Biyoteknoloji ve Genetik II GENOM PROJELERİ Prof. Dr. Hilâl Özdağ

Genom Projeleri Dizileme Klon kütüphaneleri Stratejiler Genom Dizilemesi Tekrar eden DNA dizileri Biraraya getirme (Assembly) PHRAP, PHRED,CONSED Bitiş Boşlukların kapatılması

Genetik harita Genetik haritaların bazı eksiklikleri vardır. Bunlardan en önemlisi çözünülürlük veya ayrıntıdır. İnsan genomu 3.2 milyar baz çifti içermektedir, yaklaşık 4000 cM uzunluğundadır, yani 850000bç/cM. Herbir sentimorganda bir belirteç bulunsa dahi (hayal bile olamaz) fiziksel haritaya göre çözünülürlüğü çok düşüktür.

Fiziksel harita

Genetik / Fiziksel

Fiziksel Harita

(Ureta-Vidal et al., Nature Review Genetics 2003)

DİZİLEME İlgilenilen DNA’nın altklonlanması Herbir klon Değişik “insert” boyutları Herbir klon Büyür, DNAsaflaştırılır Dizileme reaksiyonu yapılır Dizileme fragmentleri kapiller elektroforezle ayrıştırılıp lazer eksitasyonu ile tanımlanır. Reaksiyon başına 500-1000 bç okuma yapılabilir (bugünkü teknoloji ile)

DNA Dizi Analizi

Vektörler Plazmid (2kb) Kozmid (40kb) BAC (>= 100kb) YAC (1Mb)

Vektörler Çoklu klonlama bölgesi insert

Kavramlar Fiziksel harita Genetik harita Örtüşmeyen klonlar ((non)-overlapping clones) Genetik harita Moleküler belirteçler (marker)

Shotgun yaklaşımı Sanger et al., 1977 bacteriophage  genomuna uygulandı (1980) 1980’lerde:- plazmid, kloroplast, virusler, kozmidler 1990’larda:- mitokondri/BAC/bakteri Küçük prokaryotik genomlarda başarılı

Shotgun yaklaşımı Rasgele fragmentlerin dizilenmelerinin ardından yap boz misali biraraya getirilmeleri Bir genomdan örtüşen/kesişen birçok fragmentler toplamak gerekir. Bir genom 10x kez 500 bç’lik parçalar halinde okunduğunda 106 bç’de 1 boşluk olur.

Shotgun yaklaşımı L boyundaki bir DNA fragmenti: Bu fragmentin bir diğer kopyasını daha bulabilmemiz için genomun 4L bç olması gerekir. Rasgele diziler İki okumanın 30 bç kesişmesi Beklenen 430 >>>> 1.2X1018 bç. 3 milyarlık bir genomda bu kesişmeyi bulmak pek de kolay değil.

Shotgun yaklaşımı DNA tekrar yapıları içerir LINE segmental duplikasyon (Samonte and Eichler 2002)

Hiyerarşik Yaklaşım Klon-Klon Genom 1.5Mb fragment’lere ayrılır Fragmentler BAC ve YAC’lara klonlanır Insertler > 100kb ve tekrar bölgelerinden daha büyüktür. Bu şekilde klonlar örtüşen/kesişen fragmentlerin tanımlanması ile bir kontig haline getirilip dizilenir.

Hiyerarşik Yaklaşım Klon-Klon Klon kontiglerin biraraya getirilmesi Klon parmakizi yaklaşımı Klonlanmış DNA fragmentinin yapısına dair bilgi. Parmakizindeki örtüşmeler tanımlanabilir. Restriksiyon paternleri; Tekrar eden DNA parmakizleri; Tekrar eden DNA PCR; STS haritalama

Restriksiyon Haritası

Flow sorting: özgül kromozomlar

Klon-Klon Harita Temelli Yaklaşım

Watson ve Crick, Mayıs 1953

http://www.dnai.org/text/mediashowcase/index2.html?id=562