HEMATOLOJİDE TEMEL LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ Dr. Mutlu Arat AÜTF Hematoloji BD arat@medicine.ankara.edu.tr

HASTAYA YAKLAŞIM Anamnez Fizik inceleme Öz geçmiş Soy geçmiş Sistem Sorgusu Pozitif Bulgular/Değerlendirme/Ön Tanı Tetkik ve Tedavi Planı Laboratuvar incelemeler Tanıya yönelik invaziv girişimler HBD 0405

LABORATUVAR İNCELEMELER Tam kan sayımı Retikülosit sayımı Sedimentasyon EPO Temel Koagülasyon testleri Serum Demir Profili/Ferritin, FA, Vit B12, Homosistein Protein EF /Hb EF Immunelektroforez Trombosit Fonks. Testleri Hemolitik Anemi Anti Globulin Test (Coombs) Haptoglobin PNH testleri (AH, SL, HS) Osmotik Frajilite sHb Hasta başı testler: Kanama Zamanı (Ivy) Lacet testi Hasta başı işlemler: PY KİA KİB HBD 0405

Kırmızı Küre Değerleri Hücre Sayımları Kırmızı Küre Değerleri Beyaz Küre Değerleri Uyarı Mesajları HBD 0405

Hemoglobin Ölçümü Hemoglobin potasyum ferrisiyanür “Drabkin Solüsyonu” ile siyanmethemoglobine dönüştürülmekte ve hemoglobin yoğunluğu, 540 nm.deki adsorbansın spektrofotometrik olarak ölçülmesi ile hesaplanır Htk optik sistemle direkt olarak hesaplanabilirken, elektrik empedans yönteminde indirekt olarak KKS ve KK hacmi üzerinden hesaplanmaktadır. HBD 0405

Hemoglobin Ölçümü Sonuç Sinyal ADC İşlemcisi BK Banyosu HGB Lambası Absorbans= log 10 ( VR / Vs ) VR = Referans voltaj Vs = Örnek voltaj HGB Dedektörü& PRE-AMP HEMOGLOBIN + HGB solüsyonu METHEMOGLOBIN CYANIDE HGB SİYANIZASYON Fe++ Fe+++ Fe+++.CN Örnek

HBD 0405

Analiz Yöntemleri (1) Empedans yöntemi: Hücreler dar bir aralıktan geçerlerken doğru akımda meydana getirdikleri empedans (elektrik direnci) değişimi ile sayı ve büyüklükleri belirlenir. Voltaj değişiklikleri hücre büyüklüğü ile doğru orantılıdır. HBD 0405

Bir Kırmızı Kürenin İlerleyişi Empedans Yöntemi Bir Kırmızı Kürenin İlerleyişi Kırmızı Küre Algılama Bölgesi Oscilloscope Oscilloscope

Trombositlerin Kırmızı Kürelerin Arasından Seçilmesi 20 fl 2 fl Ana Hat Trombositler Değişik Büyüklükte Kırmızı Küreler HBD 0405

Analiz Yöntemleri (2) Optik sistem: Hücrelerin üzerine gelen lazer ışını değişik yönlere yansır. Dar açı ile meydana gelen yansımalar hücre büyüklüğü, geniş açı ile ortaya çıkanlar ise hücre yapısının (granularite ve çekirdek yapısı) belirlenmesinde kullanılırlar. HBD 0405

Optik Sistem HBD 0405

HBD 0405

Hücre Büyüklüğüne Göre Sinyal Oluşumu HBD 0405

Hücreleri Büyüklüklerine Göre Tanımlanma Eşikleri HBD 0405

Lökosit Formülü HBD 0405

HBD 0405

HBD 0405

Çalışma Basamakları Kan örneğini özel antikoagülanlı tüpden aspire edilir Bir kısmındaki kan lizise uğratılır Hgb ve BK analizi yapılır. Kalan kısım ise hemolize uğratılmadan kırmızı küre ve trombosit analizi için kullanılır. HBD 0405

HBD 0405

Analiz Öncesi Dönem Kanın alınmasındaki hastanın fizyolojik durumundan alınan kan örneğinin laboratuvara ulaşıp OTKSC’de analiz edilinceye kadar geçen dönemi içine almaktadır. Fizyolojik (yaş, yükseklik, gebelik, sigara) Örnek alınması (bekleme süresi, antikoagülanların etkileri ve endojen interferans) EDTA’ya bağlı psödotrombositopeni Trombosit satellitizmi HBD 0405

EDTA’ya Bağlı Trombosit Kümelenmesi (Yalancı Trombositopeni) HBD 0405

Trombosit Satellitizmi (Yalancı Trombositopeni) HBD 0405

Ölçüm Hatalı Yüksek Hatalı Düşük Beyaz Küre Kriyoproteinler Heparin Paraproteinler Çekirdekli Eritrositler* Trombosit Kümeleşmesi Pıhtılaşma Ezilmiş hücreler (basket hücreleri) Üremi İmmun baskılayıcı ilaçlar Kırmızı Küre Dev trombositler Otoagglutinasyon İn vitro hemoliz Hgb Karboksihemoglobin>%10 İn vivo hemoliz BKS> 50x10e9/L Hiperbilirubinemi Lipemi Paraproteinemi Sulfhemoglobinemi (?) Htk Hiperglisemi (>600mg/dl) In vitro hemoliz Mikrositer kırmızı

Ölçüm Hatalı Yüksek Hatalı Düşük OEH (MCV) Otoagglütinasyon BKS> 50x10e9/L Hiperglisemi Kırmızı küre deformabilitesinde azalma Kriyoproteinler Dev trombositler İn vitro hemoliz Mikrositer kırmızı küre Şişmiş kırmızı küre OEH (MCHC) Pıhtılaşma In vitro hemoliz Hatalı yüksek hemoglobin ölçümü Hatalı düşük hematokrit ölçümü Hatalı düşük hemoglobin ölçümü Hatalı yüksek hematokrit ölçümü Trombosit Sayımı Hemoliz Kırmızı kürelerde inklüzyon cisimcikleri Beyaz kürelerde fragmentasyon Heparin Trombosit kümeleşmesi “clumping” Trombosit satellitizmi

Soğuk Antikor Varlığı

Normal Histogram HBD 0405

Krmızı Küre Histogramı Ana KK populasyonu 256 kanallı yüksek rezolüsyonlu KK histogramı 24 ve 350 fl boyutlarındaki KK ler gösterilmektedir

Kırmızı Küre İndekslerinin Hesaplanması OEHB (MCH): [Hgb (g/L) / KKS (10e12/L)]X10 OEHY (MCHC): [Hgb (g/L) X100 ]/ Htk (%) Htk: [OEH (MCV, fL) X KKS (10e12/L)]/10 HBD 0405

İndekslerin Alt ve Üst Sınırları Ortalama %95 Alt-Üst Sınır OEHB (MCH, pg/h): 31 27-34 OEHY (MCHC): 34 33,5-36 OEH (MCV, fL): 91 78.5-98 HBD 0405

İndekslerin Yorumlanması OEH (MCV) klinik ve tanısal yararı en fazla olan eritrosit indeksidir. OEHB (MCH) genelde OEH (MCV) ile paralellik gösterir ve klinik yararı kısıtlıdır. OEHY (MCHC) demir eksikliği anemisinde diğer mikrositer anemilere göre daha sık olarak düşük bulunmaktadır fakat bu değişiklik geç dönemlerde ortaya çıkar. Artmış OEHY sıklıkla herediter siferositozda gözlenir. HBD 0405

Herediter Siferositoz HBD 0405

Kırmızı Küre Dağılım Genişliği I (RDW) KKDG aslında KK hacim dağılımının varyasyon katsayısıdır (CV) {[Standart Sapma]/ MCH (MCV)}x100 Her cihazın farklı üst sınır değerleri olmasına rağmen % 14’ün üzerinde olması patolojik olarak kabul edilmektedir. “Anisositoz” konusunda bilgi vermekte ve periferik yaymanın mikroskobik incelemesi dahi KK’lerin anormal alt gruplarının saptanmasında KKDG kadar bilgi verici olamamaktadır. HBD 0405

Kırmızı Küre Dağılım Genişliği II (RDW) Bu parametrenin artışının, nütrisyonel eksikliklere bağlı gelişen anemilerde ve özellikle de demir eksikliği anemisinde ilk bulgu !! olduğuna dair yayınlar vardır. Talasemi taşıyıcılığı ile demir eksikliği anemisi ayırıcı tanısında kullanılmaktadır HBD 0405

OEH ve KGDG Beraber Kullanılması OEH AZ. KKDG N. KKDG ART. OEH N. OEH ART. Heterozigot talasemi Demir eksikliği anemisi Normal Bifenotipik anemi Aplastik anemi Folat eksikliği Kronik hastalık S--talasemi Erken demir veya folat eksikliği anemisi Prelösemik durumlar Vit B12 eksikliği Hemoglobin H Kronik karaciğer hastalığı Anemik hemoglobinopati İmmun hemoliz Fragmentasyon Hemoglobinopati taşıyıcılığı (S, C) Miyelofibrozis, Sideroblastik anemi Soğuk agglutininler Transfüzyon KLL* Kemoterapi KLL, KML Hemoraji Herediter siferositoz Bessman JD, et al. Am J Clin Pathol 1983;80:322-326

Kırmızı Küre Üretimi KK Üretim Döngüsü EPO Kemik İliği Renal Doku O2 Algılayıcı KK Üretim Döngüsü Retikülosit Olgun Kırmızı Küre HBD 0405

Kırmızı Küre Olgunlaşması Çekirdekli KK nRBC Polikromatofilik KK Retikülosit Retic Eritrosit, KK RBC HBD 0405

Retikülosit Sayımı (1) OTKSC’lerinde metilen mavisi veya flöresan RNA bağlayıcı boyalarla retikülosit sayısının mutlak değeri saptanabilmektedir Manuel yöntemin yetersiz kaldığı düşük-normal retikülosit değerleri belirlenebilmektedir. “Mutlak retikülosit sayısı” (=%retikülosit x KKS) eldesi, düzeltilmiş retikülosit yüzdesi (= %Ret x Htk / 45) kavramına gereksinimi ortadan kaldırmaktadır. HBD 0405

Retikülosit Sayımı HBD 0405

Retikülosit Sayımı 1 RET Trombosit eşiği 2 RET Ko-insidans eşiği 3 RET eşiği 4 Düşük/Orta RET eşiği 5 Orta/Yüksek RET eşiği A Olgun KK B Düşük absorbsiyon retik. C Orta absorbsiyon retik. D Yüksek absorbsiyon retik. E Trombositler F Ko-insidan olaylar HBD 0405

Retikülosit Sayımı (2) Retikülosit <80x10e9/L rejeneratif olmayan anemi Retikülosit >120x10e9/L rejeneratif anemi 80x10e9/L < Retikülosit Sayısı <120x10e9/L= gri zon HBD 0405

Retikülosit Sayımı (3) Hastalık Retikülosit Sayımı ROİ Aplastik Anemi Düşük Aplastik Kriz Düşük/Normal Hipoplastik Anemi Düşük/Yüksek Kemik İliği Rejenerasyonu Kronik Hastalık Normal Demir Eksikliği Yüksek Talasemi Normal/Yüksek Miyelodisplastik Sendromu ? Folat/B12 eksikliği Hemolitik Anemi Kan Kaybı (kanama)

Normokrom Normositer Anemi HBD 0405

Normokrom Normositer Anemi HBD 0405

Demir Eksikliği Anemisi HBD 0405

HBD 0405

Beta Talasemi Minör (Trait) HBD 0405

Orak Hücreli Anemi HBD 0405

55 yaşında kadın hasta artan yorulma nedeniyle doktoruna başvuruyor 55 yaşında kadın hasta artan yorulma nedeniyle doktoruna başvuruyor. Pansitopeni belirlenip hastaneye sevk ediliyor. Şüpheli Uyarı Kesin Uyarı WBC Imm Gran Nötropeni %,# RBC Dimorfik RBC PLT Trombositopeni

Sonuç: Vit B12 eksikliği, megaloblastik anemi HBD 0405

Trombosit sayısı ve indeksleri Hacimleri 7,8-11 fL Sayım 150-450.000/mL Psödotrombositopeni: EDTA, paraproteinemi, trombosit satalletizim, uzun süre bekletilmiş kan HBD 0405

PERİFERİK YAYMA Wright veya Giemsa boyası kullanılır. Kanın tüm şekilli elemanlarının morfolojisini görmekteyiz. 10x 10/40 ve 100 büyütmeler ile mikroskopik değerlendirme yapılır. HBD 0405

Sedimentasyon Endikasyonlar: Hematolojik Malinitelerde tanı/tedavi/prognoz (Malin L, MM, vb) Sistemik infeksiyonlar (Öz. Tbc) Otoimmun hastalıklarda hastalık aktivitesi Sodyum sitratlı kan örneğinde çalışılır (siyah kapaklı,uzun tüpler) Kan /Antikoagülan oranı önemli (1/4) Kanlar bekletilmemeli Ölçüm sırasında ısı, titreşim gibi dış faktörler hata kaynağıdır, ölçümler laboratuvar ortamında yapılmalıdır HBD 0405

Eritropoetin (EPO) Endikasyonlar: ELISA yöntemi kullanılarak ölçülür Kronik hastalık anemisi (Inflamasyona sekonder anemiler, anemi ile giden hematolojik maliniteler Renal parankimal bozukluğu olanlar Eritrositoz ve Polistemiler (Primer/Sekonder) ELISA yöntemi kullanılarak ölçülür Antikoagulansız kan kullanılır HBD 0405

Koagülasyon Testleri Kanama zamanı Pıhtılaşma zamanı Protrombin zamanı İnr (Uluslararası normalizasyon oranı) Parsiyel tromboplastin zamanı Trombin zamanı Fibrinogen/ D-Dimer HBD 0405

Kanama Zamanı Kanama zamanı: <10 dakika Duke metodu Ivy metodu Modifiye Ivy: Simplate veya Template 5mm uzunluk ve 1mm derinlikte standart ve yüzeyel kesi yapılır. HBD 0405

Protrombin Zamanı-PTZ Ekstrensek yol göstergesidir. Doku faktörü, FVII, FX, FV, FII, I’i gösterir. Oral antikoagulanların etkinliğini izlemede kullanılır. 10-14sn INR: Hasta PZ/Kontrol PZ= 0,8-1,0 HBD 0405

Aktive Parsiyel Tromboplastin Zamanı (aPTT) İntrensek yolu gösterir. FVIII, FIX, FXII eksikliğinde yararlı 20-35saniye HBD 0405

Dilüsyon Testi (50:50) PTZ uzaması her zaman faktör eksikliğini göstermez. Dilusyon testi: Hasta plazması ile normal plazma 1:1 dilue edilir. Bir saat 37 derecede enkübe edilir ve PTZ testi tekrarlanır. Yorum: PTZ normale dönerse (veya %25 kısalma var): Faktör eksikliği PTZ normale dönmedi: Faktörlere karşı inhibitör var. HBD 0405

Serum Demir Serum demir düzeyi diurnal varyasyon gösterir ve en yüksek düzeylerine sabah ulaşır. Serum demiri kolorimetrik veya RIA ile sabah açlık kanında ölçülür. Multivitamin preparatları 24 saat içinde serum demirini yalancı olarak yükseltir. Serum demiri, transfüzyon ile de yükseldiğinden multitransfüze hastalarda serum demiri düzeyi yanıltıcı olabilir. Serum hemolizli olmamalıdır ve kan silikonize ya da propilen tüplere alınmalıdır. HBD 0405

Demir Bağlama Kapasitesi TDBK, demir eksikliği anemisi için en çok spesifik olandır (%100), fakat sensitivitesi düşüktür (%30). HBD 0405

Transferrin Demir eksikliğinde transferrin artar, demir yüklenmesinde azalır. Ayrıca transferrin negatif akut faz reaktanı olup inflamasyon, infeksiyon, malignansi, kronik karaciğer hastalığı ve nefrotik sendromda düzeyi azalır. Gebelik ve oral kontraseptif kullanımında ise transferrin düzeyi yalancı olarak artar. Steroid alanlarda ise yalancı olarak düzeyi düşer. HBD 0405

Ferritin Demirin depo formunun solubl şeklidir, depo demiri ile serum ferritini arasında lineer korelasyon vardır. Serum ferritini RIA, EIA yöntemleri ile güvenilir olarak ölçülür ve serum ferritin düzeyinin 12 ng/ml'den düşük olması demir depolarının boş olduğunu gösterir. Ferritin'in demir eksikliğinde düzeyi azalır, kronik hastalık anemisinde ise artar. 1 ng/ml ferritin, 8 ng depo demirine eş değerdir. Serum ferritin düzeyi iki haftadan fazla demir tedavisi alınca ya da kan transfüzyonu sonrası bakılırsa yalancı olarak normal ya da yüksek çıkabilir. Serum ferritin düzeyine demir tedavisine başlamadan ya da demir tedavisi kesildikten en az bir hafta sonra bakılmalıdır. Ferritin bir akut faz reaktanıdır ve inflamasyon, infeksiyon, uzun süreli açlık, KBY, hematolojik malignansi varlığında düzeyi artar ve mevcut olan demir eksikliğini maskeler. Bu tip durumlarda serum ferritin <100 ng/ml olsa dahi demir eksikliğini gösterebilmektedir. HBD 0405

Spesifik Laboratuvar Testleri Protein elektroforezi İmmun elektroforez Hemoglobin elektroforezi Trombosit fonksiyon testleri HBD 0405

Protein Elektroforezi Endikasyonlar: Açıklanamayan Sed. Yüksekliği Paraproteinemi varlığı Plazma hücre diskrazileri Serumda proteinler elektriki mobilitelerine göre incelenmesidir. Albumin, alfa1, alfa2, beta, gama Immunoglobulinler gama, alfa2 ve beta HBD 0405

Malin veya kontrolsüz üretim Multiple Miyeloma WMG Malin lenfoma KLL Primer Amiloidoz Plazma hücreli lösemi Ağır zincir hastalığı Benin veya stabil üretim Benin monoklonal GP Soliter plazmasitoma Kronik soğuk agll hast. Gecici tipte (infeksiyonlara sekonder) AIDS Gaucher hast.

Hemoglobin Elektroforezi Endikasyonlar: Hb zinciri sentez bozuklukları: Talassemi sendr. Hemoglobinopatiler: Orak hücreli Anemi HBD 0405

Trombosit Fonksiyon Testleri (Agregasyon) HBD 0405

İnvaziv girişimler Kemik iliği aspirasyon ve biyopsi HBD 0405

Kemik iliği aspirasyon ve biyopsisi Hematolojik ve hematolojik olmayan hastalıkların tanısı ve ayırıcı tanısında kullanılır. Her iki iliak krest (posterior veya anterior), sternum, çocuklarda anterior tibia. HBD 0405

KEMİK İLİĞİ ASPİRASYON İĞNESİ HBD 0405

HBD 0405

Kemik İliği Aspirasyonu HBD 0405

Boyama Yöntemleri Lökosit alkalen fosfataz (LAP) PAS Peroksidaz Sudan-Black Esteraz Retikülin boyası Demir boyası HBD 0405

HBD 0405

İleri LaboratuvarYöntemleri Akım sitometri Konvansiyonel sitogenetik PCR Flouresan insitu hibridizasyon Kimerizm analizi HLA Doku tiplendirilmesi HBD 0405

Moleküler Yöntemler HBD 0405

Sonuç Laboratuvar yöntemlerin başvurmadan önce; Ön tanı nedir? Ne bekliyorum? Sonuç N üstü veya altı gelirse planım var mı? Tedavi yöntemimi değiştirecek mi? Doğru yöntem ve doğru zamanlama, uygun kan alma ve yollama Laboratuvar hatası var mı? HBD 0405

İlginiz için teşekkür ederim, laboratuvarda görüşmek üzere. Dr. M. Arat arat@medicine.ankara.edu.tr