Klinik Mikrobiyoloji Temel Bilgiler ve Uygulamalar T.C. SAĞLIK BAKANLIĞI Enfeksiyon Kontrol Hemşireliği Eğitimi Klinik Mikrobiyoloji Temel Bilgiler ve Uygulamalar Sunumu Hazırlayan Doç. Dr. Sayın Işkın Pınar Zarakolu’ya teşekkür ederiz Hacettepe ÜTF İnfeksiyon Hastalıkları Ünitesi

Enfeksiyon etkenlerinin sınıflandırılması Asellüler Prionlar Viroidler Viruslar Çok hücreliler Mantarlar Helmintler Artropotlar Tek hücreliler Prokaryotikler Bakteriler Klamidyalar Mikoplazmalar Riketsiyalar Ökaryotikler Mantarlar Protozoonlar

Bakteriler Büyüklüğü 0.5-100 mm arasındadır. Kok, basil ya da sarmal yapısında olabilir. Yapısında çekirdek, sitoplazma, hücre zarı, hücre duvarı, kapsül, kirpik, fimbriya/pili, spor yapılarını içerir. Hücre duvar yapısı Gram boyanma özelliğinden sorumludur. Gram pozitif hücre duvarı daha kalındır.yapısında teikoik asit bulundurur.

Bakteri hücre duvar yapısı

Bakteri (Gram-pozitifler) Koklar Staphylococcus Streptococcus Peptostreptococcus Enterococcus Lactococcus Basiller Bacillus Clostridium Lactobacillus Actinomyces Nocardia Rhodococcus Mycobacterium Corynebacterium

Bakteri (Gram-negatifler) Koklar Neisseria Moraxella Basiller Escherichia, Citrobacter Salmonella, Shigella Klebsiella, Enterobacter Proteus, Providencia Aeromonas, Pseudomonas Acinotobacter (Değişken) Stenotrophomonas Brucella Legionella Vibrio

Viruslar DNA ya da RNA içerirler. Nükleik asit protein bir kılıf ile çevrilidir. Bazı viruslar zarfa da sahiptir. Zarf lipid tabakası ve virusa özgü proteinlerden oluşur. Canlı hücrelerde çoğalabilirler. Replikasyon yoluyla çoğalırlar. Antibiyotiklere duyarlı değildirler. Interferona duyarlıdırlar.

Mikrobiyolojide laboratuvar yöntemleri Mikroskopik inceleme Kültür Antijen saptanması Antikor veya hücresel immün yanıtın saptanması Moleküler yöntemler

Mikroskopi Işık mikroskobu Direkt mikroskopi Gram boyası Metilen mavisi Ziehl-Neelsen asit fast boya Floresan mikroskobu Karanlık saha mikroskobu

Dışkı-direkt mikroskopi Giardia intestinalis trofozoid ve kistleri

BOS-çini mürekkebi ile mikroskopi Cryptococcus neoformans

Kültürden Gram boyama Gram negatif basil

Tomurcuklanan maya hücreleri Kültürden Gram boyama Tomurcuklanan maya hücreleri

Hücre içi gram pozitif kok Püy-Gram boyama Hücre içi gram pozitif kok

Vücudun normal floraları

Vücudun normal mikrobiyal florası Sağlıklı kişilerin cilt ve mukozalarında yerleşen mikroorganizmalar topluluğu 'normal mikrobiyal flora' olarak isimlendirilir. Flora kalıcı ya da geçici olabilir. Kalıcı flora belli bölgede, belirli yaşta genellikle değişmeyen, çeşitli etkilerle ortadan kalksa bile yeniden oluşabilen mikroorganizmalar topluluğudur.

Vücudun normal mikrobiyal florası Geçici flora belli bölgede çoğunlukla hastalık etkeni olmaksızın birkaç saat ya da gün yerleşen mikroorganizmalar topluluğudur. İnsan vücudunda florası olan bölgeler ağız, orofarenks, nazofarenks, mide, ince ve kalın bağırsaklar, cilt, anterior üretra, vajen, dış kulak yolu ve gözdür.

Cilt normal florası Koagulaz negatif stafilokoklar (KNS) Staphylococcus aureus (az sayıda) Micrococcus Patojen olmayan Neisseria türleri Alfa-hemolitik ve non-hemolitik streptokoklar Propionibacterium türleri Peptococcus türleri Diğerleri (az sayıda olmak üzere Candida türleri, Acinetobacter türleri)

Normal floralar Dış kulak yolu Koagulaz negatif stafilokoklar Enterik bakteriler Göz Koagulaz negatif stafilokoklar Haemophilus türleri

Ağız, nazofarenks, orofarenks normal florası Difteroidler Patojen olmayan Neisseria türleri Alfa-hemolitik ve non-hemolitik streptokoklar Anaeroblar (Bacteriodes türleri, anaerop koklar, Fusobacterium türleri) Mayalar Haemophilus türleri Pnömokoklar S.aureus Gram negatif çomaklar Neisseria meningitidis

Barsak normal florası Enterik bakteriler (Salmonella, Shigella, Yersinia, Vibrio ve Campylobacter hariç) Non-fermenter gram negatif çomaklar Enterokoklar S.epidermidis Alfa-hemolitik ve non-hemolitik streptokoklar Anaeroblar (çok sayıda) S.aureus (az sayıda) Mayalar (az sayıda)

Genital bölge (Anterior üretra ve vajen)normal florası Enterik bakteriler (az sayıda) S.epidermidis (az sayıda) Candida albicans ve diğer mayalar (az sayıda) Anaeroblar (predominant olduğunda önemlidir) Mycoplasma Ureaplasma Corynebacterium türleri Lactobacillus türleri Patojen olmayan Neisseria türleri Alfa-hemolitik ve non-hemolitik streptokoklar Enterokoklar (az sayıda)

Örnek alımı

Dikkat edilmesi gereken hususlar-1 Hastalık etkeni bakterinin izole edilebilmesi için uygun şekilde örnek alınması, taşınması ve uygun besiyerlerine ekim yapılması önemlidir. Steril bölgelerden alınan örnekler, etken olma olasılığı olan bir bakterinin üretilmesini sağlamak amacıyla zengin nitelikte besiyerlerine ekilir. Normalde bir florası bulunan bölgelerden alınan örnekler zengin besiyerlerinin yanı sıra seçici (selektif) ve ayırt edici (diferansiyel) nitelikte besiyerlerine ekilir.

Dikkat edilmesi gereken hususlar-2 Örnek antimikrobiyal tedavinin başlanmasından önce alınmalıdır. Laboratuvara bu konuda bilgi verilmelidir. Örnek, patojen mikroorganizmanın bulunma olasılığı en yüksek olan yerden alınmalıdır. Belli bir yerde bulunma olasılığının en yüksek olduğu zaman örnek alınmalıdır. Kan kültürü alınacağı zaman cilt %70’lik alkolle silinip, kuruması beklenmeli ve ardından %2’lik iyot solüsyonu ile temizlenlenmelidir.

Dikkat edilmesi gereken hususlar-3 Üretilen mikroorganizmanın belli miktar örnekteki sayısının saptanması önemlidir. Örn: idrar kültürlerinde belli bir koloni sayısının üstü anlamlı kabul edilir. Florası olan örneklerde etken olma olasılığı olan bakterinin miktarının belirtilmesi önemlidir. Örn: balgam ve BAL örneklerinde üreyen mikroroganizmanın koloni sayısının belirtilmesi gereklidir. Örneklerin laboratuvara en kısa zamanda ulaştırılması önemlidir. İdrar, dışkı ve balgam birkaç saat buzdolabında bekleyebilir, BOS bekleyecek ise 37˚C’de bekletilmelidir.

Dikkat edilmesi gereken hususlar-4 Normalde steril olan, vücudun kapalı derin bölgeleri (kan, plevral, perikardiyal, peritoneal sıvı, eklem sıvısı, transtrakeal aspirat, derin yaralar veya kapalı alanların açık cerrahisi sırasında alınan örneklerin anaerob koşullarda da kültürleri yapılmalıdır. Vücut yüzeyinden, yani deri, ağız, burun, boğaz, üretra ve vajinadan alınan örneklerin veya normal flora ile kolayca kontamine olabilen (idrar, balgam gibi) örneklerin anaerob koşullarda kültürünün yapılmasına gerek yoktur.

Dikkat edilmesi gereken hususlar-5 Anaerob koşullarda kültürü yapılacak örneğin toplanması ve taşınmasında özel teknikler kullanılır. Anerob ekim için en iyi örnek aspirasyon örneğidir. Enjektör ile alındığında iğnedeki bütün hava çıkarılmalıdır. Örneğin eküvyonla alınması anaerob ekimler için uygun değildir.

Kan kültürü-1 Kan kültürleri antimikrobiyal tedavi başlanmadan önce alınmalıdır. Kan kültürü sonuçlarının yalancı pozitif çıkmasını engelleyecek koşullara uyulmalıdır. Örneğin alınacağı bölgenin seçimi, aseptik tekniğe uyulması, yeterli miktarda kan örneği alınması ve yeterli sayıda kültür yollanması. Bakteremi ya da fungemiye neden olan etkenlerin saptanması için birer saat arayla alınan 2 veya 3 kültür yeterli olmaktadır. 24 saat içinde 2’den fazla kan kültürüne gerek yoktur.

Kan kültürü-2 Kan örneğini alacak olan sağlık personeli eldiven kullanmalıdır. Santral venöz kateterden kan örneği alındığında, periferden alınan bir kan örneği de ayrıca gereklidir. Erişkinde kan örneği en az 10 ml olmalıdır. Kültür şişesinde kan/sıvı besiyeri oranının 1/5 veya 1/10 olması optimal orandır.

Kan kültürü-3 Çocuklarda 1-5 ml.’lik kan örneği kültür için yeterlidir. Yenidoğanda sepsis tanısı koymak için genellikle iki kan kültürü yeterli olmaktadır. Kan kültüründe 4 günden itibaren üremeler beklenir. Bartonella, Legionella, Brucella, bazı mantarlar ve HACEK grubu bakteriler için bu süre daha uzun olabilir. Mikobakteriler için 4 hafta süre gerekir.

Kan kültürü-4 Kan kültürü sonuçlarının değerlendirilmesinde S.aureus, S.pneumoniae, E.coli ve diğer Enterobacteriaceae, P.aeruginosa, C.albicans hemen her zaman (>%90) doğru infeksiyonu gösterir. Corynebacterium türleri ve Propionibacterium acnes nadiren (<%5) etkendir. Enterokok %78, Streptococcus viridans %38, KNS %15 doğrulukta etken kabul edilebilir.

Kan kültürü-5 Birkaç kültürün sadece bir tanesinde Bacillus, Corynebacterium spp., Propionibacterium acnes ve koagulaz negatif stafilokok ürediğinde; alınan birkaç kültürün bir tanesinde polimikrobiyal üreme olduğunda ya da klinik bulgular sepsisle uyumlu olmadığında üreyen bakterinin kontaminant olduğu düşünülmelidir.

Beyin omurilik sıvısı-1 Hücre sayımı, kimyasal inceleme için steril bir tüpe, kültür için ayrı bir tüpe örnek alınır. Çok kısa zamanda laboratuvara ulaştırılıp kültür yapılmalıdır. İdeali yatak başı ekim yapılmasıdır. BOS’un boyalı yayma örneğinin incelemesi hızlı bir yöntem olmakla birlikte kültüre göre duyarlılığı düşüktür.

Beyin omurilik sıvısı-2 Lateks aglütinasyon yöntemi BOS örneğinde Cryptoccoccus neoformans veya idrar ve BOS örneklerinde Histoplasma capsulatum aramak açısından oldukça yararlıdır. Pnömokok, meningokok veya H.influenzae aramak açısından yeterli olmayabilir.

Beyin omurilik sıvısı-3 Bakteriyel menenjitin laboratuvar tanısında BOS’un Gram boyalı preparatının değerlendirilmesi, BOS ve kan kültürleri rutin olarak yapılmalıdır. Antibiyotik kullanımı öyküsü yoksa Gram boyamanın duyarlılığı %75-90’dır, eğer antibiyotik kullanan bir hasta ise duyarlılık %40-60’a düşmektedir.

Beyin omurilik sıvısı-4 Tüberkuloz menenjiti durumunda asit-fast boyama, kültür ve PCR yöntemleri rutinde kullanılır. Asit-fast boyama sonucu (+) olan bir preparatın özgüllüğü çok yüksektir, ancak duyarlılık %10 civarındadır. Kültür süresini 3 haftadan daha kısa sürelere düşüren yöntemler ticari olarak mevcuttur. PCR yönteminin özgüllüğü yüksek (%100) iken duyarlılığı düşük (%48) kalmaktadır.

Beyin omurilik sıvısı-5 Viral ensefalitlerin tanısında moleküler yöntemler tercih edilmektedir. Ancak olguların ancak %30-70’ında özgül etken saptanabilmektedir. HIV (+) hastaların büyük çoğunluğunda nörolojik bulgular olmaksızın HIV DNA’sı mevcuttur. HSV ensefalitinde PCR yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahiptir. Fungal menenjit tanısında kullanılan BOS örneğinin miktarı fazla olmalıdır.

Boğaz kültürü Tükürük ve muköz zarların normal flora ile kontaminasyonunu önlemek için, dil basacağı yardımı ile dil aşağı bastırıldıktan sonra eküvyon ağıza sokulur. Tonsiller, farinks arka duvarı ve varsa püy odaklarına sürülür. Ağız içinde dil ve dudaklara değmeden çıkarılmalıdır. Ek bir istek olmadığı durumlarda sadece A grubu beta hemolitik streptokok için kültür yapılır.

Balgam örneği-1 Alt solunum yolu infeksiyonlarında patojen saptanmasında balgam kültürünün rolü tartışmalıdır. Özgüllüğü ve duyarlılığı çok düşüktür. Kültür sonuçları yorumlanırken balgamın mikroskopik incelemesinden elde edilen bulgular ve hastalığın klinik bulguları dikkate alınmalıdır.

Balgam örneği-2 Balgam örneği antimikrobiyal tedavi başlanmadan önce alınmalıdır. Steril bir cam veya plastik kap içerisine, mümkün olduğunca az tükürük içeren, pürülan ya da mukopürülan örnek ve mümkünse sabah kalkar kalkmaz alınmalıdır. Örnekten preparat hazırlanarak Gram boyası ile boyanır; epitel hücresi, beyaz küre ve mikroorganizma sayısı ve çeşidi yönünden değerlendirilir. Predominant olan bakteri morfolojisi vurgulanmalıdır.

Balgam örneği-3 Tüberküloz şüphesi durumunda Ziehl-Nielsen boyası ile preparat hazırlanır ve aside dirençli basil aranır. Özellikle Pneumocystis carinii, mikobakterial ve fungal izolasyonlar için %15 NaCl ve %10 gliserin içeren aerosol 10 dk süre ile solunduktan sonra derin bir öksürükle çıkarılan balgam örneği değerlendirilmelidir.

İdrar örneği-1 Örnek, temiz, orta akım idrarından alınmalıdır. Hasta kadın ise bir elle labiaları iki yana açar; erkek ise penis üzerindeki deriyi geriye doğru çekerek tutar. Diğer el ile temiz bir gazlı bez ve sabunla üretra ağzı önden arkaya doğru temizlenir. Sonra temiz bir gazlı bez ile sabun silinir. İdrarın ilk kısmı dışarı aktıktan sonra orta kısmı steril bir kapta toplanır, son kısmı ise yine dışarı atılır.

İdrar örneği-2 İdrar bakteri üremesi için çok elverişli bir ortamdır. Oda sıcaklığında bırakılacak olursa bakteriler hızla çoğalır. İdrardaki bakteri sayısı infeksiyonun tanımlanmasında önemli olduğundan örnek besiyerine hemen ve belli miktarda (0.01 µl standart öze ile) ekilmelidir. Örnek bekleyecekse buzdolabında bekletilmelidir.

Yara ve Deri/derialtı Abseler Deri yüzeyi %70 alkolle temizlenir. Örnek yara yüzeyine mümkün olduğunca az değerek, derinden aspirasyonla veya sağlam doku sınırına eküvyon sürülerek alınır. Örnek transport besiyerinde taşınmalıdır.

Dışkı örneği-1 Taze veya uygun koşullarda saklanmış örnekten kültür yapılması önem taşır. Kültür hemen yapılamayacaksa örnek mutlaka transport besiyerinde saklanmalıdır. Kültürün yanısıra dışkının mikroskopik incelemesi de çok önemlidir.

Dışkı örneği-2 İshalli hastaların dışkısında polimorfonükleer veya mononükleer lökositlerin bulunması tanı açısından önem taşır. Lökosit saptanan dışkı örneklerinin kültürü yapılmalıdır. Dışkı incelemesinin tam olması için bakteriyolojik incelemenin yanısıra parazitolojik inceleme de yapılmalıdır.

Örnek taşınması

Taşıma besiyerleri Örnek alındıktan sonra kültür hemen yapılamıyorsa taşıma besiyerleri kullanılır. Stuart veya Amies' besiyerleri uygun pH’ya sahip, kurumayı önleyen, bakterilerin toksik etkisinden korumayı sağlayan aerop, anerop tüm bakterilerin ve virüslerin canlı halde laboratuvara taşınmasını sağlayan besiyerleridir. Bunun dışında daha dar spektrumda amaca hizmet eden besiyerleri de vardır. Örn: Cary-Blair besiyeri özellikle dışkı örneklerinin taşınmasında kullanılır.

Besiyerleri

Besiyerleri %5 Kanlı agar Çikolata agar EMB/ MacConkey agar Brain Heart İnfüzyon agar Özel besiyerleri (ayırt ettirici ve seçici)

Ekimde kullanılan besiyerleri-1 Kan: Kan kültür şişelerine ekilir. Boğaz: Koyun kanlı agara ekilir. Normal atmosfer koşullarında 37C’de inkübe edilir. Balgam: Kanlı, çukulata ve EMB agara ekilir. Kanlı ve çukulata besiyerleri karbondioksitli ortam için mumlu kavanoza konularak 37C’de inkübe edilir. EMB normal atmosfer koşullarında 37C’de etüvde inkübe edilir. İdrar: EMB ve koyun kanlı agara 0.01 cc’lik standart öze ile ekim yapılır. Normal atmosfer koşullarında 37C’de inkübe edilir. Koloni sayısı 100 ile çarpılır.

Ekimde kullanılan besiyerleri-2 BOS: Koyun kanlı, çukulata ve EMB agara ekilir. Koyun kanlı ve çikolata agar mumlu kavanozda 37C’de inkübe edilir. EMB normal atmosfer koşullarında 37C’de inkübe edilir. Dışkı: EMB, SS ve koyun kanlı agara ekilir. Normal atmosfer koşullarında 37C’de inkübe edilir. Yara, deri/derialtı abseler: Kanlı, EMB agar ve anaerob bakteriler açısından tiyoglikolatlı sıvı besiyerine ekim yapılır. 37C’de inkübe edilir.

Mikroskopik değerlendirme

Balgam örneği-1 Toplumda kazanılan bakteriyel pnömonilerin en sık görülen etkenleri S. pneumoniae, H. influenzae, M. catarrhalis ve enterik gram negatif basillerdir. Bunların tanısında Gram boyama ile hazırlanmış balgam yaymasının direkt mikroskopik incelemesi, etkeninin belirlenmesi ve tedavinin erken dönemde planlanmasında büyük önem taşıyan basit, çabuk bir yöntemdir.

Balgam örneği-2 Pürulan balgam örneğinin Gram boyalı preparatında tek tip bakteri morfolojisinin predominansı ve polimorfonükleer lökosit (PNL) artışı tedaviye yön verir. Bol PNL görülen bir balgamda (100X büyütmede her sahada >25) belirli bir bakteri lehine artış hastalığın etkeni olduğunu düşündürmelidir. Örnekte fagosite edilmiş halde (hücre içi) bir bakterinin görülmesi de etken olduğunu düşündürmelidir.

İdrar örneği Mikroskopik incelemede gram (-) basil görülmesi üriner sistem infeksiyonunu düşündürür, ancak etkenin ne olduğunu tam olarak söylemez, bunun için etkenin kültürde üretilmesi gerekir. Çok sayıda yassı epitel hücrelerinin görülmesi özellikle kadınlarda vajinal flora ile kontaminasyonu düşündürür. Özellikle bağışıklık sistemi baskılanmış kişilerde veya bazı predispozan faktörlere bağlı olarak idrar mikroskopisinde lökositlerle birlikte veya lökosit saptanmaksızın hastalık etkeni olarak maya hücreleri ve psödohifleri görülebilir.

Dışkı örneği-1 Barsak duvarına invazyon gösteren bakteriyal infeksiyonlar (Enteroinvaziv E.coli, Shigella, Salmonella, Yersinia enterocolitica, Vibrio parahaemolyticus, Campylobacter jejuni) ve antibiyotik kullanımına bağlı gelişen enteritlerde dışkıda lökosit görülür. Etkenin parazit olduğu düşünülen diyarelerde dışkının parazit yumurtası, kist ve trofozoit yönünden incelenmesi gerekir.

Dışkı örneği-2 Viral gastroenteritlerde, enterotoksijenik bakteriyal diyarelerde (Enterotoksijenik E.coli, Vibrio cholerae, Bacillus cereus, enterotoksijenik Staphylococcus aureus, Clostridium botilinum ve Clostridium perfringens) ve paraziter diyarelerde ( Giardia intestinalis, Cryptosporidium) dışkıda lökosit yoktur. Lökosit ve eritrosit varlığı yönünden inceleme, antibiyotik tedavisinin gerekip gerekmediğine karar verme yönünden önem taşır. Bu arada mikst floranın varlığı da gözlenir.

Dışkı örneği-3 Boyalı preparatda florada gram (+) basillerin dominansı -antibiyotik kullanım öyküsü de varsa- Clostridium difficille’in florada hakim hale geldiğini düşündürebilir, ancak önemli olan toksin varlığının gösterilmesidir. Yine florada gram (+) küme yapan kokların varlığı –öykü ve klinik tablo uyumlu ise- S.aureus intoksikasyonunu düşündürebilir.

BOS örneği-1 İncelenen BOS miktarı 5-10 ml olmalıdır. Normalde 1 mm3 BOS’ta erişkinlerde 0-10, bebeklerde 0-20 hücre bulunur. Bunların hepsi mononükleer hücrelerdir. Menenjitlerde hücre sayısı artar. Hücre sayısının yanısıra hücre tipi de belirlenmelidir.

BOS örneği-2 BOS’un mikroskopik incelemesi sonucu antibiyotik tedavisi almış hastaların %60’ında, daha sonra kültürde üreme olan hastaların ise %80-90’ında etkenin görülmesi mümkün olmaktadır. Çini mürekkebi, Cryptococcus neoformans aranması için kullanılır.