MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER 1: KANDAN DNA İZOLASYONU

MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER 1. KANDAN DNA İZOLASYONU DNA hücrede serbest bir molekül halinde değildir. Bazı proteinler (histonlar, histon olmayan proteinler, HMG proteinler) ve RNA ile bir kompleks halinde bulunur. Virüsler gibi canlılarda da bir protein kılıfı içinde yer alır. DNA’nın izolasyonu, değişik organizma gruplarında hatta aynı organizma grubu içerisinde farklılıklar gösterse de temelde üç aşamadan meydana gelir. 1.Hücre duvarının parçalanması 2.DNA-protein kompleksinin çözülmesi 3.DNA’nın ortamdaki diğer moleküllerden ayrılması

Kandan Genomik DNA İzolasyonu 1- 1.5ml.lik tüpe 900l Red Blood Cell (RBC) Lysis solüsyonu konur. 2- 300µl tam kan ilave edilir.Oda sıcaklığında 10 kez ters düz edilerek 5dk inkübe edilir. Eritrositlerin parçalanması sağlanır.Hücrelerin iyi bir şekilde lisize olmaları için bu süre uzatılabilir. 3- 14.000 rpm.de 20 san.santrifüjlenir.

Kandan Genomik DNA İzolasyonu 4- Tüpte lökositlerin oluşturduğu beyaz pellet (tüpün dibinde) ile 10-20l residual sıvı kalacak şekilde, kalan parçalanmış eritrositlerin oluşturduğu supernatant (üst kısım) atılır.Pellet ile sıvının karışması için 10 san. vortex yapılır. 5- 300l Cell Lysis solüsyonu eklenerek pipetaj ile karıştırılır. 6- 100µl Protein Precipitation solüsyonu eklenir.İyice karışması için yüksek hızda 10 san. vortexlenir.

Kandan Genomik DNA İzolasyonu 7- 14.000 rpm. de 1dk. santrifüjlenir. Hücrelerin parçalanarak, proteinlerin dibe çökmesi sağlanır. Böylece DNA proteinlerden uzaklaştırılmış olur. 8- 1.5ml.lik boş tüpe 300µl %100’lük isopropanol konur. 9- DNA’yı içeren supernatant kısmı alınarak isopropanol üzerine ilave edilir.Yavaşça 50 kez ters düz edilerek karıştırılır.İsopropanol kalan maddelerin ve suyun DNA’dan uzaklaşmasını sağlar. Böylece DNA ipliksi yapıda görünür hale gelir. 10- 14.000 rpm. de 1dk santrifüjlenir ve DNA’nın dibe çökmesi sağlanır.

Kandan Genomik DNA İzolasyonu 11- Supernatant dikkatlice dökülür ve tüpler kurutma kağıdı üzerinde kurutulur. 12- DNA pelletini yıkamak için 300µl %70’lik etanol ilave edilip birkaç kez ters çevrilir. 13- 14.000 rpm.de 1dk santrifüjlenir. 14- Etanol dikkatlice dökülür.Tüpler kurutma kağıdı üzerine ters çevrilerek kurutulur. 15- 50µl DNA Hydration solüsyonu ilave edilerek ve orta hızda 5 san. vortexlenerek. DNA’nın çözünmesi sağlanır *Hazırlanan DNA aynı gün içinde kullanılacaksa +4ºC’ye konulabilir.Uzun süre saklanabilmesi için –20 ya da -80ºC’ye konmalıdır.

Kandan Genomik DNA İzolasyonu (Fenol-Kloroform ekstraksiyon yöntemiyle) 1- EDTA’lı kan en az 1 saat dik olarak bekletilmiş olmalı. 2- 350µl kan örneği (lökosit kısmından), 1.5ml hacmindeki mikrofüj tüpüne alınır. 3- 12.000 rpm. de 1dk santrifüj edilir. 4- Supernatant atılıp pelletin üzerine yeniden TE tamponu eklenerek santrifüj tekrarlanır.

Kandan Genomik DNA İzolasyonu (Fenol-Kloroform ekstraksiyon yöntemiyle) 5- Yıkama işlemi tamamlandıktan sonra, pelletin üzerine Proteinaz K ve Lysis Buffer eklenir. Lysis Buffer: -%10 SDS:............................... 80µl -10 mg/ml Proteinaz K:..............5µl -NaCl:.......................................90µl -TE Buffer:.............................500µl ’ye tamamlayacak miktarda 6- Karışım, 56ºC’de 90dk inkübasyona bırakılır.

Kandan Genomik DNA İzolasyonu (Fenol-Kloroform ekstraksiyon yöntemiyle) 7- Tüplere, karışım hacmi kadar fenol eklenir ve tüpler karıştırılır. 8- 2500 rpm. de 2dk santrifüj edilir. 9- Üst faz yeni tüpe alınır.Gerekirse fenol ekstraksiyonu tekrarlanır. 10- Temiz bir tüpe alınan üst faza eşit hacim kloroform ilave edilerek ekstraksiyon yapılır. 11- 2500 rpm. de 2dk santrifüj edilir. 12- Üst faz temiz bir tüpe alınarak 1.5ml çizgisine kadar absolute etanol eklenir.DNA çökmeye başlar.

Kandan Genomik DNA İzolasyonu (Fenol-Kloroform ekstraksiyon yöntemiyle) 13- Çökme tamamlanınca 13.000 rpm. de 3dk santrifüj edilir. 14- Pelleti kaybetmeksizin dikkatlice alkol dökülür. 15- Üzerine ~ 500µl %70’lik etanol ilave edilerek pellet yıkanır. 16- 13. ve 14. basamaklar tekrarlanır. 17- Alkol uçurulur. 18- DNA pelletinin üzerine 150-400µl steril H2O ilave edilir.

Optik Dansite (OD) = 260/280 ~1.8 DNA (µg/ml)=260 nm’deki ODxSulandırım oranıxkatsayı(50)