Eritrosit membranının permeabilitesi ve hemoliz Eritrositlerin ozmotik frajilitesinin ölçülmesi,kantitatif frajilite testi Serumun tampon gücünün test edilmesi
Hemoliz 2 şekilde oluşur 1) Hemositoliz 2) Osmotik Hemoliz Eritrositler içinde bulunan hemoglobinin eritrosit membranının parçalanması sonucunda plazmaya geçmesine hemoliz denir Eritrosit zarının yırtılması sonucunda, Hb molekülünün hücre dışına çıkmasıdır. Hemoliz 2 şekilde oluşur 1) Hemositoliz 2) Osmotik Hemoliz
hemoliz Ozmotik Hemoliz: Eritrositler hipotonik sıvıya konulduklarında içeri giren su dolayısıyla şişerler. Bu şişme sonucu hücre zarı üstünde oluşan yüksek basınç nedeniyle zarın yırtılmasına ve hemoglobin molekülünün dışarı çıkmasına yol açar. Hemositoliz (eritrosit membran harabiyeti): Bazı mekanik, fiziksel ve kimyasal etmenlerle zar yapısının bozulmasıyla görülen hemolizdir (Donma-çözünme, sıcaklık, akrep-yılan zehirleri, bazı bakteri toksinleri, eter, gliserin,asetik asit gibi maddeler bu tip hemolize neden olur). Hemoliz, izotonik ortamda eritrosit membranı haraplanmadan oluşabilir, üre gibi membrandan kolaylıkla geçen küçük moleküller hücre içinde ozmotik basıncı artırıp suyu hücre içine çekerek hücrenin şişip yırtılmasına neden olabilir.
Osmolarite-tonisite Osmolarite (Osm), çözeltinin (örn;plazma) bir litresindeki daha fazla disosiye olamayan parçacıkların toplam mol sayısıdır. Bir çözeltinin plazmaya göre osmolaritesini belirtmek için tonisite terimi kullanılır. İzotonik: Plazma ile aynı osmolariteye (300 mOsm = 0.3 Osm sahip çözeltiler (örn: %0.9 NaCl) Hipertonik: Plazmadan daha büyük osmolaritede Hipotonik: Plazmadan daha düşük osmolaritede
Hemolizin incelenmesi Gerekli eriyikler (her biri 0.3 Osm olmak üzere): NaCl (%0.9) Gliserin Üre Na asetat Asetik asit Eter (0.3 Osm %0.9 NaCl içinde) Saf su Pıhtılaşması önlenmiş kan (Sodyum Sitratlı –[Ca bağlar] kan
5 er ml + 2 şer damla pıhtılaşması önlenmiş kan Deneyin yapılışı 5 er ml + 2 şer damla pıhtılaşması önlenmiş kan Hemoliz var var var var var yok yok NaCl NaCl gliserin üre Na asetat Asetik asit Eter Saf su Hemoliz görülen tüplerde hemolizin nedenleri nedir?
Ozmotik frajilite Ozmotik frajilite Eritrositlerin hipotonik solüsyonlara direncini araştıran testtir. Eritrositlerin yüzey alanı- hacim ilişkisini değerlendirir. Yüzey alanının hacme oranı azalmışsa (sferosit) ozmotik frajilite artmıştır. Hipotonik solüsyonlara direnç azalmıştır. Heparinize kan ,azalan konsantrasyonlarda NaCl çözeltisine konarak oda ısısında bekletilir. Tüplerde gözlenen hemoliz , eritrositlerin hipotonik hasara hassasiyet derecesinin göstergesidir.
Normal eritrositler %0. 9 (izotonik), 0. 8, 0. 7, 0. 6, 0 Normal eritrositler %0.9 (izotonik), 0.8, 0.7, 0.6, 0.5 NaCl çözeltilerinde su alıp şişmelerine rağmen hemolize uğramazlar. Çünkü: zarları esnektir eritrositler sitoplazmik materyal miktarının hücre içi hacmine oranla düşük olması sebebiyle içi boş bir torba gibi davranabilirler. Çözeltinin konsantrasyonu %0.5 ten daha düşük olunca normal eritrositlerde de hemoliz görülmeye başlar. Bazı anemi tiplerinde eritrositler %0.7 lik tuz çözeltisinde bile hemolize uğrayabilirler (ör: Herediter sferositoz). Osmotik frajilite artmıştır. Hipokrom-mikrositer anemiler (Demir eksikliği, talassemi gibi) de ozmotik frajilite azalır.
Hemoliz nedeni olarak membran defekti (Herediter sferositoz) Eritrositlerin membran proteinlerinin defektleri sonucu, morfolojik olarak bikonkav ve santral solukluğu olan disk şeklinden, küre şeklini almaları ile hemolize eğilim artar Eritrositlerin kapillerlerden geçerken şekil değiştirebilme özelliğinin azalması sonucu dalakta daha kolay yakalanır ve yıkılırlar.
sferosit Normal Sferositler (okla gösterilenler) Küçüktür ve bikonkav yapısını yitirmiştir Ozmotik frajilite artmış, deformobilite azalmıştır sferosit Normal
Deneyin yapılışı Gerekli materyal %1 NaCl çözeltisi distile su, test tüpleri, heparinize kan, santrifüj Hb ölçüm cihazı
DENEYİN YAPILIŞI tüpler %1 NaCl (ml) saf su (ml) % NaCl % Hemoliz oranı 1 10 100 2 3 7 0.3 4 6 0.4 4.5 5.5 0.45 5 0.5 0.55 0.6 8 0.7 9 0.9 Her tüpe 2 damla kan eklenir Oda ısısında 30 dak. Bekletilir 1500 devirde 5 dak. Santrifüj de çevrilir. Hemolize uğramayan eritrositler dibe çöker. Üstteki sıvı hemoliz oranında renklenir.
9 8 7 6 5 4 3 2 1 %9 %7 %6 %5.5 %5 %4.5 %4 %3 %0
Maksimal ozmotik direnç; hemolizin tamamlandığı konsantrasyon Minimal ozmotik direnç; hemolizin başladığı konsantrasyon
Homeostasis: Vücut fonksiyonlarının normal sürdürülebilmesi için iç ortamın bazı parametreler açısından sabit ve dengede tutulması Vücutta sabit tutulan fizyolojik parametrelerin en önemlilerinden biri (H+) yoğunluğudur.
“Hayat aslında Hidrojene karşı bir mücadeledir” pH pH bir çözeltinin asit veya alkali derecesini tarif eden ölçü birimidir. Çözeltinin içindeki H iyonlarının yoğunluğuna göre ölçüm yapılır 0'dan 14'e kadar olan bir skalada ölçülür. Kanın pH’ı 7.4 tür ve bunun sabit tutulması şarttır. Çünkü; Protein moleküllerinin yapısı, Enzim aktiviteleri Eloktrolit dağılımı Membran geçirgenliği pH’a bağlıdır. Bu nedenle; H+ vücut sıvılarında sıkı bir şekilde regüle edilir. Bu regülasyona “asit-baz dengesi ” adı verilir. “Hayat aslında Hidrojene karşı bir mücadeledir”
- pH = 7.40 = ekstrasellüler sıvı için fizyolojik pH Plazmadaki H+ yoğunluğu çok düşüktür [0.00000004 Eq/L (0.00004 mEq/L; 4 x 10-8 Eq/L)] H+ konsantrasyonunu belirtirken karmaşık sayılar ile uğraşılmaması için pH ile ifade edilir pH, H+ iyon konsantrasyonunun negatif logaritmasıdır. pH= -log H pH = log 1/[H+] = - log [H+] = - log 0.00000004 Eq/L pH = 7.4 pH, logaritmik olarak ifade edilen tek fizyolojik parametre olup, değerindeki küçük değişiklikler bile, H+ yoğunluğunda önemli değişikliği ifade eder. Örn; pH değerinin bir 1 ünite düşmesi, H+ yoğunluğunda 10 kat artma demektir. pH= 7.0 iken H+ iyon konsantrasyonu 10-7 veya 1/107’dir. Bu durum; H+ ve OH- konsantrasyonları birbirine eşit olduğundan nötral pH’dır: - pH = 7.00 = nötral - pH > 7.00 = alkali - pH < 7.00 = asit - pH = 7.40 = ekstrasellüler sıvı için fizyolojik pH (sınırlar: 7.35-7.45)
pH logaritmik bir fonksiyon olması açısından, pH değerindeki bir birimlik değişim hidrojen iyon derişimindeki on katlık değişime karşılık gelir. Tabloda hem hidrojen hem de hidroksil iyonlarının konsantrasyonlarını farklı pH değerlerinde görebiliriz Asidite Alkali
Kardiyak kontraktilitede ASİDOZ- ALKALOZ Normal H konsantrasyonu 40nmol/L H+ 160 40 10 ASİDOZ ALKALOZ pH 6.8 7.4 8.0 Kardiyak kontraktilitede azalma Ölüm Tetani Aritmiler Ölüm
Hücresel metabolik olaylar sonucunda, vücutta sürekli olarak asit özellikte maddeler oluşmaktadır Metabolik işlevler sonucu sürekli H+ oluştuğu halde(>12500mEq), vücut sıvılarında pH 7.35-7.45 gibi çok dar sınırlar arasında tutulur.
HENDERSON-HASSELBACH DENKLEMİ pH nın diğer bir anlatım şekli olan Henderson-Hasselbach denkleminde bazın aside oranı temel alınır, bu oran daima 20 dir. Denklem:pH = pKa + log [baz]/[asit] HendersonHasselbalch eşitliği, bikarbonat tampon sistemi ile kan pH’sı arasındaki ilişkiyi verir CO2 + H2O -------- H2CO3 --------- H+ +HCO3 H x HCO3 K(iyonizasyon sabiti)= H2CO3(CO2) CO2 H=K HCO3 LogH=LogK+Log -LogH= -LogK +Log pH = pK + log [HCO-3] CO2 pH = 6.1+ log Baz Asid pH = 6.1 + log (24 mmol/L) / 0.03 (40 mmHg) pH = 6.1 + log 24 / 1.2 pH = 6.1 + log20 = 6.1 + 1.3 = 7.40
HCO - 3 pH =7.4 = 20 = H2CO3 baz : asit (20/1) oranı sabit tutulmaya çalışılır CO2 + H20 Û H2CO3 Û H+ + HCO3- DENGE : “20 HCO3-” karşılık ”1 CO2 (H2CO3)” vardır CO2 arttığında Þ asidoz HCO3- arttığında Þ alkaloz
pH nın sabit tutulması başlıca 3 mekanizma ile sağlanır 1-Kimyasal Tampon Sistemi (Saniyeler içerisinde etkisini gösterir) 2-Solunum sistemi; Akciğerler yoluyla CO2 atılımının kontrolu (Dakikalar içerisinde etkisini gösterir) 3-Üriner sistem; Böbrekler gerekirse geri emmek ve gerekirse salgılamak yoluyla H+ ve HCO3- iyonlarının kandaki konsantrasyonlarını düzenleme yeteneğine sahiptir (Saatler, günler içerisinde etkisini gösterir).
VÜCUTTAKİ TAMPON SİSTEMLERİ Yer Tampon sistemi Yorum Kan Bikarbonat Metabolik asitler için önemli Hemoglobin Plazma proteinleri Minor tampon Fosfatlar Konsantrasyonu çok düşük Hücre içi Proteinler Önemli tampon İdrar Titre edilebilen asitlerin çoğu için önemli Amonyak Önemli - NH4+ formasyonu Kemik Ca karbonat Uzun süreli metabolik asidoz In review Titratable acidity is an important part of excretion of fixed acids under normal circumstances but the amount of phosphate available cannot increase very much. Also as urine pH falls, the phosphate will be all in the dihyrogen form and buffering by phosphate will be at its maximum. A further fall in urine pH cannot increase titratable acidity (unless there are other anions such as keto-anions present in significant quantities) The above points mean that titratable acidity cannot increase very much (so cannot be important in acid-base regulation when the ability to increase or decrease renal H+ excretion is required) In acidosis, ammonium excretion fills the regulatory role because its excretion can increase very markedly as urine pH falls.
TAMPON SİSTEMLERİ Bulundukları ortama eklenen H+ veya OH- iyonlarının etkisini azaltarak, pH değişikliğini önlerler. Tampon sistemleri zayıf asit veya baz ile bunların tuzlarının kombinasyonundan oluşur. Bu tamponların etkinliği bulundukları ortamdaki konsantrasyonlarına bağlıdır. Vücudun tamponlama kapasitesinin % 53’ ünü bikarbonat, % 35’ini Hb, %12’sini de fosfatlar, plazma proteinleri ve amonyum oluşturur.
Bikarbonat-karbonik asit sistemi ekstrasellüler sıvıda en önemli tampon sistemidir Öğeleri karbonik asit ve bikarbonattır. Hem karbonik asit, hem de bikarbonat konsantrasyonları vücuttaki fizyolojik mekanizmalar tarafından ayrı ayrı düzenlendiğinden, tamponlama gücü çok yüksektir. HCO3- zayıf baz olarak etki eder (H tutan) H2CO3 zayıf asid olarak etki eder (H veren) vücut pH'ından iki madde sorumludur: HCO3- ve CO2(H2CO3) Birincisinden böbrekler, ikincisinden akciğerler sorumludur.
Tampon sistemi nasıl çalışır Zayıf asit ve baz çiftleri en iyi tamponlardır Bir tampon sistemi için eşitlik şudur; HA(zayıf asit) H+A(anyon) Bu sistemi içeren çözeltiye kuvvetli asit eklenirse denge sola kayar. H konsantrasyonu azalır, Baz eklenirse H ve OH tepkimeye girer. H2O oluşturur. Öte yandan HA ayrışarakda H nin çok düşmesini sınırlar Örnek; HCO3/H2CO3 tampon sistemi(kanın önemli tampon sistemi); H2CO3 H+HCO3 Asit fazla ise ; H+HCO3 H2CO3 CO2+H2O Baz fazla ise; OH+H2CO3 HCO3 +H2O Akciğerlerden böbrekten
Tampon sistemi nasıl çalışır Örnek; HCO3/H2CO3 tampon sistemi(kanın önemli tampon sistemi); H2CO3 H+HCO3 Asit fazla ise ; H+HCO3 H2CO3 CO2+H2O Baz fazla ise; OH+H2CO3 HCO3 +H2O Akciğerlerden böbrekten
Serumun tampon gücünün test edilmesi Gerekli malzeme; Ayıraçlar Fenolftalein (baz indikatörü): pH 8.3-10.2 arasında eflatun renk verir Metil oranj (asit indikatörü): metil oranj pH 3-4.4 arasında kırmızı renk verir İnsan serumu 0.1 N NaOH, 0.1 N HCl
Pıhtılaşmış kan
Deneyin yapılışı 0.1 NaOH kaç damlada eflatun? 0.1 NaOH kaç damlada eflatun? 0.1N HCl kaç damlada kırmızı? 0.1 NaOH kaç damlada eflatun? Fenol ftalein 5 damla Metil oranj 5 damla Fenol ftalein 5 damla Metil oranj 5 damla Serum 1 ml Serum 1 ml Saf su 10 ml Saf su 10ml Saf su 9ml Saf su 9ml İndikatörlerin renk değişikliği için gerekli damla sayısı Saf suya göre %10 serum içeren çözeltide serumun tampon gücünü açıklar