VİTRİFİKASYON EKSPLANT PLURİPOTENT TOTİPOTENT İN VİTRO İN VİVO DOKU KÜLTÜRÜ TANIM AKLİMATİZASYON-ADAPTASYON

Mikroçoğaltım-meristem kültürü Sürgün ucu kültürü KLONAL ÇOĞALTIM

SOMAKLONAL VARYASYON

SOMATİK EMBRİYOGENEZ

MUZ

Bitki embriyo gelişimi

HORMONLAR OKSİNLER: IAA-İNDOL ASETİK ASİT, NAA-NAFTALEN ASETİK ASİT, IBA- İNDOL BÜTİRİK ASİT, 2,4-D-2,4 DİKLOROFENOKSİ ASETİK ASİT SİTOKİNİNLER: K-KİNETİN, BA-BENZİL ADENİN, 6,BAP-BENZİL AMİNO PURİN. GİBERELLİNLER: GİBERELLİK ASİT (GA3) ABSİZİK ASİT ETİLEN

Floresan diasetat boyama

Ters mikroskop

BİRİMLER 1 mg= 1000 µg 1 gr= 1000 mg 1 kg= 1000 g 1 ml= 1000 µl= 1cc 1 lt= 1000 ml

BİRİMLER Bilimsel yayınlarda ortam bileşenleri ve hormonlar, mg/l, M (molar), mM (mili molar), veya µM olarak ifade edilir. 1 M KNO3= g KNO3/Litre 1 mM KNO3= mg KNO3 1 µM KNO3= µg KNO3

Bitki Doku Kültürlerinin Uygulama Alanları Bitki Islahı Alanları (Babaoğlu ve ark., 2001) Türler arası melezleme sonrası embriyo kültürü Haploid bitki üretimi (polen, anter ve ovul kültürleri) Somaklonal varyasyon İn vitro seleksiyon İn vitro dölleme İn vitro germplazm muhafazası Protoplast fuzyonu Gen transferi

Bitki Doku Kültürlerinin Uygulama Alanları Ticari Uygulamalar (Babaoğlu ve ark., 2001) Meristem kültürü (hastalıksız bitki üretimi) Mikroçoğaltım Sentetik tohum üretimi Sekonder metabolit üretimi Kimeralar

Sterilizasyon 1.Çalışma ortamının sterilizasyonu 2. Besin ortamı, alet ve ekipmanların sterilizasyonu 2.1. Filtre sterilizasyonu 2.2. Otoklav ve sıcak hava sterilizasyonu 3. Bitki materyallerinin yüzey sterilizasyonu Ticari sodyum hipoklorid, etanol (%70), sdH2O uygulaması, civa.

KALLUS KÜLTÜRLERİ

İnce çeperli parankima hücrelerinden meydana gelir. Kalluslar doğada yara dokusu üzerinde de gelişirler. Bu formda yara dokusunu kapatırlar. Farklı oksin ve sitokinin oranlarını içeren kültür ortamnlarında bitk türü ve eksplant kaynağına bağlı olarak kallus gelişimi gözlenebilir.

Yapraktan kallus oluşumu Vaskular dokudan kallus oluşumu Kökten kallus oluşumu Embiryodan kallus oluşumu

Kallus gelişim aşamaları İndüksiyon Hücre bölünmesi Farklılaşma

FriableSertYapışkanRhizogenik -- KırmızıBeyazYeşilSarı

Kalluslarda farklılaşma

Kallusu meydana getiren hücrelerde somaklonal varyasyon meydana gelebilir. Bu varyasyon iki şekilde olabilir. Epigenetik Genetik

Kallus kültürlerinin düzenli aralıklar ile, büyüme eğrisi doğrultusunda (3-6 hafta) alt kültüre alınması gereklidir. Uzun süreli alt kültüre almalar ile somaklonal varyasyon oranı artar.

ORGANOGENESİS ÇEŞİTLERİ İndirekt organogenesis Direkt organogenesis Kallus Sürgün veya kök Bitki Sürgün veya kök Bitki

Brokoli bitkisinde indirek somatik embriyo ve organogenesis (Qin ve ark., 2007)

Pinus spp’de indirek somatik embriyo oluşumu ve organogenesis

Somatik Embriyo Rejenerasyonu Direkt embriyogenesis Eksplant İndirekt embriyogenesis Eksplant Somatik embriyolar Bitki Kallus Pro-embriyolar Bipolar embriyolar Bitki

BİTKİ HÜCRE SÜSPANSİYON KÜLTÜRLERİ Terapötik proteinler modern tıpta önemli bir ilerlemedir ve diyabet, anemi, hepatit ve kanser gibi hastalıkların tedavisinde geniş kullanım alanına sahiptir yılı itibarı ile insan hastalıklarının tedavisinde 100 adet protein kullanımdadır, ve 370 adet protein ise test aşamasındadır. Bu proteinler aşılar, antibadiler, serum proteinleri (sitokinler, büyüme hormonları, interleukin, interferon) olarak gruplandırılabilir. Dünya çapında bu proteinlerin yıllık 90 milyar dolarlık bir satışı vardır, ve bu oranın 120 milyar dolara ulaşacağı tahmin edilmektedir. Bu proteinlerin ticari olarak üretimi bakteri ve memeli hücre sistemlerinin kullanımına dayalıdır. Bununla birlikte bu sistemler pahalıdır ve ürün miktarı düşüktür.

Bitkilerin kullanıldığı sistemler bakteri ve memeli hücre sistemlerine göre daha düşük maliyet ve yüksek güvenilirlik ile elde edilebilir. Hızlı büyüyen, kırılgan yapıda hücrelerin sıvı ortamda ve çalkalayıcılar üzerinde kültüre alınmasıdır. İn vitro seleksiyon, sekonder metabolit üretimi, somatik embriyo oluşumu, biyofarming amaçla kullanılabilir. Hücre büyüme ve bölünmesini etkileyen koşulların araştırılması ile temel çalışmalarda kullanılabilirler.

Kallus kültürlerini etkileyen pek çok faktör süspansiyon kültürlerini de etkiler. Dikotillerin süspansiyon kültürlerini kurmak monokotillerinkini kurmaktan daha kolaydır. KallusSüspansiyon kültürü Öncelikle in vitro kallus kültürlerinin kurulması gerekir. Bunun için üç farklı yol izlenebilir:

‘Friable’ kallus kullanımı (en sık kullanılan yöntem): Tekrarlı alt kültürleme ve filtrasyon sonucu, süspansiyon kültürü tek hücre ve küçük hücre kümelerine ayrılır. Uygun ‘friable’ kallus elde etmek için, besiyerindeki oksin:sitokinin dengesi oksin artırılarak değiştirilir. ‘Friable’ olmayan kallus kullanımı: Kalluslardan hücre kültürü kurulur. Kalluslar istenen hali alana kadar alt kültürlenir. Enzim kullanımı: Kallus, düşük konsantrasyonda hücre duvarı parçalayan enzimler (selülaz ve pektinaz) eklenmiş besiyerinde süspansiyon oluşuncaya kadar kültürlenir. Friable/gevşek

Uzun hücreAktif olarak bölünen hücreler Dev uzun hücre (G), Hücre süspansiyon kültürleri için tipik normal boyuttaki uzun hücreler ve yuvarlak hücreler Dev (G) hücre Küçük, yuvarlak ve canlı hücrelerden oluşan, üreme fazındaki tipik bir agregat Hücre Tipleri

Bitki hücrelerinin özellikleri Büyüklük (10-100mM) Agregat oluştururlar Yırtılmaya hassas Yavaş büyürler Kolay kontamine olurlar Az oksijen gereksinimleri vardır Anaerobik koşullara toleranslı değiller Büyümeleri iyi (>300g/l taze ağırlık). Viskoz solüsyonlar oluştururlar

Tipik hücre kültürünün üreme grafiği X = kültür için uygun altkültürleme zamanı

Dönen çalkalayıcı Çalkalayıcılar için cam kaplar Farklı tipte çalkalayıcılar Çalkalayıcılar için cam kaplar Çalkalayıcılar için cam kaplar Çalkalayıcılar için cam kaplar ‘Shaker’ (Çalkalayıcı) Kontrollü ‘chamber’ Bioreactor

Hücre süspansiyon kültürleri (Xu ve ark., 2011)

Bitki hücre süspansiyon kültürlerinin kullanımı (Xu ve ark., 2011)

Hücre süspansiyon kültürleri kullanılarak terapötik proteinlerin üretimi aşağıda belirtilen avantajlara sahiptir; 1.Bitki hücreleri hızlı bir hücre döngüsüne sahiptir (1 günde sayı iki katına çıkabilir). 2.Üretim biyoteaktörlerde yapıldığı için biyotik ve abiyotik faktörlerin hücre kültürleri üzerine etkisi yoktur. 3.Memeli hücre sistemlerinde, insanda virülent olan mikrobiyal kontaminasyon sorunu bitki hücre sistemlerinde mevcut değildir. 4.Genetik Modifiye Organizmaların yetiştiriciliğini sınırlandıran konular bitki hücre süspansiyon kültürlerinde problem değildir. 5.Protein izolasyon ve pürifikasyon işlemleri ucuzdur. 6.Bitki hücre süspansiyon kültürleri tam farklılaşma göstermez, plasmadesmata bulundurmaz, bu nedenle post transkripsiyonal gen sessizleştirme mekanizmaları aktif değildir.

SEKONDER METABOLİT ÜRETİMİ Canlılar yaşamını sürdürebilmek için bitkilere gereksinim duyarlar. Bitkiler canlılığın devamı için, karbonhidrat, protein ve yağlar gibi primer metabolitlerin kaynağıdır. Bunun yanında lastik, odun, selüloz ve zamk gibi maddeler de bitkilerden sağlanır. İlave olarak, ilaç sanayi, kimya, kozmetik ve zirai üretim de bitkisel kökenli ürünlere dayalı sektörlerdir, ve önemli ekonomik girdi sağlarlar. 1950’li yıllardan bu yana bitki hücreleri sekonder metabolit üretiminde kullanılmaktadır. Sekonder metabolitler bitkilerin savunma, ortama uyum, hayatta kalma ve nesillerini sürdürmeleri için gerekli olan karmaşık mekanizmalarda kullanılırlar. -Kuraklık, tuzluluk, UV ışınları gibi stres faktörlerine karşı koyma mekanizmaları, -Herbivorlara karşı (böcekler, sürüngenler) savunma -Mikroorganizmalara (virüs, bakteri, fungus) karşı savunma, -Ekolojik işlevler (polinasyon, tohum dağılımı, cezbediciler)

Şu anda bilinen doğal ürünün %80’i bitkisel kökenlidir. Sentetik kimyasalların kullanımındaki yaygınlığa rağmen farmasotik kimyasalların %25 kadarını bitkisel ürünler oluşturmaktadır.

Sekonder metabolitlerin önemi 1.İlaç olarak kullanılan sekonder metabolitler İlaç etkin maddesiBitkiTedavi işlevi AtropinAtropa belladonaAntikolinerjik DigoksinDigitalis lanataKardiatonik DigitoksinDigitalis purpureaKardiovasküler EmetinCephaelis sppAmipli dizanteri tedavisi EfedrinEphedra sinicaBronş açıcı FilokarpinPilocarpus jaborandiKolinerjik HiyosiyaminHyoscyamus nigerAntikolinerjik Kinin, KinidinCinchona ledgerianaSıtma tedavisi KodeinPapaver somniferumÖksürük kesici ReserpinRauwolfia serpentinaAntihipertensif Vinkristin, Vinblastin Catharanthus roseusKanser tedavisi

2. Besin katkı maddesi olarak kullanılan sekonder metabolitler Bitki primer metabolitlerinin yanı sıra tad ve koku verici maddeler besin endüstrisinde önemli bir yere sahiptir. Sentetik katkı maddeleri mutajenik ve karsinojenik etkiye sahip olabilirler. Bitkilerden elde edilen tatlandırıcılar, aromatik ve uçucu bileşikler besin endüstrisinde kullanılmaktadır. 3. Parfümeri ve ziari mücadelede kullanılan sekonder metabolitler ÜrünİşlevBitki Besin KininAcılaştırıcıCinhona ledgeriana LikopeinRenklendiriciLycopersicum esculentum VanillinKoku vericiVanilla plenifolia Parfüm ve kozmetik Yasemin yağıParfümJasminum spp Gül yağıParfümRosa spp LavantaParfümLavandula spp Zirai mücadele Piretrin, Sinerin, YasmolinİnsektisitChrysanthemum spp NikotinİnsektisitNicotiana spp Anakardik asitMolluskısitAnacardicum spp

Bitkisel kökenli kimyasalların sentetik olanlara göre bazı avantajları vardır. Sentetik ürün kullanımında ortaya çıkan yan etkiler, bozunma-parçalanma sürelerinin uzun olması, bozunma ürünlerinin çevre kirleticisi veya halk sağlığını tehdit etmesi gibi problemler doğal ürünlerde yoktur. 1970’li yılların başından itibaren bitki doku ve hücre kültürleri kullanılarak sekonder bileşiklerin üretimde hız kazanılmıştır. Bu gelişme nedenlerinden en önemlisi 2000’den fazla bitkise doku kültürü çalışmalarının yürütülmüş olmasıdır. Bitki hücre kültürlerinde üretilen doğal bileşiklere örnek olarak, alkoloidler, flavonoidler, taninler, terpenler, vitaminler, organik asitler, fenoller, lateks, kinonlar ve lignin verilebilir.

Sekonder metabolitleri doku kültürü ile üretmek avantajlıdır Doğadan Toplama  Az miktarlarda ve belli gelişim evrelerinde üretilirler, Bazı türlerin zamanla soylarının tükenmesi tehlikesi vardır, Bazı bitkilerin toplanması çok güçtür ve maliyeti yüksektir, Doku Kültürü İstenilen zamanda, istenilen kadar üretim Türlerin kaybolma tehlikesi yok Standart kalitede ve bol miktarda üretim İstenildiği kadar bitkinin elde edilme kolaylığı

Bitki doku ve hücre kültürü sistemleri ile sekonder metabolit üretimi amacı ile; 1.Farklılaşmış ve organize olmuş kültürler kullanılabilir (kök kültürleri, sürgün kültürleri, embriyo kültürleri) 2.Farklılaşmamış ve organize olmamış kültürler ile metabolit üretimi (kallus kültürleri) Ana bitkiden alınan ve in vitro kültürü yapılan dokularda farklılaşmanın ortadan kalkması metabolit kaybına neden olmaktadır. Özellikle hücre süspansiyon kültürlerinde bu problem ile karşılaşılmaktadır. Bu sorunun nedenleri ise; - Gen ekspresyonunun farklılaşmayan dokularda olmaması, -Sekonder metabolit üretimini sağlayan substratın farklı biyosentez mekanizmasına kayması, -Taşınma mekanizmasının engellenmesi, -Depo bölgelerinin olmaması, -Metabolit yıkımı.

Hücre süspansiyon kültürlerinde metabolit üretimini etkileyen faktörler; 1.Bitkisel koşullar (eksplant kaynağı) 2.Kimyasal kültür koşulları (C, N, P kaynakları, hormonlar, pH, ozmotik basınç) 3.Fiziksel kültür koşulları (ışık, sıcaklık, havlandırma, çalkalayıcı kullanımı) 4.Deneysel yaklaşımlar (öncüller ve elisitörler kullanımı, büyümenin baskılanması, eş zamanlı kültürler, iki aşamalı kültürler)

BİYODÖNÜŞÜM Biyodönüşüm bakteriler ve fubguslar gibi mikroorganizmalar tarafından uzun yıllardır bilinen işlemlerdir. Örneğin üzüm suyundan sirke ve alkol üretimini gerçekleştiren mayalar ve fermentasyon örnek olarak verilebilir. Dolayısı ile biyodönüşüm bir organizmanın kimyasal bileşikleri değiştirmesi olarak isimlendirilir. Eğer son ürün CO2, H2O ise bu durum mineralizasyon olarak isimlendirilir. Bir ilaç veya toksin de biyodönüşüme uğratılabilir. Bitki hücre kültürü ortamlarına ucuz bazı öncül maddelerin ilave edilmesi ile sekonder metabolit içeriği artırılabilir. Ayrıca bitki hücreleri bu öncül kimyasalları bitkide bulunmayan yeni kimyasal formlara dönüştürebilirler.

Bitki türüSubstratÜrünReference P. somniferumThebaineCodeineWilhelm and Zenk (1997) Di. purpureaDigitoxinDigoxinAlfermann et al. (1980) Di. lanataDigitoxinDigoxinAlfermann et al. (1980) Podo. hexandrumConiferinPodophyllotoxinVan Uden et al. (1995) Cath. roseusVindolineVincrisitneDiCosmo and Misawa (1995) Bitki hücre kültürleri ile farmasotik kimyasallara biyodönüşüm

Podophyllum hexandrum süspansiyon kültürleri verilebilir. Kültür ortamlarına Coniferin ilavesi ile podophyllotoxin üretir. Podophyllotoxin anti-kanser amaçlı kullanılır.

Bitki hücre kültürlerinde etkin biyo-dönüşümün gerçekleşmesi için; 1.Dönüşümü sağlayacak substrat ve oluşan ürünün bitki hücrelerine toksik olmaması gerekir, 2.Substratın hücre içerisine alınabilmesi ve oluşan ürünün kültür ortamına salınması gereklidir, 3.Ürün oluşumu yıkımdan hızlı olmalıdır.

PROTOPLAST KÜLTÜRLERİ

KULLANIM ALANLARI Bitki rejenerasyonu Fuzyon (somatik hibridizasyon)

Kallus protoplastları

Protoplast fuzyonu

Protoplast fuzyonu ile rejenere edilen bitki (Solanum spp)

İzole edilen yaprak protoplastları

Fuzyonu takiben gelişme A, b: mikrokallus C, d kallus gelişimi E, rejenerasyon

Protoplast kültürleri ile elde edilen somatik embriyolar (muz)

PROTOPLAST KÜLTÜRLERİ İlk enzimlerin elde edilmesi (Cocking, 1960) Protoplastlardan bitki eldesi (Takabe ve ark., 1970) Protoplast fuzyonu (Carlson ve ark., 1972)

BİTKİ HÜCRE DUVARI BİLEŞENLERİ Tek çeneklilerÇift çenekliler Selüloz% Hemiselüloz Pektin535

Evreler 1. Başlangıç materyali seçimi -Bitki türü-genotip -Yaş, hücre hayat döngüsü, fizyolojik durum -Eksplant ve donör materyal seçimi 2. Bitki materyali ve enzim karışımlarının hazırlanması -Yüzey sterilizasyonu -Enzim karışımları ve özellikler -Yıkama solüsyonları -Pre-plazmolizasyon -Ozmotik basınç

EVRELER 3. Protolast izolasyonu, saflaştırma ve testler - İnkübasyon metodu -Saflaştırma yöntemleri -Hücre duvarı kalıntısı, canlılık ve verim testleri -Diğer metodlar 4. Protoplast kültürü -Besin ortamının özellikleri, hormonlar -Kültür yoğunluğu -Kültür sistemleri (katı kültürler, sıvı kültürler, karma kültürler, nörs ve besleyici kültürler, ozmotik basıncın düşürülmesi) -

EVRELER 5. Protoplastlardan kallus oluşumu ve bitki rejenerasyonu -Besin ortamları ve yapılması planlanan değişiklikler -Ozmotik basıncın azaltılması -Kallusun rejenerasyon ortamına transferi ve sürgün oluşumu

EKSPLANT KAYNAKLARI Yaprak mezofil hücreleri Embriyogenik hücreler Genç bitki dokuları Olgunlaşmasını tamamlamamış bitki doku ve organları (embriyo, kotiledon, meyve kabuğu) Meristematik hücreleri içeren dokular Özel protoplast kaynakları (polen, sepal, petal, aleuron, stoma hücreleri, yumru dokular)

Plazmolizasyon ve yıkama solüsyonları KH2PO4, KNO3, CaCI2.2H2O, MgSO4+.7H2O, KI, CuSO4+.5H2O, Mannitol, Sakkaroz, Sorbitol

Enzimler Dokuyu parçalayan enzimler (Pektinazlar) Macerozyme R-10Rhizopus spp Pectolyase Y-23Aspergillus japonicus PectinaseAspergillus niger Pectinol ACAspergillus niger MaceraseRhizopus spp PATEBacillus polymxa

Enzimler Hücre duvarını eriten enzimler (Selülazlar) Cellulase R-10Aspergillus niger Cellulase Onozuka RSTrichoderma viride Cellulase YCTrichoderma viride CellulaseAspergillus niger CellulysinTrichoderma viride DriselaseIrpex lacteus MeicelaseTrichoderma viride

Enzimler Hemiselülazlar HelicaseHelix pomatia Rhozyme HP-150Aspergillus niger HemicellulaseAspergillus niger

İzolasyon sonrası uygulanan testler Hücre duvarı kalıntı testleri Canlılık testleri - Fenol safranin, Evans mavisi, Flourescein diacetate-FDA)

Kültüre alma yöntemleri Protoplastlar h/ml yoğunlukta kültüre alınır Sıvı damla kültürü ( µl damla, mm çaplı) Sıvı kültür (4 ml/5.5 cm petri kutusu) Agar içinde kültür Agar üzerinde sıvı kültür Agaroz ortamı kültürü-agaroz ile karıştırma Agaroz blokları kültürü-agaroz bloklarının sıvı ortama yerleştirilesi

Kültüre alma yöntemleri-devam… Agaroz damla kültürü ( µl damla halinde mikropipetle petriye yerleştirme, üzerine sıvı ortam ilave etme) Asılı veya oturan damla kültürü (20-40 µl damla petri tabanına veya üst kapağa yerleştirilir. Nörs kültürleri ve besleyici kültürler

Protoplastların kültür sonrası davranışları Strese tepki Tamir mekanizması Adaptasyon Hücre bölünmesi Morfogenez

SOMATİK MELEZLEME Çekirdek melezleri-Hibritler Sitoplazmik melezler-Sibritler Kromozom kayıpları

Örnekler Turunçgiller, anaç ıslahı (Citrus spp) Pamuk, genetik çeşitliliğin artırılması Patates ve domates fuzyonu (pomato) Brassica spp Populus spp Solanum spp

SOMATİK MELEZLEME PEG uygulamaları Elektrofuzyon ANALİZLER -Kodominant markır sistemleri-RFLP -Kromozom sayımı -Southern analizleri -Flow Sitometri -İzozimler -Morfolojik analizler

Doku Kültürü Uygulama Alanları Mikroçoğaltım Germplazm muhafazası Somaklonal varyasyon ve mutant seleksiyonu Embriyo kültürü Haploid ve Dihaploid Üretimi In vitro hibridizasyonu– Protoplast Fuzyonu

Bitki Doku Kültüründe Temel Öğeler İki önemli hormon grubu vardır – Oksinler: Kök gelişimi sağlar – Sitokininler: Sürgün gelişimi sağlar – ↑ Oksin ↓Sitokinin = Kök gelişimi – ↑ Sitokinin ↓Oksin = Sürgün gelişimi – Oksin= Sitokinin = Kallus gelişimi

Doku Kültürü Çalışmalarını Etkileyen Faktörler Gelişme Ortamı – Mineraller, hormonlar, karbon kaynağı, vitaminler Çevre Faktörleri Işık şiddeti, ısı, fotoperyot, sterilite, ortam içeriği, eksplant kaynağı –– Genç dokularda başarı Genetik Farklı türlerde farklı cevap

MİKROÇOĞALTIM İn vitro’da bitki çoğaltımı, ismine doğru bitkisel üretim, meristem eksplant kaynağıdır, kallus fazı yoktur, somaklonal varyasyon elemine edilir, problematik türlerde kallus da kullanılır.

MİKROÇOĞALTIM AMAÇLAR –Hastalık ve zararlılardan arındırılmış bitki materyallerinin elde edilmesi –Klonal çoğaltım a.Homojenite b.Kısa sürede üretim c.Zor üretilen türlerde başarı d.Üstün genotiplerin üretimi _ Somaklonal varyant hatların elde edilmesi

Mikroçoğaltım aşamaları Aşama 0: Seleksiyon, ana bitkinin hazırlanması, sterilizasyon Aşama 1: Kültürün başlatılması, ortam üzerine eksplanların alınması Aşama 2: Çoğaltım, kardeşlenme; sürgün gelişim ortamı üzerine eksplantların aktarılması Aşama 3: Köklenme Aşama 4: Toprağa aktarma

Mikroçoğaltım avantajları Klonal üretim Heterozigotluğun korunması Çoğaltım aşaması tekrar edilebilir Süs bitkilerinde ve vejetatif çolatılan ürün bitkilerinde ticari uygulama olanağı Çevreden ve tarla koşullarından mevsimsel etkilerden uzak yetişme koşulları

Mikroçoğaltımın bitki ıslahında kullanımı Virüs ile infeksiyonların engellenmesi (termoterapi ve meristem kültürü kombinasyonu) Markır elde etme amacı ile heterozigot hatların korunması Inbred popülasyonların çoğaltılması (erkek steril hatlar, az tohum oluşum özelliğinin korunması, tohumsuz bitki eldesi)

MİKROÇOĞALTIMDA KARŞILAŞILAN PROBLEMLER Vitrifikasyon-Camlaşma Toksik bileşiklerin ortamda birikmesi, kararma Kontaminasyon

GERMPLAZM KORUNMASI Bitki gen kaynaklarını muhafaza yöntemleri -Tohum -Bitki materyalleri (genç bitkiler, klima odaları-gözlem evleri -Organ (kalluslar) -Doku (sürgün ucu) -Hücre (hücre ve protoplastlar)

Germplazm Korunması Gelişmede yavaşlama: ↓ Isı ↓ Işık şiddeti, ortam modifikasyonu (ozmotik infibitör ilavesi, gelişme gerileticiler). Bu şekilde dokular 1-4 yıl kültüre alınarak korunabilir. Kriyoprezervasyon: Ultra düşük sıcaklıklar (- 196 oC), hücre bölünme ve metabolik işlevlerin durması, uzun süre muhafaza sağlanır

Kültüre alınmış hücrelerde büyüme oranını azaltan işlemler Mineral yağ ile kaplama (solunumu engelleme) Düşük basınç ve düşük oksijen (solunumu azaltma) Sakkaroz içermeyen ortamda kültüre alma (metabolik faaliyette azalma) Suyun azalması (dehidrasyon) Besin ortamına Absizik Asit ilavesi (5-10 mg/l) Mannitol ilavesi N-dimetil suksinik asit ilavesi Düşük sıcaklıkta depolama

Kriyoprezervasyon Ön kültür: hızlı büyüme kapasitesine sahip hücrelerin elde edilmesi; düşük su içeriği, küçük vakuoller. Kriyopreteksiyon: Gliserol, DMSO, PEG uygulamaları ile buz kristalleri zararının engellenmesi. Donma: En önemli aşamadır, yavaş donma (sitoplazmik dehidrasyonun engellenmesi), hızlı donma (interselüler donma, az dehidrasyon)

Depolama: Sıvı azot içerisinde (-196oC), buz kristal oluşumunun engellenmesi Çözme: Hızlı çözme ile buz kristal zararı engellenir Geliştirme: Kriyoprotektantlardan yıkama, ve kallus gelişiminin engellenmesi

Somaklonal Varyasyon Mutasyonlar, hibridizasyon ve poliploidy ile ortaya çıkar

Somaklonal varyasyon ve mutasyon ıslahı Kallus fazı içeren tüm rejenerasyon sistemlerinde meydana gelir. İki tiptir Kalıtsal: DNA değişimleri Stabil ama kalıtsal olmayan: epigenetik, gen ekspresyon sisteminde değişme

EPİGENETİK DNA sitozin metillenmeleri Histon kromatin modifikasyonları RNA interferens ve mikro RNA’lar RNA aracılığı ile DNA metilasyonu Transgen sessizleşmesi Paramutasyon Genomik “imprinting” Viruslerle gen sessizleşmesi

Paramutasyon Bir allelin ekspresyonunun diğer allele ilgili olarak değişmesi

Mutasyon teşviki Fiziksel mutajenler (radyasyon): Nötronlar, alfa ışınları İyonize ediciler: Kromozom anomalilerine neden olur, Gama, beta ve X ışınları Düşük seviye ışınları: UV radyasyonu, kromozom anormallikleri ve nokta mutasyonlarına neden olurlar. Kimyasal mutajenler: kanserojenler Diğer kimyasallar: toksik etkiye sahiplerdir, nokta mutasyolarına neden olurlar. Doku kültürü ile kallus oluşumu: Somaklonal varyasyon: kromozom anormallikleri, nokta mutasyonları

Klasik mutasyon ıslahı Mutajeler ile tohum uygulaması (radyasyon, kimyasallar) %50 oranında ölüm M1 bitkilerinin yetiştirilmesi Dominant mutasyon seleksiyonu M2 bitkilerinin üretilmesi Resesif mutasyonların belirlenmesi Segregasyon analizleri Mutant analizleri, stabil kalıtım

Somaklonal ıslah yöntemi Bitki doku kültürü tekniklerinin kullanımı Tek hücre seleksiyonu Süspansiyon kültürleri kullanımı, kallus da kullanılabilir, ortam ile kontak olması gerekir. Fiziksel veya kimyasal mutajen uygulaması yapılabilir Stes faktörü uygulanır Yüksek ölüm oranı beklemek gerekir, az sayıda hücre canlı kalmalıdır Tek hücrelerden rejeneresyon yapılır

Somaklonal-Mutasyon ıslahı Avantajları Yüksek sayıda popülasyon test edilebilir Tek hücreye stres faktörü uygulanabilir Dezavantajları Mutasyonların büyük bir bölümü kalıtsal değildir Dominant veya ikili resesif mutasyon istenir, ama mutasyonların çoğu resesiftir.

Herbisit daynıklığı-toleransı Dayanıklık: herbisiti yıkım, metabolize etme, yeni enzim ilavesi Tolerans: Herbisit varlığında gelişebilme. Glifosata dayanıklı domates, tütün, soya Glifosata tolerant petunia, havuç, domates (EPSP- (enolpyruvyl shikimate phosphate synthase artışı)

Somaklonal varyasyon ile bitki ıslahı Özel amino asitlerde birikim- buğdaygillerde Lisin Abiyotik stres toleransı- tuz, ısı Hastalık dayanıklığı Toksin veya kültür filtratı ilavesi

HAPLOİD BİTKİ ÜRETİMİ Haploidizasyon Dihaploidizasyon Haploid bitkiler her lokustaki allelerden sadece tek bir seri içerirler Homolog kromozom takımlarından bir set bulundururlar Resesif mutasyonlar belirlenebilir Haploid bitkilerin kromozom sayıları katlanabilir, ve bu şekilde %100 homozigot saf hatlar elde edilir. Islahta bu sistem ile süre kısaltılmış olur.

Avantajlar Kısa süre içinde homozigotluk sağlanabilir (dihaploidizasyon). Dioik türlerde, kendileme problemi olan bitkilerde ve gençlik kısırlığı bulunduran türlerde oldukça kullanışlıdır. Resesif mutasyonların belirlenmesinde etkin bir yöntemdir. Dominant etki ortadan kalkar. Tetraploid bitkilerden (yonca ve patates gibi) diploid bitkilerin elde edilmesi sağlanır. Doğada kendiliğinden meydana gelme oranı düşüktür. Temel araştırmalarda kullanılırlar

Androgenez-Anter Kültürü Erkek gametten haploid uyartımı 1953 yılında gerçekleştirildi İçerisinde polen bulunduran anterlerin, koruyucu kılıflarının uzaklaştırılarak kültüre alınmasıdır. Bu yapıda bulunan polen tanelerinden embriyogenez teşvikidir. 37 familya, 88 cins, 247 türde rapor edildi (Bajaj, 1989)

Anter kültürü Polen kültürü

Pirinçte polen kültürü

Polen kültürleri anter kültürlerine göre daha avantajlıdır. Anter kültürlerinde diploid bitkiler elde etme olasılığı vardır. Fakat polen kültürlerinde albino bitki gelişimi gözlenebilir.

Dişi Gametten Haploidi Uyartımı (Ginogenesis ve Partenogenesis) Ovul ve ovaryum kültürleri: Döllenmemiş yumurtalığın veya yumurta hücrelerinin kültüre alınması ile haploid embriyo ve bitki oluşumuna ovaryum veya ovul kültürleri adı verilir yıllarında ilk çalışmalar başlatılmıştır.

Kromozom Katlama Kendiliğinden meydana gelebilir Kimyasal uygulaması yapılabilir

Kimyasal Uygulamalar Azot protoksit Kafein Kloral hidrat Asenaften Sulfinilamid Etil Merkuriklorid Hekzaklorosiklohekzan Kolhisin

En fazla kullanılan kimyasal Kolhisin’dir. Liliaceae familyasına ait Colchicum automnale L (Güz çiğdemi) bitkisinin köklerinden elde edilir. Alkoloid yapıdadır, alkol, kloroform ve soğuk suda erir. Sıcak su ve Eter’de erimez. Kolhisin, Kolkisin, Kolçisin olarak ifade edilmektedir.

Kolhisin, dokuda hücrelerin mitoz bölünmenin Metafaz safhasında iğ iplikleri oluşumunu engeller. Ve replikasyona uğramış kromozomlar kutuplara çekilmez. Bu şekilde kromozom sayısı iki katına çıkar. Bu işleme Dihaploidizasyon adı verilir.

Kolhisin uygulama yöntemleri Kallus doku ve hücre süspansiyonlarına Kültüre alma ortamlarına Haploid bitki köklerine Aksiller tomurcuklara Çeliklere Tepe tomurcuklarına

Ploidi Belirleme Fenotipik gözlemler Kromozom sayımları Flow sitometri Stomatal incelemeler Moleküler yöntemler (kodominant markırlar-RFLP gibi)

Embriyo Kültürü Olgun tohumların embriyo kültürü Olgunlaşmamış, erken dönem bölünme fazındaki proembriyoların kültürü

Kullanım alanları Pre zigotik uyuşmazlıklar (pollen tüpü oluşmaz, zigot meydana gelmez. in vitro tozlama) Post zigotik uyuşmazlıklar (zigot meydana gelir, endosperm tarafından kabul edilmez.) Embriyo kurtarma tekniği

Kullanım alanları Temel biyolojik çalışmalar Tohum çimlenmemesi durumunda embriyo kültürü Islah süresini kısaltma Haploid bitki üretimi Tohum canlılık testi Nadir-Endemik bitkilerin çoğaltılması

Etkileyen faktörler Genotip Dönem Besin ortamı bileşimi

FUNGUSLAR-KONTAMİNASYON Aspergillus spp Alternaria spp Penicillium spp Rhizopus spp Rhizoctonia spp Mayalar