ELEKTROFOREZ

Karışımda bulunan maddelerin tümü veya bazıları iyonlaşabiliyorsa, karışım bir elektrik alana konmak suretiyle bir dereceye kadar ayrılabilir. Bilindiği gibi bir elektrik alanda iyonlar hareket ederler. Bu hareketin hızı iyonun cinsine, yüküne, alanın şiddetine bağlıdır. Bu metot “elektroforez” olarak nitelendirilir ki elektrolizin tamamlanmamış şeklidir. Çünkü elektroforezde maddeler elektrolizde olduğu gibi, kendilerini çeken elektroda kadar gidemeyip yolları üzerindeki bir noktada durdurulmaktadır.

İyonik bileşiklerin iyonlaşması, elektroforezin temelini oluşturur İyonik bileşiklerin iyonlaşması, elektroforezin temelini oluşturur. Zıt yükteki elektrodlara doğru, farklı hızlarda hareket eden değişik yükteki iyonlar elektriksel alanda birbirinden ayrılırlar. Yüksüz, kovalans moleküller elektriksel alandan etkilenmezler, elektroforetik hareket göstermezler.

Elektroforezde Etki Eden Faktörler İncelenen örneğin özelliği (yükü, boyutu, şekli) Elektrik alanının etkisi (voltaj, akım, direnç) Tamponunun etkisi (bileşim, konsantrasyon, pH) Destek ortamın etkisi (Adsorbsiyon, elektro-osmoz, moleküler ayırma)

Genel Teknikler Alet ve ekipmanlar Genel olarak gerekli ekipmanlar güç ve elektroforez ünitesinden oluşmaktadır. Güç ünitesi sabit doğru akım sağlamalı voltaj ve akım çıkışının her ikisinide kontrol edebilmelidir. Düşük voltaj elektroforezi için ya sabit voltaj yada sabit akım sağlayabilen 0-500 V ve 0-150 mA çıkışa sahip güç üniteleri kullanılabilir.

Elektroforez ünitesi elektrotları, tampon rezervuarlarını, elektroforez ortamı için bir destek ve şaffaf güvenlik kapağını içerir. Elektrotlar paslanmaz çelikten olabilir. Ancak bunlar bazı tamponlar tarafından korozyona uğratıldıklarından platin elektrotlar tercih edilmektedir.

Destek ortamının seçimi: Molekülleri boyutlarına göre de ayırabildiğinde daha iyi bir elektroforetik ayrım sağlar. Kağıt, selüloz asetat, ince tabaka ortamı,blok ortamı, jeller (nişasta, agar jeli, poliakrilamid jeli) kullanılan destek ortamlarıdır. En çok kullanılan ortam olan jellerden kısaca bahsedersek:

Nişasta jeli: kısmi hidrolize olmuş nişasta karışımının uygun bir tampon içerisinde ısıtılması ve ardından soğutulması ile hazırlanır. Bu işlem nişastanın amilopektin bileşeninin dallanmış zincirinin birbirine bağlanmasına ve yarı sert bir jel oluşturmasına neden olur. Jeller kullanılmadan önce 0-4 °C’de saklanırlar.

Agar Jeli:Agar ucuz toksik olmayan abcak kimyasal olarak iyi tanımlanmamış toz karışımı agaroz ve amilopektin olmak üzere iki galaktoz esaslı polimerdir.Agaroz 38 C dejel oluşturur. Tamponda %1 (w/v) agar bulunması durumunda iyi bir fiber yapı büyük gözenek boyutları ve düşük sürtünme kuvveti gösterir. Sonuçta elektroforez sırasında iyonların çok hızlı hareket etmesini sağlarlar. Bu yüzden makro moleküllerin ayrımını kolaylaştırmaktadırlar.

Poliakrilamid jeli:Bu jeller kullanımdan hemen önce çok toksik sentetik kimyasallarla hazırlanmaktadır. Akrilamid monomeri bir cross linking ajan ile çoğunlukla N’N’ methylenebisacrylamide, bir katalizör varlığında kopolimerize edilir. Katalizör olarak taze hazırlanmış amonyum persülfat başaltıcı olarak yaklaşık aynı konsantrasyonda dimetilaminopropionitril veya N’N’N’N’ tetrametilen diamin (TEMED) kullanılır. En çok TEMED kullanılır ve bunun oranındaki artış jelin polimerizasyon hızını artırmaktadır.Deterjanlar, substratlar, enzimler gibi diğer kimyasal maddeler de jel oluşturmak için kullanılan tampona ilave edilebilirler. Ayrıca jelin gözenekliliği akrilamid monomerinin cross linking ajana oranıyla belirlenir.

Jel, hem toplam akrilamid monomerin ve bis’in yüzdesi (T) ve hem de cross linking ajanın toplam akrilamid içindeki yüzdesi (C) olarak ifade edilebilir. % T=(a+b)/m*100 % C=b/(a+b)*100 a: akrilamid (g) b: cross linking ajan (g) m:tampon hacmi (cm3)

T değeri % 3 ve 30 arasında değişen jeller hazırlanabilir T değeri % 3 ve 30 arasında değişen jeller hazırlanabilir.Bu T değerlerine karşılık gelen gözenek boyutları ise sırasıyla 0.2 ve 0.5 nm dir. Genel olarak % 30 T içerikli jel molekül ağırlığı 104 dalton civarında olan bileşiklerin ayrımı için uygun iken, % 3 T içerikli jel molekül ağırlığı 106 dalton civarında olan bileşikleri ayırmak için uygun olmaktadır. T (%) Optimum Molekül Ağırlığı (dalton) 3-5 100 000 üzeri 5-12 20 000-150 000 10-15 10 000-80 000 15- 15 000 altı

Poliakrilamid jel elektroforezi gerçekte özellikle proteinlerin molekül ağırlıklarının belirlenmesinde önemli bir tekniktir. Makromoleküller ilk olarak yük kütle oranını sağlamak için değişik maddelerle muamele edilirler. Bundan sonra jelde gerçekleşen ayırma işlemi sadece molekül ağırlığı doğrultusunda gerçekleşir. Bu olay proteinlerin alt ünitelere ayrılmasına neden olan üre, disülfit bağlarını kıran 2- merkapta etanol ve çözünürlülüğe yardımcı olan ve daha önemlisi polipeptit zinciri boyunca düzenli aralıklarla bulunan iyonik gruplara bağlanan deterjan karışımı ile proteinlerin muamele edilmesiyle gerçekleştirilir. Denatürasyonun önemli olmadığı durumlarda kuvvetli iyonik deterjanlar örneğin sodyum dodesil sülfat (SDS) kullanılır.

Proteinlerin molekül ağırlığının belirlenmesinde kullanılan bu metot eğer bir karışım üzerinde çalışılacak ise her bir proteinin alt ünite yapısının ve migrasyon karakteristiklerinin önceden bilinmesi gerekmektedir. Karışımdaki her bir protein standart olarak sağlanmalı ve test karışımı belirli şartlar altında bireysel olarak ayrılmalıdır. Bu en iyi şekilde plaka jeli kullanılarak gerçekleştirilir.

Elektroforez Teknikleri Elektroforez işleminin gerçekleştirildiği ortama, kullanılan tampona, uygulanış şekline kullanılan voltaja boyuta göre sınıflandırabiliriz. Ancak bunları birbirlerinden kesin sınırlarla ayırmak mümkün değildir.

En yaygın olarak kullanılanlar: 1.Basit elektroforez 2.Üre jeli elektroforezi 3.SDS jeli elektroforezi 4.Gradient Jel elektroforezi 5.Sürekli olmayan elektroforez sistemi 6.Yüksek voltaj elektroforezi 7.İsoelektrik fokusing elektroforezi 8.İsotakoforez 9.İki boyutlu elektroforez 10.Afinite elektroforezi 11.İmmuno-elektroforezi a. klasik b. roket c. ikiyönlü

Basit Elektroforez: Ayrılacak örneğin stabil ve doğal formda bulunduğu pH değerine sahip olan tampon kullanılır.Burada proteinlerin yük ve boyut özelliklerinin her ikisinden de yararlanılmaktadır. Kullanılan tamponun pH’sı proteinlerin büyük bir kısmının negatif yüklü olduğu ve bundan dolayı da anoda hareket ettiği hafif alkali olan 8-9 değeri arasındadır.

Üre Jeli Elektroforezi Düşük iyonik güçte çözünmez durumda olan proteinler için yararlıdır. Bu nedenle 6-8 M üre konsantrasyonunda proteinler denatüre edilerek elektroforez gerçekleştirilir. Genellikle polipeptit zincirleri arasında disülfit bağı oluşumunu önlemek için bir miktar merkaptaetanol ilave edilir.

SDS(sodyum dodesil sülfat) jeli elektroforezi: Düşük iyonik güçte çözünmez durumda olan proteinler için kullanılabilir. Günümüzde bütün protein tipleri için en yaygın şekilde kullanılan yöntemdir. Bu yöntem proteinlerin sodyum dodesil sülfat deterjanı ile denatürasyonunu içermektedir. Bu yöntem sadece relatif mobilitelere göre değil ayrıca molekül boyutlarına görede ayrım gerçekleştirdiği için çok yaygın kullanım alanı bulmuştur.

Dodesil sülfat proteinlere kuvvetli bir şekilde bağlanır. % 0 Dodesil sülfat proteinlere kuvvetli bir şekilde bağlanır.% 0.1 dodesil sülfat konsantrasyonu polipeptit zincirini doyurmak için yeterlidir. Uygun şartlarda bu teknikle molekül ağırlıkları % 1 oranında farklılıkları tespit edilebilir. Gradient Jeller SDS metodu gibi molekülleri sadece boyutlarına göre ayırır. Burada poliakrilamid jelin konsantrasyonu üste % 3 ve altta ise % 30’a kadar değişir. Yüksek pH’ya sahip bir tampon kullanılarak proteinlerin büyük bir kısmının anoda doğru hareket etmeleri sağlanır. Bu sırada büyük moleküller neredeyse başlangıç noktasında, küçük moleküller ise % 25 akrilamid konsantrasyonuna kadar hareket ederler. Akım sistemde artık hareketin görülmediği ana kadar uygulanır.

Sürekli olmayan (disk) elektroforez : Disk elektroforez deyimi, örnek iyonlarının küçük gözenek boyutlu akrilamid jele gelmeden önce büyük gözenek boyutlu ve farklı pH’da tamponlanmış jelde çok ince keskin bantlar halinde konsantre olmasından kaynaklanır. Ayırma jeli için monomerler ve katalizörler önce tampon içerisinde karıştırılır. Karışım vakum altında bekletilerek gazı alınır. Ve silindirik tüplere doldurulur. Polimerizasyon işleminden önce karışımın üzeri tampon veya destile su ile şırınga veya kapiler tüp kullanılarak dikkatlice kaplanır. Böylece jelin üst yüzeyi düzgün bir durum alır. Polimerizasyon tamamlandıktan sonra üst tabakaboşaltılır ve stacking jel ayırma jelinin üzerine boşaltılır.

Tüpler alt rezervuardaki tampon içerisine dalmış durumda iken üst jel ile aynı pH’daki ya büyük gözenekli örnek jelinde ya da daha yaygın olarak yoğun sakkaroz çözeltisi içerisinde bulunan örnek jele yüklenir. Daha sonra örnek tampon ile kaplanır. Elektroforez sabit akım altında gerçekleştirilir.

Yüksek Voltaj elektroforezi: Düşük moleküler ağırlıklı bileşikler düşük voltaj kağıt elektroforezi ile ayrıldığında önemli diffizyon meydana gelir. Daha iyi ve hızlı bir ayrım (10-60 dak) büyük ölçüde daha yüksek voltaj kullanılarak sağlanabilir. 10000 Volt ve 500 mA’e kadar güç ve 200 V/cm potansiyel gradienti oluşturabilen yüksek voltaj üniteleri temin edilebilmektedir. Ancak yüksek voltaj ünitesi o kadar yüksek ısı üretir ki direk soğutma sistemi gerektirmektedir.

İsoelektrik Fokusing: pH aralığı örneğin isoelektrik noktasına göre seçilir. İsoelektrik noktasının altındaki bir pH bölgesinde bulunan maddeler pozitif yüklenecek ve katota doğru hareket edecekler, bu yöndeki hareketleri devam ederken isoelektrik noktaya ulaşacaktır. Sonuçta anfoterik maddeler dar bantlar halinde sabitleşecektir. Ayrım dikey tüpler veya yatay plaka jellerde gerçekleştirilebilir. Kullanılacak jelin mümkün olduğu kadar az sürtünme direnci oluşturması gerekir.

Eğer ayrılacak proteinlerin tamamı küçük ise % 5-6’lık poliakrilamid gel uygun olabilir. Aksi takdirde % 2 (w/v) agaroz jeli çok daha uygundur. İsotakoforez:Bir pH gradientinde gerçekleştirilirken her bir komponentin yerleştiği noktalarda farklı elektrik alanı uygulanır. Böylece bütün bileşenler aynı hızda ama farklı mobilitede hareket ederler. İnorganik iyonlarda dahil olmak üzere bütün yüklü maddeler isotachoforez ile ayrılabilirler.

İki Boyutlu Elektroforez Bu jel analiz tekniği geniş kullanım alanı bulmaya başlayan bir tekniktir. Elektro-focusing gibi bir prosedür ile hazırlanmış protein bantlarını içeren örnek çubukları jelin bir ucundan uygulanır ve SDS içeren jel içerisinde ayrım ilk boyutta uygulanan isoelektrik noktaya ve ikinci boyutta ise moleküler ağırlığa bağlı olarak gerçekleşir.

Afinite Elektroforezi: Proteinler immobilize ligant içeren jel üzerinde elektroforeze tabi tutulurlar. İmmuno-elektroforez: Bu teknikte antikorları içeren jel üzerinde antijenlerin elektroforetik migrasyonu ile gerçekleştirilir. Burada kullanılan tamponlar ve pH değerleri genellikle öyle seçilirki sadece antijen migre olurken, antikorlar ya hiç yada çok yavaş migre olurlar. Bu nedenlede elektroforez işlemi boyunca tüm jel yüzeyinde dağılmış olarak bulunurlar. Bu teknikte daha çok agaros jeli kullanılmaktadır.