REPLİKASYON Dr. Lülüfer TAMER GÜMÜŞ M.Ü. Tıp Fakültesi Tıbbi Biyokimya AD MERSİN

Hücre bölünmesi için; Çift zincirli DNA nın bir eş modelinin oluşturulması; REPLİKASYON Hücre yaşamındaki gerekli protein sentezi için DNA daki genetik bilginin RNA ya aktarılması; TRANSKRİPSİYON mRNA nın sitoplazmaya geçerek gerekli protein sentezi için mRNA daki bilginin proteine dönüştürülmesi; TRANSLASYON işlemlerinin HATASIZ YERİNE GETİRİLMESİ GEREKİR!!!!

DNA (REPLİKASYON) Metabolik Bilgi Akışı (SANTRAL DOGMA HİPOTEZİ) RNA (TRANSKRİPSİYON) PROTEİN (TRANSLASYON) (Leninger 4220 Sant Dog)

DNA molekülleri, hücredeki en büyük moleküllerdir ve kromozom adı verilen yapılarda paketlenirler. Her bir kromozomda da bir çift zincirli DNA vardır. Bir insan hücresi toplam 2X1011 km uzunluğunda DNA içerir. DNA vücüttaki bütün proteinlerden sorumludur. Nükleus Kromozom Genler Bir tek kromozom Binlerce kodlayıcı gen taşıyabilir. Kromozomlar üzerinde dağılımları eşit değildir Gen Hücre Deoksiriboz nukleik asid Protein

İnsan Genomu İnsan genomunda yaklaşık 35000 gen bulunmaktadır. İnsan Gen Kümeleri

İnsan Genomu İki birey arasındaki benzerlik %99.9 civarındadır. Arasındaki fark ise yaklaşık 3 milyon nükleotid kadardır. Bu fark bireylerin birbirinden farkını sağlayan ana farklılıktır. Bireyler arasındaki genetik farklılık mutasyonlar sonucu olmaktadır.

Ökaryatik hücreler birden fazla, çoğu bakteri ve viruslar ise bir tek kromozoma sahiptir. DNA, bakterilerde ve mitokondride Halkasaldır. Mitokondri DNA’sı

GEN: Biyokimyasal olarak gen, işlevsel bir biyolojik ürün (protein, RNA) oluşumu için gerekli bilgiyi kodlayan bir DNA parçası veya kromozom kesimi ( bazı olgularda RNA) olarak tanımlanır

Genlerde sentezlenecek proteinin uzunluğu ile orantılı sayıda kodon bulunur.

Aynı tip hücrelerde DNA'nın hem kimyasal özelliğini hem de toplam miktarı, nesilden nesile sabit kalmaktadır Hücre mitoz bölünmeye hazırlanırken DNA bütün uzunluğu boyunca, bütün kromozomlarda bir uçundan diğer ucuna doğru kendini ikiler (Replike eder)

Hücre bölünmesindeki sürede ( interfaz ) ökaryatik hücre çekirdeği kromatin (kromozom materyali) olarak isimlendirilen fiberler içerir. Kromatin eşit oranda *DNA *Bazik protein histonları *Asidik non histon proteinleri *DNA pol. gibi enzimler *Nükleer RNA *Lipidleri içerir.

Histonlar; Düşük moleküler ağırlıklı yüksek oranda arginin ve lizin içeren proteinlerdir. Hücre histonları 5 gruba ayrılır Tip Lizin/Arginin H1 20 H2A 1.25 H2B 2.5 H3 0.72 H4 0.79

Ökaryatik hücrelerde DNA replike olurken kromatinin de replike olmaktadır. Beş histondan H2A, H2B, H3 ve H4 benzerlerini alarak eşleşir ve oktomer-core teşkil ederler. Oktomer yapının etrafına 140 baz çifti içeren DNA sarılarak nüklezomu (Kromatindeki DNA-histon) meydana getirir.

60-80 kadar baz çifti ise histonlardan H1 ile ilişkili olup internüklezomu teşkil eder. Böylece kromozom tesbih taneleri gibi dizilmiş, DNA gibi kıvrılıp katlanan 200 baz çiftlik nüklezomlardan oluşur. Nükleozom Nükleozomun Histon çekirdeği İnternükleozomun bağlaç DNA sı (60-80 bazlık) H1 (LeningerMovies 6901)

DNA-Nükleus- Kromozom RNA – Nükleus- Herhangi bir yerde BAZLAR Baz: Heterosiklik amin Purines g Adenine (A) Guanine (G) Pyrimidines g Cytosine (C) Thymine (T) Uracil (U)

Şeker: Beş karbonlu halkalı bileşik D- Deoxyriboz (DNA) D- Riboz (RNA) Fosfat

Nucleoside Nucleoside - Base + sugar Adenine (A) Guanine (G) Thymine (T) Cytosine (C)

Nucleotide Nucleotide: Base + sugar+fosfat

Zincirler birbirine antiparaleldir Çift heliksdeki 2 DNA zinciri ortak bir eksen etrafında birbirine sarılmıştır. Zincirler birbirine antiparaleldir Bir sarmalda bulunan bazlar, diğer sarmaldaki bazlar ile eşleşir. Adenin-Timin; Guanin-Sitozin Adenin -Timin 2 H bağı Guanin-Sitozin 3 H bağı 5’ 3’ B DNA; Sağ heliks, 10 nükleotid A DNA: Sağ heliks, 11 nükleotid Z DNA: Sol heliks, 12 nükleotid (Leninger 2902 DNA) 5’ 3’ İnternet Thinkwells

pH değiştirilirse; bazlar iyonize olur Melting Tempature: pH değiştirilirse; bazlar iyonize olur ısı artırılırsa; H bağları etkilenir ve 2 DNA zinciri açılır. Heliks yapısının yarısının açıldığı ısıya DNA nın erime derecesi ( melting tempature, Tm) denir. DNA çift zincirinin açılması DNA DENATÜRASYONU olarak adlandırılır, 260 nm de ölçüm yapılır. Fosfodiester bağları ısıya dayanıklıdır.

Tek sarmallı DNA çift sarmala oranla 260 nm de daha fazla absorbans verir. A-T den zengin bölge G-C den zengin bölgeye göre daha düşük ısılarda denatüre olur. (Leninger movie 156401)

Amplifikasyon Leninger 112601 235 = 34 milyar kopya istenen gen 4’üncü döngü Amplifikasyon istenen gen 3’üncü döngü 2’nci döngü 1’nci döngü 35’inci döngü şablon DNA 235 = 34 milyar kopya 21 = 2 kopya 22 = 4 kopya 8 kopya 16 kopya Leninger 112601

PCR

Klinikte Kullanım: Ör; Faktör V Leiden

Hücre bölünmesinin S fazında gerçekleşir 6-8 saat sürer REPLİKASYON Hücre bölünmesinin S fazında gerçekleşir 6-8 saat sürer (Leninger 2601 Movies)

DNA replikasyonu DNA’nın replikasyonu, DNA molekülünün, sakladığı genetik bilgilerin sonraki nesillere aktarılması için kendi kopyasını oluşturmasıdır

Replikasyon; Initiation (başlangıç)—Genomik DNA’daki sentez başlangıcının yeri ve zamanını, Elongation (uzama)—Ana zincirin kopyalandığı replikasyon zincirindeki reaksiyonlar Termination (sonlanma)—Sentez reaksiyonun tamamlanması ve genomik DNA’nın kopyalarının birleştirilmesi

DNA REPLİKASYONU İÇİN 3 TERORİ ORTAYA ATILMIŞTIR. *Konservatif replikasyon: DNA orijinal eş modelinin oluşturulması *Semikonservatif: DNA sarmalı ikiye ayrılır ve onun her bir zincirinin bir eşi sentezlenerek iki eşit sarmal DNA meydana gelir. *Dispertif: DNA nın değişik yerlerinden parçalanarak onun bir kopyasının oluşturulması

SEMİKONSERVATİF REPLİKASYONUN gerçekleşebilmesi için; *DNA polimeraz *Helikazlar (DNA zincirini ayırır) *Primazlar (primerleri sentezler) *DNA ligaz *Endodeoksiribonükleaz Bunların hepsine birden DNA replicase system veya replisom denir Replicase system

2 DNA zinciri birbirine antiparaleldir ve REPLİKASYON 5’ 3’ YÖNÜNDE GERÇEKLEŞİR. Bir DNA molekülü replikasyon yapacağı zaman DNA molekülünün ikili sarmal dizilerim birbirine bağlayan zayıf hidrojen bağları bir fermuar gibi açılır Replication fork

İki DNA zincirinin birbirine antiparalel olması nedeni ile kalıp görevini gören zincir 3’ ucundan 5’ ucuna dogru okunur.

Replikasyon bir noktadan başlamakta, tek yönlü, bir zincir duraksız sentezlenirken (Leading strand-Öncü) diğeri parça parça olarak ( Laggind strand-Geciken) sentezlenmekte (okazaki parçacıkları) ve daha sonra birleştirilmektedir.

Replikasyon prokaryotlarda DNA heliksi boyunca tek ve belirli bir nükleotid dizesinde başlar ve Replikasyon Orjini denir. Ökaryotlarda bir çok orjinden başlar. Bu orjinler çoğunlukla AT bakımından zengindir. (AT den zengin olan bu dizelere Konsesyus dizeler denir) Replikasyonun başlayabilmesi için bu başlangıç noktasının tanınması gerekir. Başlangıç noktasını tanıyan proteinlere “ DNA binding protein” denilmektedir. Binding protein AT zengin bölgeyi tanır

İkinci işlem sarmal DNA nın açılması, çizgisel olması gerekmektedir *İkinci işlem sarmal DNA nın açılması, çizgisel olması gerekmektedir. Bu görevi yapan proteinlere “unbinding proteinler” ( DNA helikaz) denir. Sarmalın açılması için zorlarlar.

Tek sarmal bağlayıcı proteinler ( Heliks oluşumunu önleyici prateinler) Tek sarmalın devamlılığnı sağlar DNA yı parçalayan nükleazlardan korur.

Primaz (RNA Polimeraz): Replikasyon için gerekli RNA öncülerini (Primer RNA) sentezlerler

DNA çift heliksi çatallanma noktasında açıldıktan ve primaz aşamaları tamamlandıktan sonra DNA polimerazların etkisiyle uygun deoksinükleozid trifosfatlardan (dNTP) girişiyle DNA polimerizasyonu başlar ve devam eder

DNA POLİMERAZ III: Primerler üzerine Nükleotidtrifosfatlar arasında internükleotid bağlarını kurar. DNA zincirindeki mononükleotidlerin 3’ hidroksiline, bir d-NTP nin pirofosforilik parçalanması ile ilave olmasını sağlar ve DNA sentezini 5’-3’ yönünde gerçekleştirir. Sentez primerlere ilave şeklindedir Thigwell internet, DNA 3 ve 4internet

DNA POLİMERAZ; Aynı polipeptid yapıda (monomerik) hem sentez hemde düzeltme aktivitesi için ayrı yerler vardır. I II III Subünit 1 >4 <10 3’-5’ eksonükleaz E E E aktivitesi 5’-3’ eksonükleaz E H H aktivitesi (DNA sentezinde asıl görevi yoktur) ÖKARYOT DNA POLİMERAZ      3’ 5’ Hayır Hayır Evet Evet Evet 5’ 3’ Evet Evet Hayır Evet Evet

5’-3’ eksonükleaz aktivitesi; Doğru baz eşleşmesi olan DNA bölgesinden her seferinde bir nükleotid veya daha fazla ( 10) uzaklaştırır. Ör. Primer ve timin dimerleri uzaklaştırılır. 3’-5’ eksonükleaz aktivitesi; DNA zincirine ters yönde olup DNA polimeraz enziminin teşekkül etmiş DNA zincirinde, bazların doğru eşleşip eşleşmediğini kontrol eder, buna düzeltme reaksiyonu (Proof reading) denir.

*Templat bir DNA olmalı DNA POLİMERAZ ÖNCEDEN ŞUNLARI GEREKTİRİR: *Zincirin 5’-3’ yönde ilerleyebilmesi için hazır DNA molekülün 3’OH ucu boş olmalı *Templat bir DNA olmalı *3’OH le ilave olacak dNTP ler ortamda hazır olmalı

*Templat (şablon) bağlayacak bir yer *Primer bağlayacak bir yer DNA POLİMERAZDA 4 YER MEVCUT *Templat (şablon) bağlayacak bir yer *Primer bağlayacak bir yer *dNTP ler için bir yer *Eksonükleaz aktivitesi için bir yer

DNA ligaz: DNA molekünün iki ucunu birleştirir.

Mitomycin A, alkilleme suretiyle; distamycin A, streptonigrin ve bleomycin, DNA ile kompleks oluşturma suretiyle prokaryotlarda DNA replikasyonunu inhibe ederler ve böylece bakteriyostatik etki gösterirler distamycin A, streptonigrin ve bleomycin, DNA ile kompleks oluşturma suretiyle; cytosin-arabinosid, DNA polimeraz inhibisyonu suretiyle gibi çeşitli mekanizmalarla ökaryotlarda DNA replikasyonunu inhibe ederler

Leninger movie, 2701