Dr Özlem Aydemir Yrd. Doç. Dr. Mehmet Özdemir CİNSEL AKTİF AVUSTURALYALI KADINLARDA SERVİKAL MYCOPLAZMA,UREOPLAZMA,TRİCHOMONAS VE VİRAL AJANLARIN MULTİPLEKS PCR İLE TANIMLAMA ORANLARI Dr Özlem Aydemir Yrd. Doç. Dr. Mehmet Özdemir

Multiplex PCR Testing Detection of Higher-than-Expected Rates of Cervical Mycoplasma, Ureaplasma, and Trichomonas and Viral Agent Infections in Sexually Active Australian Women JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, May 2009,

Servisit, uterin serviksin akut yada kronik inflamasyonudur ve genellikle seksüel geçişli ajanlarla meydana gelir. Neisseria gonore, Clamidya trochomatis sıklıkla raporlanan ajanlardır. Bununla birlikte etyolojik ajanların çoğu tanımlanamamıştır. Diğer yapılan epidemiyolojik çalışmalar servikal enfeksiyöz ajanların sıklığı açısından önemli farklılıklar göstermektedir

Tedavi edilmeyen servisitler endometrit, pelvik inflamatuar hastalık, salpenjit gibi asenden enfeksiyonlarla sonuçlanabilir. Ayrıca servisit mukozanın bozulmasına, inflamatuar hücrelerde viral replikasyonun artmasına izin vererek HIV virüsüne duyarlılığı artırır. PCR ve DNA hibridizasyonu gibi moleküler metodların geliştirilmesiyle genital infeksiyonlarda rolleri olan CMV, HSV1, HSV2, adenovirüs, mollicutes, ureoplazma parvum, urealticum, mycoplazma hominis ve genitalium içine alan ajanların daha fazla araştırılmasına olanak sağlamıştır

EBV, VSV ve enterovirüslerin sebep olduğu genital infeksiyonlar raporlanmıştır. Yukarıda belirtilenlere ek olarak Tropenoma pallidum, Clamidya trochamatis, Trichomonas vaginalis, B grubu streptokoklar ve 5 adenovirüs türünün tespiti için geleneksel tabanlı VDL05, VDL06, VDL07, VDL09 dört PCR kullanımı raporlanmıştır.

Materyal-metod 2006-2007 yılları arasında Avusturalya Sidney’de servisit araştırması için yapılan henüz yayınlanmamış vaka kontrol araştırması için ve işe alım için alınan 175 kadının servikal sürüntü örnekleri(233) incelendi. Bunların içinde servisit olan ve olmayan kadınlar vardı. Kadınların tümü 18 yaş üstündeydi. Kadınlar, antibiyotik tedavisi almayan yada önceki ay içinde jinekolojik müdahale yapılmayan, IU kontraseptif kullanmayan, hamile yada menstruasyon döneminde olmayan semptoma bakılmaksızın bir internal muayene olan kadınlardı.

Örnekleme yöntemi: Servikse steril bir metal spekulum kullanılarak ulaşıldı ve steril olmayan bir eküvyon çubukla eksuda kaldırıldı. Endoservikal sürüntü pamuk bir eküvyonla alındı ve viral transport mediuma koyulmadan önce bakteriyel ajanları değerlendirmede kullanıldı ve -70 derecede saklandı. Aynı bölgeden alınan iki ardışık numunede kullanılan viral transport eküvyon, viral transport medium ile süspanse edildi. Bu iki örnek aşağıdaki testlerle test edildi.

Nükleik asit extraksiyonu- PCR Bu eküvyonlar nükleik asidin ekstraksiyonundan önce 500 ml transport mediumda süspanse edildi. Çalışma protokolü üretici firmanın talimatlarına uygun olarak robotik sistemle ((MagNaPure LC; Roche, Germany) ekstraksiyon yapıldı. +4 derecede saklanan örnekler 48 saat içinde çalışıldı.

Molliculet sınıfının tanımlaması(VDL06) U. parvum, U. urealtikum , M. genitalium, M. hominisi tanımlamak için tek yönlü mPCR master mix tasarlandı. Bu ticari master miks tanı labaratuarında kullanılan moleküler metodları doğrulamak amaçlı kullanıldı. RT basamaklarında 50 derecede 30 dk, denatürasyonda 94 derecede 30 dk 50 siklus, 57 derecede 30 sn, 72 derecede 1 dk, ayrılma basamağında 72 derecede 7 dk bekletildi. Ürünler gel elektroforezde görüntülendi. Probe hibridizasyonla identifiye edildi. Bilinen pozitif klinik örneklerden PCR ile kontrol grubu oluşturuldu.

Virüs tanımlaması(VDL05) CMV, HSV1, HSV2, VZV ve enterovirüs tanımlaması için nested mPCR kullanıldı. Ürünler gel elektroforezi ile görüntülendi. Probe hibridizasyon ile identifiye edildi.

Adenovirüs A-E tanımlaması Adenovirüs tanımlaması daha önce tanımlanan metodlara dayanmaktadır. Termal siklusta denatürasyon basamağında 94 derecede 5 dk, 30 siklus, ve ekstansiyon basamağında 72 derecede 5 dk bekletildi. Ürünler gel elektroforezi ile görüntülenmiştir.

Sensitivite ve spesifite ölçümü Çoğu ajan için pozitif kontrollerin sayısı yeterli değildi. Testlerin duyarlılıkları plazmid algılama sınırı ölçülerek değerlendirildi ve her ajan için plazmid yakalama sınırı tespit edildi.

kontrol: Yukarıda belirtilen testler için pozitif kontroller ya kültür ya da kanıtlanmış moleküler kaynaklardan elde edilmiştir . Daha önce açıklanan primerler kullanılarak tüm örneklerdeki gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaz geninin amplifikasyonu, ekstraksiyon ve PCR’ı doğrulamak için yapıldı.

sonuçlar Her bir ajan için tesbit sınırı 10-105 kopya arasındaydı. Ajanların tümü 175 katılımcı kadının ilk veya daha sonraki muayenelerinden alınan örneklerde tespit edildi. En sık karşılaşılan organizma mollicutes sınıfı idi ve 233 sevikal sürüntünün 159 tanesinde (%68.2) tespit edildi.

Tek başına yada U. parvum ile kombinasyonu en sık tanımlananlardı. Bunu M. hominis, U. urealticum, M. genitalium izledi. Virüslerden CMV baskındı ve VSV izledi. Örneklerin %3’ünden azında EBV,HSV1, HSV2 tanımlandı. Adenovirüs tanımlanamadı..

VDL07 ile en sık tanımlanan ajan T. vaginalisti.(%4) Clamidya trochomatis ve B grubu streptokok örneklerin %1’inden azında tanımlandı. 175 kadının 42’sinde multipl infeksiyon tanımlandı. Bu hastaların ikisinde 2 ayrı durumda infeksiyon vardı . Koinfeksiyonu olan 44 hastanın tümünde mollicutes sınıfı vardı ve bunlardan en sık U. parvum görüldü.

8 hastada trichomonas tanımlandı. 6 hastada U. parvum ile koinfeksiyonu tanımlandı.

tartışma mPCR testleri tek reaksiyonda birden fazla ajanın eş zamanlı saptanmasına olanak sağlar ve burada geniş oranda mikroorganizma tespit edilmiştir. Bu çalışmada geliştirilen PCR daha önce rutin tanı labaratuvarında virüslerin tespiti için yapılan tanımlamalara dayanmaktadır.

Rutin tanı labaratuvarında temel moleküler hizmetler ile testlerin performansı iş akışını kolaylaştırır. Revers transkriptaz reaksiyonunu içine alan bir ticari master mix seçimi ajanların DNA ve RNAsını tespit eden yoğun labaratuvar ortamında faydaları vardır. VDL05 mPCR ve VDL07 nested PCR sensitivitesi artmışken PCR sonrası prob hibridizasyon ile spesifitesi artmıştır. Türe spesifik primerler tarafından hedef bölgelerdeki değişim nedeniyle adenovirüs m PCR post PCR probhibridizasyon olmadan tek basamaklı PCR ile sınırlı kaldı.

M hominis, M. genitalium, U M hominis, M. genitalium, U. parvum ve urealticum(VDL06) için tek basamaklı PCR kullanıldı. Bu ajanların tanımlaması için bu metodu Yoşhida geliştirdi. Bununla birlikte bu yöntem bu çalışmadaki hibridizasyon reaksiyonu için U. parvum ve urealticum ile çapraz reaksiyon verdi.

VDL05 kullanılarak en sık izole edilen virüs CMV idi. CMV bağışıklığı iyi olan kadınlarda servisitlerde sık karşılaşılan bir ajan değildir. Bununla birlikte Çin’de yapılan prospektif bir çalışmada servikal human papillomavirüslü kadınların %5.1’inde, eraziv servisitlerin %14’ünde gösterilmiştir.

Hamilelerde infeksiyon, spontan düşüklere sebep olabilir. Fetal infeksiyon ve konjenital anomaliler için önemli risk faktörüdür. Bu çalışmada kadınların %6.3 ünde CMV tanımlanmıştır ve bu oran daha önce Avusturalya kliniklerinde raporlanmamıştır. Önceki çalışmalar en sık genital HSV infeksiyonunun HSV2 olduğunu göstermişken daha yeni çalışmalar HSV1 genital infeksiyonunun giderek arttığını göstermiştir.

Bu çalışmada HSV1, HSV2 den daha sık tespit edilmiştir. Bu çalışmada 175 kadının hiç birinde test sırasında akut HSV infeksiyonunun yada genital erezyonun bulguları yoktu. Kadınlarda EBV ilişkili genital ülserler raporlandı. Bu durum tanımlanamayan veya yanlış tanımlanmış HSV infeksiyonuna bağlı olabilir.

Yeni yapılan bir çalışmada EMN ile infekte bir partnerden cinsel yolla infeksiyonun bulaştığını gösteren güçlü kanıtlar vardı. Tayland’da bir çalışmada HSV ilişkili genital herpesi olan kadınların %56.7 sinde klinik önemi belirlenmiş olmamasına rağmen EBV DNA nın mevcut olduğu görüldü. Kadın genital sistemindeki enterovirüs varlığı, antenatal ve perinatal infeksiyona yatkınlık oluşturabilir.

Rusya da yapılan bir çalışmada genç kızların %16 Rusya da yapılan bir çalışmada genç kızların %16.3 ünde vulvavajinitin uzamış formlarında vajinal salgılarında coxsackie A ve B virüsü tespit edildi. Daha yakın zamanda Afrika’da yapılan bir çalışmada doğurganlık çağındaki kadınların yaklaşık %10 unda enterovirüs RNA tespit edildi. Bu, anneden çocuğa antenatal ve perinatal geçişin sebebi olabilir.

Çalışmamızdaki kadınların %2 Çalışmamızdaki kadınların %2.8 enterovirüs saptanması risk altındaki hastaların oranını gösterir. Bu çalışmada mollicutesin üreme yetersizliği genitoüriner yol infeksiyonu ile neonatal morbidite ve mortalite ile olan ilişkisi tanımlandı. Bu çalışmada genital infeksiyonlarla ilişkili mollicutesin dört türünün tanımlanma oranları önceki çalışmalarla uyumluydu. En sık U. parvum tanımlandı.

M. genitaliumun tanımlanması giderek önem kazanmaktadır. Servisitli kadınlarda son zamanlarda yüksek oranda raporlanmaktadır. Ayrıca infekte cinsel partnerden cinsel yolla bulaşma sıklığı yüksektir. Bu analizde T. vaginalis %4 le kadınlarda en sık tespit edilen ajan oldu ve pap smear, mikroskopi gibi geleneksel yöntemlere göre moleküler tekniklerin daha avantajlı olduğu kanıtlanmış oldu.

Bu analiz, seksüel geçişli ve sıklıkla asemptomatik trichomonas infeksiyonunun tanımlanmasına imkan vermiştir. T. vaginalis; pelvik inflamatuar hastalık ve olumsuz doğum sonuçları ve HIV virüsü bulaşma riski ile ilişkili bulunmuştur. B grubu streptokoklarla vaginal kolonizasyon genellikle seksüel geçişle ilişkili değildir ve asemptomatiktir. Bununla birlikte eğer B grubu streptokokların servikal kolonizasyonu tanımlanmamışsa ve eradike edilmemişse fetüs ve yenidoğanda patolojilere sebep olabilir.

C. trochomatis sıklıkla servisitle ilişkilidir ve dünya genelinde cinsel yolla geçen bakteriyel infeksiyonların en sık nedenidir. Bu populasyondaki klamidyal infeksiyonların saptanma oranı (%1) beklenenden daha düşüktür ve bu durum bu çalışma grubunda PID olan ve antibiyotik tedavisi alan kadınların dışlanması ile açıklanabilir. Burada belirgin olduğu gibi frengili servisit nadirdir ama tanımlanması önemlidir. Çünkü infeksiyon klinik ve kolposkopik olarak primer serviks kanserini taklit eder.

İdeal olanı bu ajanın tanımlanmasında kullanılan tahliller daha duyarlı olmalı ve yüksek riskli hastalarda duyarlılığı artırmak için monopleks yapılmalıdır. Adenovirüsler nadiren genital infeksiyonla ilişkilidir. Burada adenovirüs tanımlanamamıştır. N. gonorenin N. subflava ve cineria gibi yakından ilgili suşlarla çapraz reaksiyon vermesi nedeniyle tanımlamada bir test geliştirilemedi.

Bu patojenin tanımlamasında kültür teknikleri basit ve uygun işlemlerdir. Burada görüldüğü gibi seksüel sağlık kliniklerinde tedavi edilen kadınların servikslerinde mollicutesin beklenenden daha yüksek oranda görüldüğü gözlenmiştir. Bu PCR testleri kommensal patojenlerin ayırt edici özelliklerini ve bu mikroorganizmaların infeksiyonlardaki önemini açıklamayı kolaylaştıracaktır.

Sonuçta servisit ve diğer genital infeksiyanların tanısında ve spesifik patojenlere karşı tedavideki ajanların seçiminde, uygun müdahaleleri yönlendirecektir. Servisitin etkin tedavisinin, jinekolojik infeksiyonları ve fetal gelişim risklerini azaltması gibi önemli sonuçları vardır.