı ve embriyo implantasyonu bozduğunu yaptıkları çalışma ile göstermişlerdir.

Tartışma: Biz bu çalışmada gebe ratlarda metoklopramid maruziyetinin integrin β3 ve endometriyal reseptiviteye etkisi olup olmadığını inceledik. Her ne kadar mevcut çalışmalarda ilk trimesterde metoklopramid kullanımının konjenital malformasyon,perinatal ölüm,düşük doğum ağırlığı ve düşük APGAR skorları gibi kötü perinatal sonuçlara neden olmadığı yayınlanmış olsa da ilacın gebelikteki güvenilirliği hala belirsizliğini sürdürmektedir. Bu alanda yürütülen daha dar kapsamlı bir çalışmada yüksek doz metoklopramid maruziyetinin farelerde gebelik oranlarını azalttığı rapor edilmiş olup etki mekanizması konusunda inceleme yapılmamıştır.

Tartışma: Integrin β3 ün epiteldeki fonksiyonu adezyonun sağlanmasıyken gebelik oluşmasından sonra stromaya göç eder ve implantasyonun gerçekleşmesinde rol oynar. Çalışma sonuçlarımıza göre metoklopramid endometriyal epiteldeki integrin β3 ekspresyonunu azaltmamaktadır.Ancak stromal integrin β3 ekspresyonu yüksek doz grubunda anlamlı olarak düşüktür.Bu etkinin implantasyon için önemli olan gebeliğin 4. gününde endometriyal resptivitede azalmaya neden olduğunu ve buna bağlı gebelik oranlarında azalma olduğunu düşünmekteyiz. Rezorbe olan ve ölü olan fetus sayısının yüksek doz ilaç uygulanan grupta fazla saptanması da yine ilacın integrin β3 düzeyini azaltması sonucu yetersiz implantasyon olarak yorumlanabilir.

Sonuç: Bu çalışma gebelikte metoklopramid maruziyetinin integrin β3 ekspresyonuna etkisini araştıran ilk çalışma özelliğinde olup insan gebelikleri üzerindeki etkisi konusunda kontrollü veri bulunmamaktadır. Gebe ratlarda metoklopramid maruziyeti doz bağımlı olarak integrin β3 ü etki ederek embriyo implantasyonunu azaltmaktadır. Çalışma sonuçlarımıza dayanarak gebelikte metoklopramid kullanımının kar zarar hesabı yapılarak kullanılmasını önermekteyiz. Bu konuda daha geniş seri insan ve hayvan çalışmaları ile metoklopramid in gebelikteki güvenilirliği incelenmelidir.

Teşekkür Ederim