APOPTOZİS BİYOKİMYASI

Jacobson et al., Cell 88:347 (1997)

Nekroz ve apoptozis -Yol açan nedenler Büyüme faktörü eksikliği Hücre yaşlanması HIV Kanser ilaçları Radyasyon Yüksek doz glukokortikoid Fas veya TNFR-1 res. akt. Sitotoksik T lenfositler Çok şiddetli olmayan oksidatif stress Nekroz İskemi Hipertermi Hipoksi Litik viral enfeksiyon Toksik maddelerin yüksek konsantrasyonları Şiddetli oksidatif stress

Nekroz ve apoptozis -Morfolojik özellikler İntakt hücre membranı fakat membranda “bleb” oluşumu Kromatinin nükleer membran civarında toplanması ve yoğunlaşması Hücre küçülmesi Organellerde disintegrasyon yok Hücrenin intakt mitokondri, ribozom, nukleus parçaları ve diğer organelleri içeren membranla kaplı apoptotik cisimciklere parçalanması Nekroz Hücre membranı bütünlüğünün kaybı Kromatin flokülasyonu Hücre şişmesi Organellerin disintegrasyonu Endoplazmik retikulumun dilatasyonu Büyük vakuollerin oluşumu Hücre lizisi

Nekroz ve apoptozis -Biyokimyasal özellikler Bozulmuş iyon hemostazisi ATP gerekmez (pasif süreç) +4 oC’de gerçekleşebilir DNA rastgele parçalanır (agaroz jel elektroforezinde “smear” görüntüsü) Postlitik DNA fragmentasyonu (=ölümün geç safhasında) Apoptozis İyi kontrollu, bazı aktivasyonların ve enzimatik basamakların olması ATP gereklidir (aktif süreç) +4 oC’de gerçekleşmez. DNA internukleozomal alanlarda 180 kb çiftinin katları olacak şekilde kırılır mono ve oligonukleozomlara ayrılır (agaroz jel elektroforezinde merdiven patterni=apoptozisin en önemli belirteci) Prelitik DNA fragmantasyonu (=erken evrede gerçekleşir)

Nekroz ve apoptozis -Diğer özellikler Hücreler tek tek veya birkaçı bir arada ölür Fizyolojik şartlarda da gerçekleşebilir Komşu hücreler veya makrofajlar tarafından fagosite edilirler İnflamasyon görülmez Nekroz Hücreler gruplar halinde ölür Fizyolojik olmayan (patolojik) etkiler sonucu gerçekleşir Lizozomal enzimler salınır İnflamasyona neden olur

İntiharla Ölüm Hücreler intihar kararı ile şunlara neden olur: Küçülme olur Sitokrom c salınımı ile mitokondrileri yıkılır Yüzeylerinde kabarcık benzeri çıkıntılar gelişir Nükleusları yıkıldığında kromatin (DNA ve protein) ortaya çıkar

Küçük, membran katlantılı, fragmanlara yıkılır Normalde plazma membranına yerleşik olan fosfolipid fosfatidilserin, yüzeye çıkar. Bu makrofaj gibi fagositik hücreler ve dendritik hücreler üzerindeki reseptörlere bağlanmakta ve daha sonra hücre fragmanlarını yutmaktadır. Fagositik hücreler inflamasyonu inhibe eden sitokinleri salgılar.

İntiharla ölümdeki sonuçların dizisi öyle düzenlidir ki bu işleme programlanmış hücre ölümü (PHÖ) denilmektedir. Programlanmış hücre ölümünün hücresel mekanizması mitozisin tersine çevrilmesi gibidir. Programlanmış hücre ölümü apoptozis olarak adlandırılmaktadır.

Apoptozisin tanımı Zararlı hücrelerin kendilerini öldürdükleri bir yöntem “hücre intiharı” Kanser apoptozis aktivitesinin olmamasının sonucudur. Tümörler kendilerini kurban etmekten sakınarak kansere yol açar. Böylece zararlı hücrelerin yapısında apoptozis ortaya çıkmaz.

Hücre intiharı nedenleri İki farklı neden vardır: Programlanmış hücre ölümü mitozisdeki gibi normal gelişme için gereklidir. Programlanmış hücre ölümü organizmanın bütünlüğüne karşı bir tehdit oluşturan hücreleri yıkmak için gereklidir.

Normal gelişmede PHÖ Örnekler: İribaşın bir kurbağaya metamorfozu sırasında kuyruğunun rezorpsiyonu apoptozis ile oluşur. Fetusun parmak ve ayak parmaklarının biçimlenmesi aralarındaki dokunun apoptozis ile ayrılmasını gerektirir. Uterusun iç katının (endometrium) menstruasyonun başlangıcında dökülmesi apoptozis ile oluşur. Beyinde nöronlar arasında uygun bağlantıların (sinapslar) biçimlenmesi artakalan hücrelerin apoptozis ile eliminasyonunu gerektirir.

Tehdit oluşan PHÖ Örnekler: Virüslerle enfekte hücreler: sitotoksik T-lenfositler aracılığıyla virus ile enfekte hücrelerin ortadan kaldırılması apoptozis ile uyarılır. İmmun sistem hücreleri: DNA hasarlı hücreler: p53 güçlü bir apoptozis uyarıcısıdır. Kanser hücreleri: Radyasyon ve kemoterapi tedavisi apoptozisi uyarır.

Hücrenin intihara karar vermesi Yaşam ömrünün sürdürülmesi için gerekli pozitif sinyallerin azalması, negatif sinyallerin alınması, arasındaki dengenin bozulması.

Pozitif sinyallerin azalması Çok sayıda hücrenin sürdürülen yaşam ömrü, diğer hücrelerden sürekli uyarımlar almasını gerektirir. Bazı pozitif sinyal örnekleri: Nöronlar için growth (büyüme) faktörleri Lenfositlerin mitozu için esansiyel faktör olan Interleukin-2 (IL-2).

Negatif sinyallerin alınması Hücre içinde artmış oksidanların düzeyi, Bu oksidanlar ve diğer ajanların DNA’ya verdikleri hasar, Bunlar: Ultraviyole ışık x-ray ışını Kemoterapötik ilaçlar

Moleküller hücre yüzeyindeki spesifik reseptörleri bağlar ve apoptozis programını başlatmak için hücreye sinyal verir. Bu ölüm aktivatörleri: Tümör nekrozis faktör - alfa ("TNF") TNF reseptörüne bağlanır. Lenfotoksin (tümör nekrozis faktör – beta olarak ta bilinir) de TNF reseptörüne bağlanır. Fas ligand (FasL), Fas adlı bir hücre-yüzey reseptörüne bağlanan bir moleküldür. (CD95 olarak ta bilinir)

Apoptozis Mekanizması Bir hücrenin apoptozisle intihar kararı vermesi için iki mekanizma vardır. Biri hücre içinden gelen sinyallerle meydana gelme. Diğeri hücre yüzeyindeki reseptörlere bağlanan ölüm aktivatörleriyle başlatılma. TNF Lenfotoksin Fas ligand (FasL)

Apoptozisin modülatör (mediatör) leri Bazı iyonlar (kalsiyum), Moleküller (seramid), Genler (c-myc), Proteinler (p53) Organeller (mitokondri)

Apoptozis nasıl çalışır? Apoptozis kimyasal sinyallere karşı yanıtta yer alır. Hücreler parçalara ayrılır ve bu parçalar paketlenir. Makrofajlar paketleri yutar ve onları yıkar. Aşağıdaki proteinler apoptoziste yer almaktadır: ICE-benzeri proteinler FAS FAS ligand BCL-2 p53

ICE-benzer proteinler ICE = Interleukin-Converting Enzyme (İnterlökin-Dönüştürücü Enzim) apoptozis mediatörü BCL-2 aşırı üretimi ICE-benzer proteaz aktivasyonunu inhibe eder. İntrasellüler asidifikasyon direk ya da indirek yolla ICE-benzer proteazları aktive ederek apoptozisi başlatır. Tüm apoptotik yollar p53-aracılı transkripsiyon akışı ve ICE-benzer proteazların aktivasyonu ile ilişkilidir.

FAS ve FAS ligand FAS ve FAS ligand tümör nekrozis ailesinin transmembran proteinleridir. FAS ligand FAS’a bağlandığında hedef hücrenin ölüm olgusunu başlatır. FAS/FAS ligand sistemi immün yanıtın sonlandırılmasında da önemli bir rol oynar.

Tümör hücreleri FAS ekspresyonunun azaltılmasıyla ile FAS-aracılı apoptozise direnç kazanabilir Onkogenler ve p53 gibi tümör supresör genlerdeki mutasyonlar FAS sinyal işlemiyle de interfere olur. FAS-aracılı apoptozis ICE ailesinde yer alan bir sistein proteaz sınıfının aktivasyonunu gerektirir.

Bcl-2 ailesi Bir kısmının apoptozisi indüklediği (Bax, Bad, Bid, Bcl-Xs), Bir kısmının ise inhibe ettiği (Bcl-2, Bcl-Xl) geniş bir ailedir. Bu ailenin üyeleri kendi aralarında homo veya hetero-dimerler oluştururlar. Hücrenin yaşayabilirlik durumu (“survival”ı) bu ailenin pro-apoptotik ve anti-apoptotik üyelerinin rölatif oranına bağlıdır. Bu heterodimerlerden biri olan Bcl-2/Bax’ın (ikisinin oranının) bazı hematolojik malignensilerde prognostik değer taşıdığı gösterilmiştir.

An Evil Twin: BAX Life/Death Rheostat

BAX Activation Death

p53 p53 kromozom 17 üzerinde haritalanmış olan bir tümör supresör genidir, aktivitesi tümör oluşumunu durdurur. Bir bireyin kansere eğiliminin olması için ebeveynlerinden bir fonksiyonel gen kopyası kalıtımına ihtiyacı vardır. p53’teki mutasyonlar çoğu tümör tipinde bulunmaktadır.

Hücrede, p53 proteini DNA’yı bağlar.  başka bir gen ürünü olan p21 proteinini stimule eder  p21 hücre bölünmesini uyaran protein, cdk2 ile etkileşir  p21, cdk2 ile kompleks oluşturduğunda hücre, hücre bölünmesinin yeni basamağına geçemez. Mutasyona uğramış p53 DNA’ya etkin bir yolla daha uzun süre bağlanamaz.  böylece, p21protein hücre bölünmesi için stop sinyali olarak etki yapamaz  hücreler daha sonra kontrolsüz olarak bölünür ve tümörler oluşur.

Apoptozisin internal sinyallerle başlatılması Sağlıklı hücrede mitokondri dış zarları yüzeylerinde Bcl-2 proteini eksprese olur. Bcl-2 Apaf-1proteinin bir molekülüne bağlanır. Hücredeki internal hasarla Bcl-2, Apaf-1 serbestleşmesi, Mitokondriden dışarı sitokrom c’nin daha uzun süre sızmamasına, neden olur. Serbestleşen sitokrom c ve Apaf-1 caspase 9 moleküllerine bağlanır.

Apoptosom Sonuçlanan kompleks; Apoptosom olarak adlandırılır. sitokrom c Apaf-1 kaspaz 9 (ve ATP) Apoptosom olarak adlandırılır. Bunlar sitozolde agrege olur.

Kaspazlar Kaspazlar (“Caspases”), sistein proteazlardır ve aspartik asitten sonraki peptid bağını kırarlar. Hücrede inaktif (zimojen) olarak bulunurlar ve proteolitik olarak birbirlerini aktifleştirirler. Böylece bir kaskad şeklinde işlerler. Apoptozisde hücreyi parçalayan yani apoptotik morfolojinin oluşumunu sağlayan etkenler olarak bilinirler.

Kaspaz Kaspaz 9 bir düzineden çok kaspaz ailesinin bir üyesidir. Bunlar proteazdırlar. Adlarını proteinleri Asp rezidülerinden kesmeleri nedeniyle alırlar. Kaspaz 9 diğer kaspaz’ları aktive eder. Bir kaspaz’ın diğerini aktive etmesi proteolitik aktivitenin geniş bir kaskadını yaratır (kan pıhtılaşması ve kompleman aktivasyonu gibi). Bu durum; Sitoplazmada yapısal proteinlerin sindirimi, Kromozomal DNA’nın yıkılımı, ve Hücrenin fagositozunu başlatır.

Apoptozisin eksternal sinyallerle başlatılması Fas ve TNF reseptörü hücre yüzeyinde gösterilen reseptör domainleri ile integral membran proteinleridir. Komplementer ölüm aktivatörlerinin (sırasıyla FasL ve TNF) bağlanması sitoplazmaya sinyal geçirir. Kaspaz 8 aktivasyonunu başlatır. Kaspaz 8 (kaspaz 9 gibi) bir kaspaz aktivasyon kaskadını başlatır. Bu da hücrenin fagositozuna yol açar.

Örnek: Sitotoksik T hücreleri ne zaman hedeflerini tanır (bağlar)? Yüzeylerinde çok miktarda FasL üretilir. Bu hücrenin apoptozis ile ölümüne yol açan hedef hücrenin yüzeyinde yer alan Fas ile bağlanır. Apoptozisin erken basamakları en azından C. elegans örneğinde gösterilmiştir ki, reversibldir. Bazı olgularda, hücrenin nihai parçalanması bir fagositin hücre içerisine alınması ile garanti edilmektedir.

BCL-2 Inhibitor Restores Death by Displacing “BH3-Only” to Activate BAK BCL-2 Occupied “BH3 Only” Activation tBID Small Molecule Inhibitor BCL-2 BCL-2 BAK DEATH “Active” BAK

Extrinsic pathway

Cleavage of death substrates LPS CD14 TNF TLR-4 TNFR-1 Bax bad bid ? Mitochondria Caspase 8 ? TRADD Cytochrome c Bcl-2 Bcl-x APAF-1 FADD Caspase-8 Caspase-9 Caspase-3 Caspase-6 Caspase-7 Cleavage of death substrates Potential mechanisms of LPS-mediated apoptosis

Apoptoziste hücrelerde görülen morfolojik değişiklikleri Hücre küçülmesi Hücre şeklinde değişim Sitoplazmanın yoğunlaşması Nükleer zarf değişiklikleri Nükleer fragmantasyon Hücre yüzey yapılarının kaybı Apoptotik cisimcikler Hücrenin parçalanması Kalıntıların fagositozu

Biyokimyasal değişikilikler Serbest kalsiyum iyon artışı bcl2/BAX etkileşimi Hücrenin su kaybı (dehidrasyonu) Mitokondriyal membran potansiyeli kaybı Proteoliz Phosphatidylserinin dışarı çıkması Lamin B proteolizi DNA denaturasyonu 50-300 kb yarılma Intranükleozomal yarılma Protein cross-linking

Apoptozisin özet olarak belli başlı aşamaları Apoptozisin indüksiyonu Hücre yüzey ölüm reseptörlerinin uyarılması Sitokrom c’nin salıverilmesi Apoptozom oluşumu (sitokrom c+Apaf-1 +kaspaz-9) Mitokondriyal transmembran potansiyelin değişmesi Kaspazların aktivasyonu Fosfatidilserinin hücre membranının iç yüzünden dış yüze transloke olması DNaz’ın aktivasyonu sonucu DNA’nın fragmentasyonu (internukleozomal DNA fragmentasyonu) Yapısal proteinlerin yıkılmasına bağlı olarak apoptozise özgü morfolojik değişikliklerin meydana gelmesi

APOPTOZİSİN SAPTANMASINDA KULLANILAN YÖNTEMLER Morfolojik görüntüleme yöntemleri İmmunohistokimyasal yöntemler Biyokimyasal yöntemler İmmunolojik yöntemler Moleküler Biyoloji yöntemleri

Morfolojik görüntüleme yöntemleri 1. Işık Mikroskobu a. Hematoksilen Boyama b. Giemsa Boyama 2. Floresan Mikroskobu / Lazerli Konfokal Mikroskop a. Propidium İyodür (PI) b. Hoechst Dye 3. Elektron Mikroskobu* 4. Faz Kontrast Mikroskobu

Histokimyasal yöntemler Anneksin V Yöntemi TUNEL Yöntemi M30 Yöntemi* Kaspaz-3 Yöntemi*

Biyokimyasal Yöntemler İmmunolojik Yöntemler: 1. ELISA - DNA Fragmentasyonu - M30 Düzeyi 2. Fluorimetrik YÖNTEM - Kaspaz Aktivasyonu (Hücre kültürü Moleküler Biyoloji Yöntemleri: “DNA Microarrays” Gen ekspresyon dereceleri (mRNA) - Hücre ölüm reseptörleri - Kaspazlar Agaroz Jel Elektroforezi - DNA fragmentasyonu “Western Blotting” - Substrat kırılmaları - Aktif kaspaz belirlenmesi - Sitokrom c salıverilmesi “Flow” Sitometri - DNA azalması - Annexin V

DNA merdivenleşmesi ile apoptozisin gösterilmesi 100 bp ladder 1000 bp ladder 5 kb 2 kb 1 kb 0.5kb