DNA sentez mekanizmaları, Mutasyon, DNA Hasarı ve Onarım 10.10.2013

DNA’nın Yapısı 1953 yılında Watson ve Crick tarafından aydınlatılmıştır. Ökaryotlarda çift heliks yapısındaki DNA histon proteinleri ve az miktarda RNA ve histon olmayan proteinlerden meydana gelmiştir. Baz (pürin ve pirimidin), şeker (dezoksiriboz) ve fosfattan oluşan Monodezoksinükleotidlerin birbirlerine 3’→5’ fosfodiester bağı ile bağlanmalarıyla DNA sarmalını oluştururlar.

DNA’nın üç boyutlu yapısında çift heliksin ortak bir eksen etrafında birbirine antiparalel sarılmasıyla meydana gelir. Bir zincirin 5’ ucu diğer zincirin 3’ ucu ile eşleşmiştir. Zincirin iç kısmında bazlar arasında hidrojen bağları vardır. DNA ısıtıldığı zaman hidrojen bağları açılır. Bu olay denatürasyondur. Heliks yapısının açıldığı sıcaklığa Tm erime derecesi denir.

DNA çift sarmalında şeker ve fosfat kısımları omurgayı oluşturmaktadır. DNA yapısında A, B ve Z DNA olmak üzere üç değişik yapıda DNA bulunur. Kromozomal DNA B yapısındadır, sağa doğru ilerleyen heliks yapısında heliksin 3600 dönüş mesafesinde 10,4 nükleotid bulunur.

Replikasyon DNA çift heliksi oluşturan zincirler birbirlerinden ayrıldıklarında herbir zincir yeni zincir için kalıp görevi görür. Yeni zincirler kalıp zincirin tamamlayıcısı (komplementer) olarak sentezlendiği için bu işlem semikonservatif replikasyon adını alır. Kromozomal DNA molekülü hücre döngüsü ile birlikte replike olduğundan herhangi bir nedenle DNA replikasyonu durursa hücre bölünmesi de durur. DNA sentezi hücre döngüsünün S fazında meydana gelir.

During the process of DNA replication, the parental DNA unwinds and since nucleotides have exclusive partners, each DNA can act as its own template for replication.  The two new DNA molecules each consist of one parental strand and one newly made strand.  This is known as semiconservative DNA replication.

Replikasyonda görevli enzimler kalıba bağımlı polimerazlardır. E. Coli replikasyonunda görevli 20’den fazla enzim ve protein görev alır, bunların tümüne DNA replikaz sistemi veya replizom denir.

DNA Replikasyonunda görev alan proteinler DNA Helicase: breaks the hydrogen bonds between DNA strands (unwinds DNA) Topoisomerase: alleviates positive supercoiling (twisting of DNA) ahead of the replication fork Single-stranded binding proteins (SSBPs): keeps the parental strands apart Primase: synthesizes an RNA primer (gets synthesis of new strand started) DNA Polymerase III: synthesizes a daughter strand of DNA DNA Polymerase I: excises the RNA primers and fills in with DNA DNA ligase: covalently links the Okazaki fragments together

The effect of single-strand DNA-binding proteins (SSB proteins) on the structure of single-stranded DNA Tek-zincir DNA’ya bağlanan proteinler monomerler halinde açılmış olan tek DNA zincirinde firkete yapısını oluşturan bölgeleri açarlar.

RNA primer sentezi DNA polimeraz kalıp DNA’da yeni DNA sentezini hemen başlatamaz, öncelikle 10 nükleotidlik bir RNA primerinin sentezlenmesi gerekir. DNA’ya komplementer ve antiparalel RNA parçaları özgün bir RNA polimeraz olan Primaz (Dna G proteini) tarafından sentezlenir. Primerin 3’ hidroksil grubuna DNA polimeraz III tarafından bir nükleotidin bağlanmasıyla replikasyon başlar.

Lider zincirde tek bir primer olmasına karşılık kesikli zincirde belirli aralıklarla her Okazaki parçasından önce birçok primer sentezlenmektedir. Kesikli zincirde RNA primer sentezi başlamadan önce DnaB, DnaC gibi proteinler tek zincir DNA’ya bağlanarak primazla birlikte Primozomu oluştururlar.

DNA Polimerazlar DNA polimeraz III DNA sentezinde rol oynayan enzim DNA polimeraz III’dür. Asimetrik dimer yapısındadır. DNA polimeraz III’ün alfa, epsilon ve teta altbirimleri çekirdek kısmını oluşturur. Polimeraz aktivitesinden alfa altbirimi, sağlamalı okumadan (proofreading) (3’→5’ ekzonükleaz) ise epsilon altbirimi sorumludur. DNA polimeraz I enzimi DNA polimeraz III enziminin aktivitelerine ek olarak 5’ →3’ ekzonükleaz aktivitesine sahiptir. DNA polimeraz III

DNA Replikasyonunun Yönü DNA polimeraz enzimi nükleotid dizilerini 3’ →5’ yönünde okuyabildiğinden komplementer yeni DNA zinciri 5’ →3’ yönünde sentezlenmektedir. Böylece kalıp DNA’dan biri replikasyon çatalına, diğeri ise replikasyon çatalından uzağa doğru ilerleyen iki yeni DNA zinciri elde edilir.

DNA Replikasyonunun Yönü-2 Lider zincir replikasyon çatalı ile aynı yönde kesintisiz bir şekilde 5’ →3’ yönünde, kesikli zincir ise replikasyon çatalının ters yönünde aralıklı küçük DNA parçaları halinde sentezlenir. Bu DNA parçalarına Okazaki parçaları denir. Okazaki parçaları birleştirilerek tek bir DNA zinciri haline getirilir.

Replikasyonun başlaması Ökaryotlarda replikasyonun başlamasını Replikasyon Öncesi Kompleks (Pre-RC) yönetmektedir. pre-RC’nin oluşumuna katılan proteinler: “Başlangıc Tanıma Kompleksi”(“origin recognition complex”, ORC) altı proteinlik bir kompleks, replikatörü tanıyıp bağlanır. Helikaz yükleyiciler , ORC’nin bağlanmasıyla, o bölgede toplanır. · Helikaz (Mcm 2-7 kompleksi) Replikasyon çatalına bağlanır. Prokaryotlarda Ori C bölgesinde 9 baz çiftinin 4 kez tekrarlandığı bölgeye 20 DnaA proteini bağlanmasıyla başlar. DnaA katlanan DNA’yı denatürasyona uğratır. 13 baz çiftinin üç kez terarlandığı A=T den zengin bölgeye bir helikaz olan DnaB proteini bağlanarak çift sarmalın açılmasını sağlar. Bu bağlanma DnaC proteini ve ATP varlığında gerçekleşir.

Replikasyonun başlaması-2 Prokaryotlarda tek bir bölgede ve belirli nükleotidlerde ökaryotlarda ise birden fazla bölgede çift heliks yapısının açılması gerekir. Bu bölge replikasyon orijini adını alır. İki zincir ters yönde dönerek replikasyon çatalı denilen “V” şekilli yapı oluşur ve sentez bu bölgede başlar.

Replikasyonun başlaması-3 Tek sarmallı DNA bağlayan (TSB) proteinler çift sarmallı DNA heliks yapısında tek zincire bağlanır. Bu proteinlerin görevi DNA zincirlerini birbirinden ayrı tutmak tekrar biraraya gelmelerini önlemektir. Sarmalların birbirinden ayrılmasıyla replikasyon çatalı önünde pozitif kıvrımlar (süperkoiller) oluşur. E.coli de tip II topoizomeraz (DNA giraz) negatif kıvrılmaları pozitif kıvrılmalarla nötralize eder.

DNA çift sarmal heliks yapısının açılmasında DNA helikaz enzimi görev yapar. DNA helikazın bu görevini gerçekleştirmesi ATP’nin hidrolizi ile ortaya çıkan enerji varlığında gerçekleşir.

Bir DNA Replikasyon Çatalının Yapısı Yavru DNA zincirleri 5’→3’ yönünde sentezlendiği için geciken zincirde (Lagging strand) DNA sentezlenmesi başlangıç olarak Okazaki fragmentleri denilen kısa DNA zincirinin sentezlenmesi gerçekleşmektedir.

Okazaki fragmentlerinin Sentezi

Ökaryotlarda kesikli zincir sentezi In eucaryotes, RNA primers are made at intervals spaced by about 200 nucleotides on the lagging strand, and each RNA primer is approximately 10 nucleotides long. This primer is erased by a special DNA repair enzyme (an RNAse H) that recognizes an RNA strand in an RNA/DNA helix and fragments it; this leaves gaps that are filled in by DNA polymerase and DNA ligase.

DNA zincir uzaması (elongasyon) DNA polimeraz III polimeraz aktivitesiyle kalıp zincire komplementer olacak şekilde dezoksiribonükleotidleri bağlayarak 5’ →3’ yönünde yeni zincirin uzamasını sağlar. DNA polimeraz III polimeraz aktivitesine ek olarak 3’ →5’ yönünde ekzonükleaz aktivitesine de sahiptir. Bu şekilde zincire yanlış eklenen nükleotidleri kesip uzaklaştırma yeteneğine sahiptir.

DNA zincir uzaması-2 Kesikli zincirde DNA polimeraz III yeni bir RNA primerine kadar devam eder. DNA polimeraz I RNA primerini 5’ →3’ yönünde ekzonükleaz aktivitesiyle uzaklaştırır ve boşluğu doldurur. DNA ligaz enzimi Okazaki parçaları arasında birinin 5’ fosfat grubu ile diğerinin 3’ OH grubu arasında fosfodiester bağı oluşumunu katalizler.

Ökaryotik DNA Replikasyonu Ökaryotik DNA molekülleri çok uzun olduğu için replikasyon birçok bölgede başlar. Bu şekilde replikasyonun kısa bir zamanda gerçekleşmesi sağlanır. Replikasyondan DNA polimeraz alfa ve DNA polimeraz teta birlikte sorumludur. Multimerik bir protein olan DNA polimeraz alfanın bir alt birimi primaz aktivitesinden sorumlu olup RNA primer sentezini sağlar.

Ökaryotik DNA Replikasyonu-2 DNA polimeraz alfa RNA primer sentezinden sorumluyken DNA polimeraz teta zincir uzatılmasından sorumludur. DNA polimeraz teta bakterilerde DNA polimeraz III’e benzerdir, 3’ →5’ ekzonükleaz aktivitesine sahiptir. DNA polimeraz epsilon DNA tamirinde rolü vardır. Ayrıca kesikli zincirde Okazaki parçalarının primerlerinin çıkartılmasında DNA polimeraz I’e benzer görevi vardır. DNA ligaz enzimi ligasyonu sağlar. DNA polimeraz gama ise mitokondri DNA’nın sentezinden sorumludur.

Mutasyonlar Genetik bilginin şifrelendiği nükleotid dizisindeki kalıcı değişiklikler mutasyon olarak adlandırılır. Mutasyona yol açan faktörler: -fiziksel -kimyasal -DNA replikasyonu ve onarımı sırasında meydana gelen hatalar

Mutasyonlar: -Nokta mutasyonları: tek bir baz çiftinde meydana gelir. mRNA’da tek bir kodonun dolayısıyle polipeptid zincirinde tek bir aa değişime yolaçar. A. Missense (yanlış anlama) 1-Transisyon (geçiş) Pürin---pürin Pirimidin---pirimidin GGG (glisin)—AGG (arginin)

2-Transversiyon (çapraz) Pürin---pirimidin Pirimidin---pürin B.Nonsense (anlamsız): herhangi bir kodon terminasyon (nonsense) kodonuna dönüşür (UAA, UGA, UAG). Protein sentezinin erken sonlanmasına ve fonksiyonel olmayan polipeptid oluşumuna neden olur.

Çerçeve kayması mutasyonu (Frame-shift mutasyonu): DNA yapısına bir bazın girmesi veya çıkması sonucu transkripsiyon sırasında mRNA yapısında kendini gösterir. Bu noktadan itibaren kaymaya neden olur. Polipeptid zincirinde aa proteinin karboksil ucuna kadar değişir.

İnsersiyon AAG, AGA, GAA Lys, arg, glu C AAG, CAG, AGAA- Lys, gln, arg Delesyon AAG, AGA, GAA Lys, arg, glu G AAG, AAG, AA- Lys, lys

DNA Hasarına Neden Olan Etkenler Endojen Kaynaklar Eksojen Kaynaklar Yanlış eşleşmeler, insersiyon/delesyonlar Kimyasal değişiklikler: deaminasyon, metilasyon Baz kayıpları: depurinasyon/depirimidinasyon Oksidatif Hasar Replikasyon hataları Fiziksel ajanlar: İyonize radyasyon: UV ışınları Kimyasal ajanlar Aflatoksin, Benzopren, Kemoterapi ilaçları, Alkillejici ajanlar, Vinil klorid, Hardal gazları Eksojen kaynaklar: Fiziksel ajanlar: İyonize radyasyon: Gamma ışınları ve X ışınları, biyolojik moleküllerle reaksiyona girdiklerinde reaktif iyonlar oluştururlar. Baz hasarına ve kaybına, tek veya çift zincir kırıklarına DNA’ın kendisiyle ya da proteinlerle çapraz bağlar oluşturmasına neden olurlar. UV ışınları: Özellikle, DNA tarafından kuvvetlice absorblanan UV-C (~260nm.) ve UV-B ışınları, DNA ve diğer biyolojik moleküllerle reaksiyona girerler. Pirimidin dimerleri (T-T,T-C) oluştururlar, bu dimerler replikasyonu ve transkripsiyonu bloke ederler. Dimerler aynı zamanda yakın iki primidinin 6 ve 4 pozisyonları arasında kovalent bağ oluşumu sonucu da meydana gelebilir Endojen (spontan) Etkenler 1. Yanlış eşleşmeler, insersiyon/delesyonlar 2. Kimyasal değişiklikler: deaminasyon, metilasyon (Deamine bir bazın onarılamaması durumunda nokta mutasyonları görülebilir.) 3. Baz kayıpları: depurinasyon/depirimidinasyon (DNAdan her gün yaklaşık 5000 purin bazı(adenin ve guanin) glikozil bağları hidrolize olduğu için kaybolur. Bu olaya depurinizasyon adı verilir. Benzer şekilde DNA dizisinde sitozinin urasile deaminasyonu günde yaklaşık 100 baz çiftini etkiler) 4. Oksidatif Hasar: 100.000 /hücre/gün 5. Replikasyon hataları   Endojen etkenlerle oluşan hasar onarılmaz ise somatik mutasyonlar ortaya çıkar

DNA Onarımı Replikasyon sırasında sağlamalı okuma ve yanlış yerleşimi onarma olmasına rağmen bazı yanlış yerleşmiş bazlar kalır. Ayrıca hücrede oluşan veya çevreden alınan fiziksel, kimyasal mutajenlerle DNA hasara uğratılır. X-ışınları DNA’la etkileşen moleküller aracılığı ile indirekt olarak bağların yapısını değiştirir. Sigara dumanı, UV ışığı da hasara yol açan etkenlerdir. UV molekülde komşu pirimidinler arasında kovalent dimer oluşumuna neden olur.

Onarım mekanizmalarının çoğu hasarın tanınması, hasarlı kısmın uzaklaştırılması ve boşluğun doldurulması şeklinde üç aşamada gerçekleşir. Onarım hayatın devamı için mutlaka gerekli bir işlemdir. Prokaryot ve ökaryotlarda onarım benzerdir: Baz kesip çıkarma onarım, nükleotid kesip çıkarma ve yanlış eşleşme onarım mekanizmaları

Baz kesip çıkarma onarımı (yanlış baz onarımı) Anormal bazlar spesifik glikozilazlarla N-glikozid bağı kırılarak uzaklaştırılır, geriye dezoksiriboz fosfat kalır. Pürin ve pirimidin bazı çıkarılmış bu bölgeler apürinik veya apirimidinik (AP) bölgeler olarak adlandırılır. AP endonükleazlar AP bölgesini 5’ veya 3’ ucundan endonükleaz tipine göre keser, oluşan boşluğu DNA polimeraz I doldurur ve eklenen nükleotid DNA ligazla bağlanır.

Baz kesip çıkarma onarımı DNA glikozilaz hasarlı bazı tanır ve bazla dezoksiriboz arasından keser. AP endonükleaz fosfodiester bağını koparır. DNA polimeraz I, 5’→3’ ekzonükleaz aktivitesiyle hasarlı kısmı uzaklaştırarak serbest 3’ hidroksil ucundan onarımı başlatır DNA ligaz enzimiyle DNA polimeraz I’ den sonra kalan çentik kapatılır.

Kimyasal mutajen olarak Nitröz asit deaminasyonla adeninden hipoksantin, guaninden ksantin ve sitozinden urasil oluşturur. Urasil glikozilaz DNA yapısına giren Urasili çıkartan enzimdir.

Nükleotid kesip çıkarma onarımı (Yanlış Nükleotid Onarımı) UV etkisiyle oluşan Timin dimerlerinin ve sigara dumanı etkisiyle oluşan benzopiren-guaninin tamirinde görev alır. Nükleotid kesip çıkarma işlemi ABC eksinükleaz enzimi tarafından gerçekleştirilir. İlk aşamada enzimin UvrA ve UvrB altbirimlerinden oluşan kompleks lezyonun olduğu bölgeye bağlanır. UvrA proteini UvrA2-UvrB kompleksinden ayrılır. UvrC proteininin UvrB’ye bağlanmasıyla hasarlı nükleotidlerin olduğu zincirde 3’ ve 5’ yönlerinde kırıklar oluşur. Helikaz ile hasarlı kısmın ayrılması ve DNA polimeraz I ve insanda DNA ε tarafından doldurulur. DNA ligazın zinciri bağlamasıyla onarım tamamlanır.

Yanlış eşleşme onarımı DNA molekülünde normalde bulunan bazların değiştirilmesiyle gerçekleşir. Kalıp zincir üzerinde bulunduğu halde yeni sentezlenen zincirde bulunmayan metil grupları bu ayırımın yapılmasını sağlar. Dam Metilaz ile 5’GATC dizilerindeki adeninlerin N6 pozisyonundan metilleme yapmasıyla başlar. Yeni zincirde metillenir.

E.coli’de bu onarımda Mut S ve Mut L kompleks yapıp yanlış eşleşmiş baz çiftine bağlanır. Mut H de Mut L proteinine bağlanır ve böylece GATC dizisini bulana kadar hareket eder. Mut H endonükleaz aktivitesiyle metillenmemiş zincirde GATC dizisinin 5’ ucundan kırılmayı gerçekleştirir. Metillenmemiş DNA’da DNA helikaz II, tek sarmallı DNA bağlayıcı protein 3’→5’ yönünde ayıran ekzonükleaz I ve X enzimleri yanlış eşleşmiş baz çiftini ayırır. Oluşan boşluğu DNA polimeraz III ile doldurulur ve DNA ligazla bağlanır.

Direkt onarım Timin dimerleri ve alkillenmiş bazlar için geçerlidir. Timin dimerleri fotoliyaz enzimiyle monomerlerine çevrilir. 300-500 nm dalga boyundaki ışık folat tarafından emilir ışık enerjisi FADH- a aktarılır. FADH- elektronu pirimidin dimerine verir ve elektronların düzenlenmesiyle monomerik pirimidin oluşturulur, onarım tamamlanır.