Uygulamalı Eğitim: PCR Kullanarak Patates Yıkama Suyu İçindeki Patojenlerin Tespiti

Yıkama suyu örneği alındı ve LB kültür ortamına aşılandı. Sonra, işlem ortamdaki izole edilmiş koloniler ile yapılacaktır.

1. DNA Çıkarımı

1.1. Pipet yardımıyla steril bir mikro tüp (P1) içine 50 µL saf su koyunuz. Çözeltinizin homojen olmasına dikkat ediniz! 1.3. Bakteri kolonisini mikro tüp (P1) içerisine aktarıp bir çözelti hazırlayınız Ölçümlenmiş 1 µL steril bir tutaç ile bakteri kolonisini alınız.

1.4. Mikro tüpünüzü (P1) 100°C’lik su banyosunda bir dakika bekletiniz Mikro tüpünüzü (P1) santrifüjün içerisine yerleştiriniz Santrifüjü 5 dakika boyunca 4500 rpm’de çalıştırınız Tüpü çıkarınız ve DNA içeren üstte kalan sıvıyı steril bir mikro tüp (P2) içine aktarınız.

2. PCR Karışımının (M) Hazırlanışı

2.1. Steril bir mikrotüpün içine :  90 µL saf su  50 µL tampon çözelti 10X  28 µL MgCl2 25mM  28 µL dNTP 0,2µM  4 µL Taq polimeraz enzimi koyunuz PCR işlemi aynı gün içinde gerçekleşmez ise tüpü dondurunuz Kullanım öncesinde eğer gerekliyse eritiniz ve sonra tekrar santrifüj ediniz. ! PCR karışımınız artık hazır !

3. DNA Çoğaltımı

3.1. Mikro tüpün (P2) içerisinden 10µL DNA çözeltisini pipet yardımıyla başka bir mikro tüpe (A) aktarınız µL PCR karışımı (M) ekleyiniz Her bir primerden (metkRPECTO ve metkFPECTO ya da 16SR ve 16SF) 10µL ekleyiniz. Pipet yardımıyla çözeltinizi karıştırınız! İki çeşit primer de aynı anda kullanılabilir fakat primerlerden 5μLeklemelisiniz.

3.4. Mikro tüpü (A) hızlıca santrifüj ediniz Mikro tüpü (A) PCR cihazına yerleştiriniz. Düzgün bir şekilde yerleştiriniz! T°C Nb cycles

’den 3.5.’e kadar olan adımları DNA çözeltisi (P2) yerine aşağıdaki çözeltileri yerleştirerek iki kontrol tüpü hazırlayınız:  Negatif kontrol (C-) için su  Pozitif kontrol (C+) için DNA çözeltisi Pectobacterium atrosepticum DNA Çoğaltımının Kontrolü

5`, 72 °C Tamamlama 30``, 94 ° Denaturasyon 40 döngü 5`, 96°C Denaturasyon 30``, 58°C Yeniden Birleşme 30``, 72 °C Uzatma 3.7. PCR cihazını ayarlayınız : 96°C, 5 dk 40 döngü : 94°C, 30s 58°C, 30s 72°C, 50s 72°C 5 dk 4°C’de bekleme 3.8. Çoğaltıma başlayınız. T°C Nb cycles

4.DNA Parçacıklarının Elektroforezi

μL PCR çözeltisini (A, C-, C +) üç mikro tüp içine (E1, E2, E3) yerleştiriniz μL tampon çözeltisini (X) ekleyiniz ve karıştırınız.

4.3. Elektrofaz jelini alınız ve koruyucu ambalajı çıkarınız Yükleme kuyularını suyla durulayınız. Artan suyu kenarlara çekip kurulayınız.

4.5. Kuyuyu, 5 µL E1 çözeltisiyle doldurunuz µL E2 ve E3 kontrol tüplerini diğer iki kuyuya sırasıyla yerleştiriniz Dördüncü kuyuyu 5µL moleküler marker (W) ile doldurunuz.

4.8. DNA parçacıklarını 220V’ta 10 dakika boyunca yürütünüz Moleküler marker jelin sonuna ulaştığı zaman yürütme işlemini durdurunuz.

5.Sonuçların Analizi