STRs; microsatellites (Short Tandem Repeats) Candan EKER İstanbul Üniversitesi Moleküler Biyoloji ve Genetik - 8 Mayıs 2008 -
Sunum içeriği STR nedir? Uygulama alanları Forensic STR Analizi Referans makaleden uygulama örneği
STR (Short tandem repeats), iki ile yedi nukleotid dizisinin tekrarlandığı DNA fragmentidir ve bu tekrarlı diziler birliktelik gösterirler. 2 – 10 bp tekrar boyu (örneğin bir genomik bölgede (CATG) ) Kodlama yapmayan intron bölgelerinde (junk DNA)
Allel adı DNA fragmentindeki ‘tandem repeat’ sayısı ile ilişkilidir. Her alleldeki tekrar sayısı birbirinden farklı olabilir, bu nedenle iki allel arasındaki farklılık allellerin elektroforez ile ayrılmasıyla belirgin hale getirilebilir. Allel adı DNA fragmentindeki ‘tandem repeat’ sayısı ile ilişkilidir. Pek çok STR bölgesine eş zamanlı DNA amplifikasyonu uygulanabilir ve boy farklılıklarından ya da farklı fluoresan molekülleriyle işaretlenmelerine göre birbirlerinden ayırt edilebilirler. Schematic representation of the analysis of Short Tandem Repeats (STRs). Copyright © Katholieke Universiteit Leuven URL: http://med.kuleuven.be/labfor/index.html
İlgili bir lokustaki yeterli oranda STR bölgelerinin incelenmesi ve bu spesifik STR dizisinin ne oranda tekrarlandığı hesaplanarak bireye özgü genetik profil oluşturulması mümkündür. İnsan genomunda bulunan 10.000’in üzerinde yayımlanmış STR dizisi mevcut. Adli olaylarda STR analizi, genetik profillerin belirlenmesi için yaygın kullanılan bir analiz metodu haline gelmiştir.
STR dizileri, populasyonda polimorfik dağılımın oluşturulması için belirli dizi tekrarlarını değişken sayılarda içermesi nedeniyle VNTR dizileriyle benzerlik gösterir. İkisi arasındaki en önemli farklılık ‘core sequence’ genellikle 3 ya da 4 nukleotid boyundadır (VNTR core dizileri ise 16 ve daha fazla nukleotidden oluşabilir).
STR tiplendirme uygulamaları Adli alandaki DNA analizi DNA veritabanı oluşturulması Afet durumlarında Kayıp kişilerin belirlenmesi Askeri alanda (savaş, ölüm) Ebeveyn ve akrabalık testi: babalık testi, göç durumları, miras davaları Genetik Soyağacı (Genealogy) & Tarihi soruların cevaplandırılması İnsan soyunun belgelenmesi(Authenticating Human Cell Lines) Genetik kimeraların belirlenmesi Transplantların denetimi Kanser tümörlerinin saptanması Genetik hastalıkların haritalanması İnsan populasyonundaki çeşitliliğin incelenmesi
Forensic STR analizi STR analizi, adli alanda 1990’ların ortalarında populeritesini kazanmaya başlayan yeni bir teknolojidir. Bireylerin genetik parmakizlerinin oluşturulmasında kullanılır. Günümüzde adli analizler için kullanılan STR’lar dört ya da beş nukleotid tekrarlarından oluşur(4 ya da 5 tekrar ünitesi). Forensic DNA profiling’ de kısa boyuttaki STRs (amplimers: 100-500 bp) kullanılarak PCR ile daha etkin çoğaltım sağlanır. Ayrıca küçük DNA fragmentleri bütün STR bölgelerini içerebileceğinden önemli derecede yıkıma uğramış DNA’nın kullanımına olanak verir. Primerler DNA’da STR dizisini kuşatacak şekilde dizayn edilir. PCR’da primerler arasında kalan STR bölgesini içeren kısımın çoğaltımı yapılır. Böylece bireyler arasındaki allelik farklılıklar amplifikasyon ürünlerinin boylarındaki farklılıklara göre belirlenebilir.
STR Analiz Metodu İlgilenilen örnek hücrelerden nuklear DNA izolasyonu yapılır. İzole edilen DNA’daki spesifik polimorfik bölgeler PCR ile çoğaltılır. Çoğaltılan bölgeler, jel elektroforezi ya da kapiller elektroforez ile birbirinden ayrılır ( STR dizisinin ne kadar tekrardan oluştuğunu belirlemeye olanak verir.) Jel elektroforezi kullanılmışsa DNA’nın görünür hale getirilmesi, Gümüş boyama (çok yüksek çözünürlükte değil, güvenli, ucuz) Etidyum bromür (oldukça hassas, sağlık riski, ucuz) Floresan boyalar(modern adli lab.larda kullanılıyor, yüksek duyarlılık, güvenli, pahalı). STR fragmentleri kapiler elektroforezle ayrılmışsa yüksek etki gösteren floresan boyalar kullanılır.
Multiplex STRs Belirli sayıdaki STR lokusu, üst üste gelmeyen allelik dağılımdan yararlanılarak tanımlanabilir. Bu da multiplex PCR amplifikasyonu kullanılarak multiple loci’nin tek bir poliakrilamid jelde ayırımını sağlar. Farklı floresan boyalar kullanılarak STR lokuslarının multiplex amplifikasyonu sağlanır. Allel dağılımlarına göre ‘overlap’ olan her STR için farklı bir boya kullanılır. Boyalar primerlere bağlanarak amplifikasyon gerçekleştirilir, böylece farklı loci’ler kolaylıkla belirlenebilir.
The GenePrint® PowerPlex™ 2. 1 System from PromegaTM The GenePrint® PowerPlex™ 2.1 System from PromegaTM. Twelve DNA samples (lanes 112) were amplified and are shown with allelic ladders (lanes L) for each of the nine loci contained in the GenePrint® PowerPlex™ 2.1 System.
STR’ lar jel yerine Capillary Electrophoresis ile de analiz edilebilir STR’ lar jel yerine Capillary Electrophoresis ile de analiz edilebilir. Aşağıdaki sonuç, floresan işaretli Profiler Plus ve COfiler STR sistemlerini içeren ABI PRISM 310 Genetic Analyzer kullanılarak elde edilmiştir. Üst üste gelen allellerdeki STR bölgeleri için farklı renkteki boyalar kullanılır.
United States’de→ 13 STR lokusu, bir bireyin genetik profilinin oluşturulmasında temel alınıyor. Bu profiller yerel, eyalet ve ulusal düzeylerde DNA veri bankalarında depolanmaktadır(örn. CODIS) The British system→ 10 lokus kullanmaktadır. STR lokus belirlenmesinde UK National DNA Database (NDNAD). Y-STRs (Y kromozomu üzerindeki STR’ler), soy ağacı(genealogical) DNA testlerinde sıklıkla kullanılmaktadır.
1. Giriş Vücuttaki en dayanıklı doku, kemik dokusudur. Parçalanma ve bozulma diğer dokulara göre kısa sürede olmaz, fakat oldukça mineralize yapısından dolayı DNA ekstraksiyonu ve amplifikasyonu güçtür. Bu çalışmada gösterilmek istenilen; yumuşak dokular tamamiyle parçalanıp kullanışsız hale geldiğinde, adli bilimcilerin her türlü yüksek mineralize kemiklerden yüksek verimlilikte DNA saflaştırabilme şanslarının olmasıdır. -Bu da dünya çapında kullanılan AmpFLSTR Identifiler kit (Applied Biosystem) ile elde edilebilir.
2. Materyal ve metod 2.1 Kemik dokularına ön uygulama ve DNA ekstraksiyonu Birinci durum: bir kadın ölümünden 8 ay sonra denizde bulunup, otopsi sırasında elde edilen femurun(kalça kemiği) bir bölümü DNA ekstraksiyonu için seçilmiştir. Uzun süre denizde kaldığından gerek mekanik kuvvetten gerekse de çürümeden dolayı ekstraksiyon için uygun doku bulunamamıştır. İkinci durum: bir kadın öldürülüp derin bir yere gömüldükten birkaç ay sonra bulunmuştur. Kafatası ve bazı uzun kemikleri dışında bir şey bulunamamıştır. Bu yüzden DNA ektraksiyonu için kortikal kemik fragmenti(uzun kemiklerden) kullanılmıştır. Üçüncü durum: bir erkek öldürülmüş ve yakılmıştır. Yumuşak dokuları tamamiyle kömürleştiği için analiz edilecek örnekleri seçmek güç olmuştur. DNA ekstraksiyonu için bir parça kıkırdak dokusundan yararlanılmıştır.
Kemiklere öncelikle UV uygulanıp, ardından dekalsifikasyonun hızlı olabilmesi için mineralize toz haline getirilmiştir. Dekalsifikasyon için 3 gün 0.5M EDTA’da tutulup, 5-6 saat süresince de SEB buffer da 56˚C’de inkübasyon edilmiştir. SEB buffer: 10 mM Tris-HCl pH 8.0 , 400 mM NaCl , %2 SDS, 2 mM EDTA, 40mM DTT. Bu aşamadan sonra kitte bulunan “incubation buffer” yerine 1,5 mg Proteinaz K içeren SEB’de 1 gece 56˚C de tutulmuştur. Sonra, eşit miktardaki kemik tozuyla başlanan ekstraksiyon verimliliğini karşılaştırmak için hem geleneksel fenol-kloroform tekniği hem de IQ protokol uygulanmıştır.
2.2 Genotip parmakizlerinde karşılaştırma için kullanılacak örneklerden DNA ekstraksiyonu Ölü olarak bulunan kişilerin kimliklerini tespit edebilmek için aileleri olabilecek kişilerden karşılaştırma amaçlı tükürük örnekleri alınmıştır. Chelex® 100 (Biorad)’ a dayalı DNA ekstraksiyon protokolü uygulanmıştır.
2.3 Amplifikasyon ve STR analizi AmpFLSTR Identifiler® kit prosedürüne göre multiplex PCR kullanılmıştır. Amelogenin(cinsiyet belirlemesi için), D7S820, D21S11, D18S51,D5S818, D3S1358, TPOX, CSFPO1, FGA, vWA, D19S433, D2S1338, D8S1179, D13S317, TH01, D16S539. PCR ürünleri kapiler elektroforez ile polimer substrat üzerinde ayrılmıştır. -bunun için denatüre edici koşullarda 3100 AB Prism Genetic Analyzer kullanılmıştır. Sonuçlar Genescan ve Genotyper Software’leri (v 3.7) ile analiz edilmiştir. ABI PRISM 3100 DNA Sequencer
2.4 İstatistiksel olarak ailenin belirlenmesi (Paternity statistical determination) Ölü bireylerin aileleriyle ilişkilerini belirlemek için ‘Familias’ istatistik software kullanılmıştır. - genel allelik loci’lerin varlığından yola çıkarak % 99.9999 ailesel ilişkiyi hesaplamaya yaramaktadır.
Kaynaklar N. Staiti, D. Di Martino, L. Saravo, A novel approach in personal identification from tissue samples undergone different processes through STR typing, Forensic Science International, 2004, 146S: 171-173. National Institute of Standards and Technology (NIST) – STR database http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/index.htm http://science.kennesaw.edu/.../forensicpolymorphs.html Butler, J.M. (2006) Genetics and genomics of core STR loci used in human identity testing. J. Forensic Sci. 51(2): 253-265 http://med.kuleuven.be/labfor/index.html (Katholieke Universiteit Leuven)
TEŞEKKÜRLER