ÇOCUKLARDA NEDENİ BİLİNMEYEN BRONŞEKTAZİLERE KARŞI GENETİK YATKINLIKTA TAP-1 VE TAP-2 GEN POLİMORFİZMİNİN ROLÜNÜN BELİRLENMESİ Deniz Doğru, Filiz Özbaş Gerçeker, Ebru Yalçın, Ayşe Tana Aslan, Nazan Çobanoğlu, Uğur Özçelik, Nural Kiper  Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Göğüs Hastalıkları Ünitesi ve DNA Bankası

Bronşektazi, solunum yollarının yapı ve fonksiyonlarında kalıcı değişikliklere yolaçan kalıcı bir hastalıktır ve sık tekrarlayan akciğer enfeksiyonları ve bronşiyal ve peribronşiyal dokunun inflamatuar harabiyeti ile karakterizedir Çocuklarda bronşektazinin birçok nedeni bulunmaktadır; kistik fibrozis, enfeksiyonlar, tüberküloz, primer siliyer diskinezi, konjenital immün yetmezlikler, yabancı cisim aspirasyonları, astım, gastroözefageal reflü Ancak bazı vakalarda birçok laboratuar testlerine rağmen bronşektaziye yolaçan bir neden bulunamamaktadır.

HLA Class I Molekülleri Vücutta tüm çekirdekli hücrelerin yüzeyinde değişik düzeylerde eksprese olan polimorfik transmembran glikoproteinleridir Bu moleküller intrasellüler antijenik peptitleri sitotoksik T lenfositlerine sunarlar ve “natural killer” hücreleri gibi HLA class I binding reseptörlere bağlanan hücrelerin aktivitelerini regüle ederler

HLA Class I Molekülleri Biyosentezleri sırasında, HLA class I molekülleri, endoplazmik retikulumun lümeninde 8-11 aminoasit uzun peptidi ve beta2 mikroglobülin ile ilişkilidir Değişik HLA class I alelleri, çoğu sitozolik proteinlerin proteazom denilen büyük bir proteolitik kompleks tarafından yıkımından kaynaklanan değişik peptitlere bağlanırlar Sitozolik proteinlerin yıkımından kaynaklanan bu peptitlerin endoplazmik retikulum içine translokasyonu ise “transporter associated with antigen presentation” (TAP) tarafından yürütülür

Transporter associated with antigen presentation (TAP) Bir heterodimerdir Altıncı kromozomdaki class II bölgesindeki HLA lokusunda kodlanan TAP1 ve TAP2 adı verilen iki alt gruptan oluşur

Transporter associated with antigen presentation (TAP) Yeni sentezlenen protein Proteozom Peptidler TAP1 ve 2 subüniteleri CD8/T hücre reseptörü NK hücre reseptörü Ağır zincir ve beta2 mikroglobulin TAP1 ve TAP2 proteinlerinin mutasyonu veya delesyonu, peptitlerin endoplazmik retikuluma translokasyonunu bozmaktadır

TAP Eksikliği Sendromu Nadir görülen bir sendrom Genellikle hayatın ilk 6 yılında, sinüzit, ottitis media, nazal polip, nazal septum perforasyonu ile komplike olan kronik pürülan rinit gibi üst solunum yollarının tekrarlayan bakteriyel enfeksiyonları ile bulgu verir Alt solunum yollarında tekrar eden bakteriyel pnömoni ve bronşektazi meydana gelir

TAP Eksikliği Sendromu H. influenzae, S. pneumonia, E. coli, P.aeruginosa gibi ajanlar sıklıkla solunum yollarından izole edilirler Tekrar eden bakteriyel enfeksiyonlar sonucunda progresif akciğer hasarı ve ardından solunum yetmezliği ve ölüm meydana gelir

TAP Eksikliği Sendromu Cilt Nekrotizan granülomatöz lezyonlar Lökositoklastik vaskülit Kol ve bacaklarda simetrik purpura Santral sinir sistemi Beyin absesi Ensefalomyelit Gastrointestinal Kronik gastrit Psödomembranöz kolit Diğer Nonerozif simetrik poliartrit Retinal vaskülit

TAP Eksikliği Sendromu Tedavi Erken tanı Solunum yolları enfeksiyonlarının agressif tedavisi ve bronşektazinin önlenmesi Antibiyotik Göğüs fizyoterapisi İntravenöz immünglobülin

Amaç Daha önce, pansinüzit, nazal polip ve bronşektazisi olan iki kardeşte TAP2 gen mutasyonuna bağlı HLA class I antijen eksikliği saptanmış ve bu sendromun nedeni bilinemeyen bronşektazisi olan çocuklarda araştırılması önerilmiştir (Donato L, et al. J Pediatr 1995; 127: 895-900) Ülkemizde, sıklığı bilinmese de, nedeni yapılan çalışmalara rağmen aydınlatılamamış bronşektazisi olan bir grup çocuk mevcuttur Bu çalışmada nedeni belli olmayan bronşektazili çocuklarda TAP gen polimorfizmi ile hastalık arasında ilişki olup olmadığının ortaya konulması amaçlanmıştır

Materyal ve Metod Örnekler Kontrol grup Populasyonumuzu temsil edecek şekilde TÜBİTAK DNA/Doku Bankası’nda oluşturulmuş olan sağlıklı grup DNA paneli (n:100) Bireylerin yaş aralığı 25-45 Kadın/erkek oranı 1:1.2

Materyal ve Metod Hasta grubu Akciğerlerde, nedeni bilinemeyen bronşektazisi olan toplam 44 adet çocuk hasta alındı 20 erkek, 24 kız Çalışmaya alındıkları sırada yaş: 3 - 20 yıl (ortanca değeri 13 yıl) Hepsinde bronşektaziyi düşündürecek uzun süreli öksürük, balgam çıkarma, tekrarlayan akciğer enfeksiyonu gibi şikayetler Fizik muayenede akciğerde ral ve/veya ronküs ve parmaklarda çomaklaşma 19 hastanın (%43.2) anne babası arasında akrabalık var 7 hastanın (%15.9) kardeşinde benzer şikayetler var

Materyal ve Metod Hasta grubu Tüm hastalarda bronşektazi varlığı yüksek rezolüsyonlu toraks tomografisi ile kanıtlandı 10 hastada lobektomi materyallerinin patolojik incelemesinde bronşektazi tanısı doğrulandı Bronşektazi yerleşimi 20 hastada sağ alt 16 hastada sağ orta 10 hastada sağ üst 33 hastada sol alt 11 hastada sol üst 27 hastada birden çok lobda bronşektazi

Yüksek tuz konsantrasyonu ile DNA eldesi Materyal ve Metod Yüksek tuz konsantrasyonu ile DNA eldesi EDTA’ lı tüplere alınan 10 cc. periferal kan 50 ml’ lik steril tüplere aktarılarak üzerine 40 ml steril soğuk distile su eklendi ve 1-2 dakika eritrositleri patlatmak için tüpler aşağı-yukarı çırpıldı. Tüpler 2000 rpm de 10 dakika santrifüj edildi. Supernatan atıldı ve pelletin üzerine 25 ml steril soğuk distile su eklendi , pellet çözülene kadar tüpler çırpıldı. 2000 rpm de 10 dakika santrifüj edildi. Supernatan atıldı ve pelletin üzerine 3 ml Nüclei Lysis (pH:8.2) tamponu, 200 l Sodyum dodesil sülfat (SDS) ve 150 l proteinaz K eklendi Tüpler 37C de 16 saat inkübasyona bırakıldı. 2 ml amonyum asetat eklendikten sonra tüpler 1 dakika sallandı ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletildi.

Yüksek tuz konsantrasyonu ile DNA eldesi Materyal ve Metod Yüksek tuz konsantrasyonu ile DNA eldesi 3500 rpm de 15 dakika santrifüj edildi Supernatan başka bir tüpe dikkatlice toplanarak üzerine 2 hacim etanol eklendi DNA ‘nın toplanması için yavaşça tüp aşağı yukarı sallandı. DNA bir eppendorf tüp içerisinde 500 l TE (Tris-EDTA, pH:7.4) tamponunda çözülerek –80 C de saklandı

Materyal ve Metod TAP1 ve TAP2 gen polimorfizmlerinin analizi PCR (Polymerase Chain Reaction) – RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) tekniği kullanılarak TAP 1 geninde iki polimorfizm (kodon 333 ve kodon 637) TAP 2 geninde üç polimorfizm (kodon 379, kodon 565 ve kodon 665) bronşektazi hastalarında ve kontrol örneklerinde çalışıldı

İstatistiksel analizler Materyal ve Metod İstatistiksel analizler TAP genlerinde birden fazla polimorfik bölgede heterozigotluk görülebileceği için allel/haplotip frekansı yerine genotip frekanslarının kullanılması tercih edildi Hasta ve kontrol grubu için hesaplanan genotip frekansları 2X3 2 testi ile karşılaştırıldı (StatsTM, Decision Analyst, Inc. Version 1.1, Arlington).

Bulgular TAP polimorfizmleri Kontrol grubu Bronşektazi (n =100) ( %) (n = 44) ( %) 2 TAP1-333 Genotipler Ile/Ile 75 75 26 59 Ile/Val 21 21 17 39 7.97 Val/Val 4 4 1 2 TAP1-637 Asp/Asp 82 82 31 70 Asp/Gly 4 4 12 27 27 Gly/Gly 14 14 1 2 TAP2-379 Ile/Ile 25 25 1 2 Ile/Val 1 1 7 16 33.2 Val/Val 74 74 36 82

Bulgular TAP polimorfizmleri Kontrol grubu Bronşektazi (n =100) ( %) (n = 44) ( %) 2   TAP2-565 Genotipler Thr/Thr 1 1 0 0 Thr/Ala 4 4 2 5 anlamlı değil Ala/Ala 95 95 42 95 TAP2-665 Thr/Thr 99 99 13 30 Thr/Ala 1 1 15 34 104 Ala/Ala 0  0 16 36

Bulgular Bronşektazi grubunda TAP1-333 polimorfizmi Ile/Ile genotipinde azalma Ile/Val genotipinde artış (2 = 7.97, d.f: 2, p0.025) TAP1-637 polimorfizmi Asp/Asp ve Gly/Gly genotiplerinde azalma Asp/Gly frekansında artış (2 = 27, d.f:2, p<0.001) TAP2-379 polimorfizmi Ile/Val genotipinde artış Ile/Ile genotipinde azalma (2 = 33.2, d.f:2, p<0.001) TAP2-665 polimorfizmi Thr/Thr genotip frekansında düşüş Thr/Ala ve Ala/Ala genotiplerinde artış (2 = 104, d.f:2, p0.001)

Bulgular Bronşektazi grubunda Sadece TAP2-565 polimorfizmi için genotip frekansları kontrol ve hasta grubunda istatistiksel olarak anlamlı bir fark göstermemektedir (2 = 1.1, d.f:2, p1).

Sonuç Hasta ve kontrol gruplarının TAP1 ve TAP2 gen polimorfizmlerinin genotip frekanslarına bakıldığında, çalışılan 5 polimorfizmin 4’ünde hasta ve kontrol grupları arasında istatistiksel olarak anlamlı farklar bulunmuştur Bu da çalıştığımız nedeni bilinmeyen bronşektazili hasta grubunda genetik olarak TAP eksikliğine ait bulgular olabileceğini düşündürmektedir Ülkemizde idyopatik bronşektazide genetik yatkınlıkta TAP gen polimorfizminin ilk defa araştırıldığı bu çalışmada bu genlerdeki polimorfizmin bronşektaziye yatkınlığını artırdığına dair bulgular saptanmıştır

Sonuç Kesin yargıya varabilmek için hasta sayısının çoğaltılması, hasta ve aile içi hasta olmayan bireylerin bu açıdan karşılaştırılması gereklidir Nedeni bulunamayan bronşektazili hastalarda tanının akılda tutulması bu hastaların erken dönemde tanınmasını ve böylece akciğere yönelik yoğun tedavinin erkenden başlanmasını sağlayacak, bu da hastaların hem hayat kalitesini yükseltecek, hem de prognoza katkıda bulunacaktır