Gıda Mühendisliği Bölümü GDM203 Genel Mikrobiyoloji Prof. Dr. Kadir HALKMAN Ankara Üniversitesi, Gıda Mühendisliği Bölümü 2014/ 15 Güz Dönemi Ders notu 06 http://food.eng.ankara.edu.tr/index.php?p=622&l=1

EMS Devam Çoklu tüp yöntemi EMS’nin standart uygulanış şeklidir. Sonucun EMS olarak verildiği başka mikrobiyolojik analizler de vardır. Hydrophobic Grid Membrane Filtration ve Colilert sistemi bunlara örnektir.

HGMF 01 Hydrophobic Grid Membrane Filter; ABD’de kullanılan özel bir membran filtrasyon sistemidir. 40x40 olmak üzere filtrasyon alanı 1600 kareden oluşur. Karelerin sınırında hidrofobik bir ızgara sistemi vardır. Filtrasyon sonunda hücre ızgara üzerinde kalamaz, her koşulda ya alttaki ya üstteki ya sağdaki ya da soldaki kareye geçer ve burada koloni oluşturur. İnkübasyon sonunda koloniler değil, pozitif kareler sayılır ve sonuç, özel bir formül ile hesaplanarak EMS olarak verilir.

HGMF 02 1600 karenin her birinin alanı yaklaşık 1,5 mm2 olup, aynı kareye birden fazla canlı hücre düşerse fark edilmesi mümkün değildir. FDA tarafından önerilen formül: EMS: {N X ln [N / (N - A)]} Burada N = membran filitre üzerindeki toplam kare sayısı ve A = pozitif olarak sayılan kare sayısıdır. Formüle göre toplam kare sayısının toplam negatif kareye (N-A) bölünmesi ile elde edilen sayının e tabanına göre logaritması (ln) toplam kare sayısı ile çarpılmaktadır.

Colilert Sistemi 100 mL su numunesine steril dehidre besiyeri ilave edilir, iyice karıştırılır. Böylece su numunesi besiyeri haline gelmiş gibi olur (suya süttozu ilave edip süt yapmak gibi). Bu karışım, özel bir torbaya konulur, özel bir cihaz bu torbayı 50 ya da daha farklı sayıda kuyucuğa ayırır. İnkübasyondan sonra pozitif kuyucuk sayısı özel bir çizelgeden yine EMS olarak verilir.

Tanımlama (İdentifikasyon) 01 Mikroorganizmanın cins ve tür düzeyinde tanımlanmasıdır (Escherichia coli). Bazen sadece cins (Salmonella) bazen familya (Enterobacteriaceae) tanımlama yeterlidir. Tanımlama için ön koşul kültürün saf olmasıdır. Önce koloni morfolojisi incelenir. Küfler hifli yapıdaki kolonileri ile bakteri ve mayalardan kolaylıkla ayrılır. Ancak yine de mikroskopta inceleme gerekir. Bazı bakteriler hifli yapıda koloni oluştururlar.

Tanımlama 02 Mikroskobik morfoloji için basit boyama önerilir. Doğrudan Gram boyama yapmak da mümkündür. Böylece bakteri/ maya/ küf ayrımı kesinleşir. Bakteri ise Gram reaksiyonu, kok ya da çubuk görüntüsü önemli ip uçları verir. Kolonin elde edildiği besiyerinin selektif ya da genel olması, inkübasyon koşulları (sıcaklık/ süre/ aerob/ anaerob inkübasyon) da önemli bilgiler verir. VRB Agar besiyerinde 37 oC’ta 24 saat aerobik inkübasyon sonrası koyu kırmızı renkli, 1-2 mm çaplı koloniler koliform grup bakterilerdir.

Tanımlama 03 Eğer inkübasyon 44,5 oC’ta VRB Agar besiyerinde aynı koşullar altında yapılmış olsa idi aynı koloniler fekal koliformlar olarak tanımlanacaktı. Eğer inkübasyon 44,5 oC’ta VRB Agar + MUG besiyerinde aynı koşullar altında yapılmış olsa idi aynı kolonilerden 366 nm UV lamba altında floresan ışıma verenler doğrudan E. coli olarak tanımlanacaktı.

Tanımlama 04 Tanımlamada mevcut kaynaklardan yararlanılır. Bu amaçla çeşitli biyokimyasal ve fizyolojik testler uygulanır. Bakteri İnd. MR VP Sit. 44,5 oC MUG E. coli (tip 1) + – E. coli (tip 2) Citr. freundii Ent. aerogenes  Ent. cloacae Kleb. pneumoniae

Tanımlama 05 Örneğin, besiyeri bileşiminde triptofan varsa ve bakteri triptofanaz enzimine sahipse triptofanı deaminasyona uğratarak, indol, pirüvik asit ve amonyağa dönüştürür. Besiyerine Kovacs’ ayıracı damlatıldığında üstte en geç 1 dakika içinde vişne çürüğü halka oluşması pozitif sonuçtur. Bakterinin hareketli olup olmaması, belirli pH’da gelişip gelişememesi gibi testler de tanımlamada kullanılabilir.

Gram Boyama 01 Sadece bakterilere uygulanır. Bakteriler Gram (+) ya da Gram (–) olarak ayrılır. Boyamanın esası, hücre duvarındaki lipit miktarı farkıdır. Mikroorganizmalarda lipitlere genellikle bileşikler halinde rastlanır (lipoprotein, lipopolisakkarit). Gram (+) bakterilerin hücre duvarı, bu duvarın %95'ini oluşturan kalın bir peptidoglikan tabakasından oluşmaktadır. Bu oran Gram (–) bakterilerde %5-10'dur. Gram pozitifler, negatiflere kıyasla hücre duvarında çok daha az lipit içerirler.

Gram Boyama 02 Bakteri önce kristal viyole boyası ve iyot ile boyanır. Hücre içinde boya ve iyot birleşerek büyük kompleks oluşturur. Alkol ya da uygun başka bir çözeltiye konulan bakteri hücresinde yağ tabakası erir. Gram (+)’lerde erime az olur ve eriyen bu boşluklardan boya iyot kompleksi çıkamaz, mavi/ mor renk korunur. Gram (–) olanlarda ise hücre duvarında büyük boşluklar oluşur, boya iyot kompleksi buradan dışarı çıkar. Bakteri bu aşamada renksizdir.

Gram Boyama 03 İzleyen aşama herhangi bir kırmızı renkli boya ile boyamaktır. Gram (+) olanlar mavi/ mor rengini korurken Gram (–) olanlar kırmızıya boyanır. Gram boyamada işlem sürelerine dikkat edilmelidir. Renksizlendirme uzun süreli yapılırsa bazı Gram (+)ler, Gram (–) sonuç verirler (Gram labil). Kültürün yaşı da önemlidir. Bazı Gram (+)ler, yaşlandıkça hücre çeperlerinde daha fazla yağ biriktirirler, Gram (–) sonuç verirler (Gram varyabl).

Gram Boyama 04 Katı besiyerindeki koloninin Gram reaksiyonu boyama yapılmadan da belirlenebilir. Yöntemin esası, lam üzerinde 1 damla %3 KOH çözeltisi içinde koloninin bir öze yardımı ile sürekli karıştırılarak suspande edilmesidir. Gram (+)lerde herhangi bir reaksiyon görülmez. Gram (–)lerde ise hücre duvarı 3 KOH ile erir ve arkasından bakteri DNA’sı KOH ile viskoz bir yapı alır. Bu viskoziteye bağlı olarak özenin bu karışımdan hafifçe yukarı çekilmesi ile bariz bir sünme görülür. Bu reaksiyon, KOH Sündürme Testi pozitif olarak değerlendirilir ve Gram (–)ler için tipiktir. Standart yöntem değildir.

Hareket ve Hareket testi 01 Bazı bakteriler flagella denilen organları ile hareket etme yeteneğine sahiptir. Flagella 1 adet olabileceği gibi farklı sayılarda da olabilir. Titreşim (Brownian hareket), gerçek hareket değildir. Hareketlilik testi farklı şekillerde yapılır. İnkübasyon sıcaklığı kritiktir. A: Monotrichous B: Lophotrichous C:Amphitrichous D: Peritrichous

Hareket ve Hareket testi 02 Yumuşak agarlı besiyeri: Tüpte %0,3-0,5 agarlı besiyeri hazırlanır. Bakteri aşı iğnesi ile dik olarak tüpün ortasına ekilir ve inkübasyona bırakılır. Bakteri hareketli ise tüpün her yerinde, hareketsiz ise sadece daldırılan yerde gelişir. *Pozitif ve negatif şahit kullanılmalıdır. *Bazı bakteriler 25-25 oC’ta hareketli, 35-37 oC’ta hareketsizdir (Listeria monocytogenes).

Hareket ve Hareket testi 03 Flagella Boyama: Özel bir teknikle bakteri boyanır ve varsa flagellaları izlenir. 18-24 saatlik genç kültürler kullanılmalıdır ve flagellanın bakteriden kopmamış olmasına özen gösterilmelidir.

Hareket ve Hareket testi 04 Asılı Damla Yöntemi: Özel bir lam (çukur lam) kullanılır. 2-3 öze kültür lamele aktarılır, üzerine çukur lam kapatılır, ters çevrilip, mikroskopta incelenir. Boyama yapılmadığı için görüntüyü almak deneyim gerektirir. Ayrıca brownian hareket (titreşme) ile gerçek hareket karıştırılmamalıdır.

Maya ve Küflerin Tanımlanması Mayalarda tanımlama, bakterilerde olduğu gibi mikroskobik inceleme, biyokimyasal ve fizyolojik testlerle yapılır. Küf tanımlamasında mikroskobik inceleme ağırlıklıdır ve deneyimli bir uzmandan öğrenilmelidir. Solda Aspergillus, sağda Penicillium.