Primer Tasarımı

PCR

PCR

Polimeraz Zincir Reaksiyonu DNA ya da RNA dizilerini eksponensiyal olarak amplifiye etmeye yarayan yöntem. Temel gerekliler kalıp DNA ya da RNA Kalıp DNA’nın farklı iki yerine spesifik 2 oligonükleotid primeri Isıya dayanıklı DNA polimeraz 4 dNTP ve tampon

Primer nedir? Primer, PZR’den sekanslamaya pek çok moleküler teknikte kullanılan kısa sentetik oligonükleotitlerdir.

Primerler nereden gelir ? Tek sarmal DNA olarak kimyasal olarak sentezlenir. Genellikle 15-25 nükleotid uzunluğundadır. Nükleotid sekansı bilinen kalıp DNA sekansı kullanılarak belirlenir.

Dikkat edilemesi gereken noktalar Primerlerin Nitelikleri: Primer Tasarımı: Tek, özgün Spesifiklik Hedef sekansa 100% uyum (nonspesifik bağlanmalardan kaçınılmalı) Uzunluk Baz kompozisyonu İnternal stabilite Stabilite PZR koşullarında kalıp DNA ile stabil hibrit oluşturma Erime sıcaklığı Bağlanma sıcaklığı Internal yapı Uyumluluk Çift olarak kullanılan primerlerin aynı PZR kondisyonlarında çalışması gereklidir Primer Çiftinin Uyumu

Özgünlük Eşsiz değil ! Eşsiz! Kalıp DNA üzerinde primerlerin bağlanabileceği sadece bir tek hedef bağlanma bölgesi olabilir. Primereri özgün kılan bu özelikleridir. Olası kontaminant kaynaklarda bağlanma bölgesi omamalı. BLAST!! Template DNA 5’...TCAACTTAGCATGATCGGGTA...GTAGCAGTTGACTGTACAACTCAGCAA...3’ TGCTAAGTTG CAGTCAACTGCTAC TGCTGAGTTG Primer adayı 1 5’-TGCTAAGTTG-3’ Eşsiz değil ! Primer adayı 2 5’-CAGTCAACTGCTAC-3’ Eşsiz!

Uzunluk Primer uzunlukları primerin özgünlüğünü, erime/bağlanma sıcaklığını etkiler Primer uzun oldukça = daha özgün Primer uzun oldukça = Yüksek erime/bağlanma sıcaklığı. Genel olarak, primerin uzunluğu, özgünlüğü sağlamak amacıyla en az 15 nukleotid omalıdır. Primerler genel olarak 17-28 baz uzunluğunda tasarlanır. Bu aralık doğru Tm ve uzunluk ilşkisi yakalamaya bağlı olarak değişiklik gösterir.

Baz Kompozisyonu Baz kompozisyonu hibridizasyon spesifisitesini, erime/bağlanma sıcaklığını ve internal stabiliteyi etkiler. Rastgele baz kompozisyonu tercih edilir. (A+T) ve (G+C) bazları açısından zengin bölgelerden kaçınılır. Kalıp DNA 5’...TCAACTTAGCATGATCGGGCA...AAGATGCACGGGCCTGTACACAA...3’ TGCCCGATCATGCT GCCCG CAT T T AT GC Genellikle ortalama (G+C) içeriği %50-60 civarında olan primerler en optimum erime/bağlanma sıcaklığını verirler. Ancak bu sıcaklıkları etkileyen diğer faktörler de vardır.

Erime Sıcaklığı Erime sıcaklığı, Tm – DNA sarmalının yarısının tekli sarmal yarısının çift sarmal haline geldiği sıcaklıktır. Tm DNA kompozisyonundan etkilenir. G+C içeriği fazla ise Tm, H bağları sebebiyle yüksek olur.

Primer Erime Sıcaklığı Basit metod (Thein ve Wallace 1986): A ve T = 2o C G ve C = 4o C Tm: 2*(A+T)+4*(G+C) Primer dizisinde bulunan A ve T sayısı toplanır ve 2 ile çarpılır, Primer dizisinde bulunan G ve C sayısı toplanır ve 4 ile çarpılır. Bu iki sayı birbiri ile toplanır, bu değer yaklaşık erime sıcaklığını verir. Bağlanma sıcaklığı: Tm-4oC

Melting Temperature Tm(oK)= {ΔH/ ΔS + R ln(C)}, Or Melting Temperature Tm(oC) = {ΔH/ ΔS + R ln(C)} - 273.15 where ΔH (kcal/mole) : H is the Enthalpy. Enthalpy is the amount of heat energy possessed by substances. ΔH is the change in Enthalpy. In the above formula the ΔH is obtained by adding up all the di-nucleotide pairs enthalpy values of each nearest neighbor base pair. ΔS (kcal/mole) : S is the amount of disorder a system exhibits is called entropy. ΔS is change in Entropy. Here it is obtained by adding up all the di-nucleotide pairs entropy values of each nearest neighbor base pair. An additional salt correction is added as the Nearest Neighbor parameters were obtained from DNA melting studies conducted in 1M Na+ buffer and this is the default condition used for all calculations. ΔS (salt correction) = ΔS (1M NaCl )+ 0.368 x N x ln([Na+]) Where
N is the number of nucleotide pairs in the primer ( primer length -1).
[Na+] is salt equivalent in mM. [Na+] calculation: [Na+] = Monovalent ion concentration +4 x free Mg2+.

Annealing Temperature Ta = 0.3 x Tm(primer) + 0.7 Tm (product) – 14.9 where,

Tm(primer) = Melting Temperature of the primers Tm(product) = Melting temperature of the product

Primer Bağlanma “Stringency” Stringency çoğalan DNA ürününün spesifikliğini belirler. Tbağlanma primerin bağlanmasındaki stringency’i etkileyen en belirgin faktördür. Tbağlanma : çok düşük ise  daha az stringent  primer başka bölgelere bağlanabilir çok yüksek ise daha fazla stringent  primer bağlanamayabilir Diğer Faktörler: GC%: GC çiftleri AT çiftlerine göre daha stringenttır. Tuz & Tampon

Internal Yapı Eğer primerler kalıp DNA’ya bağlanmak yerine kendi kendilerine ya da birbirleri ile bağlanırlarsa PZR’nin verimi büyük ölçüde düşer. Bu 2 yapılar eğer bağlanma sıcaklığı izin vermezse zararlı olmayabilirler. Mesela bazı dimerler ve saç tokası yapıları 30 C’de oluşurlar, ancak PZR sırasında en düşük sıcaklık 60 C bağlanma sıcaklığı ise bu ikincil yapılar oluşamazlar.

Primer Çifti Uyumu Primerler çift olarak çalışırlar– ileri ve geri primerler İki primer de aynı PZR reaksiyonunda çalışacağı için, PZR koşullarının her iki primer için de uygun olması gerekir. Önemli özelliklerden bir tanesi bağlanma sıcaklığıdır. Primer çiftinin sıcaklığı birbiri ile uyumlu olmalıdır. Aralarındaki kabul edilebilinecek maksimum fark 3 C olabilir.

Özet ~ Primer Tasarım Kriterleri Özgünlük: doğru bağlanma bölgesi; Uzunluk: 17-28 baz. değişken; Baz kompozisyonu: ortalama (G+C) içeriği %50-60 civarında olmalıdır; uzun (A+T) ve (G+C) zengin bölgelerden kaçınılmalı; Baz çiftleşmesinin optimizasyonu: Yanlış eşleşmeyi engellemek için 5’ ucunudaki stabilitenin fazla 3’stabilitenin az olması gerekmektedir. Erime sıcaklığı (Tm) 55-80 C arasında olmalıdır; Primer çiftleri arasındaki Tm farkı en fazla 2-3 C olabilir. Internal ikincil yapılar engellenmelidir: dimerler ve saç tokası yapıları

Özet ~ “primer” ne zaman primerdir? 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 19

Dejenere Primerler Benzerlik ilişkisini göz önünde bulundurarak yeni genler bulmak için kullanılır. Bir organizmanın genomunda korunmuş bölgeleri amplifiye etmek için kullanılır. Hizalanan diziler arasında özgün bir bölge bulunmadığı taktirde “Universal” primer tasarlamak için kullanılır.

Nucleotide Represented Dejenere Primerler Abbreviation Letter Nucleotide Represented A  A C  C G  G T  T R  AG Y  CT M  AC K  GT W  AT S  CG B  CGT D  AGT H  ACT V  ACG N  ACGT eg: 5’-TCG AAT TCI CCY AAY TGR CCN T-3’ Y = pYrimidines = C / T (degeneracy = 2X) R = puRines = A / G (degeneracy = 2X) I  = Inosine  = C / G / A / T  N = Nucleotide = C / G / A / T (degeneracy = 4X)  

Dejenere Primerler A potential degenerate primer: ATG A[T/C]A AA[T/C] ATC CGA AAA AC[T/A/C]C A H Y Y

Dejenere Primerler Dejenerasyonu kompanse etmek için primer konsantrasyonlarının fazla kullanılması gerekir (>50 pmol). Birden fazla bağlanma bölgesi Ürün oluşmayabilir

Universal Primers Primers can also be designed to amplify multiple products. We call such primers “universal primers”. For example, design primers to amplify all HPV genes. Strategy: Align groups of sequences you want to amplify. Find the most conservative regions at 5’ end and at 3’ end. Design forward primer at the 5’ conservative region. Design reverse primer at the 3’ conservative regions. Matching forward and reverse primers to find the best pair. Ensure uniqueness in all template sequences. Ensure uniqueness in possible contaminant sources.

Semi-Universal Primers Primers can be designed to amplify only a subset of template sequences from a large group of similar sequences. For example, design primer to amplify HPV type 1 and type 6 gene, but not other types. Strategy: Align all types of HPV genes. Identify a subset of genes that are more similar to each other than to other subsets. In this case, type 1 and type 6. Find the 5’ and 3’ regions that are conserved between type 1 and type 6, but are variable in other types. Design forward primers from the 5’ region and reverse primers from the 3’ region. Matching forward and reverse primers to find the best pair. Ensure uniqueness in all template sequences. Ensure uniqueness in possible contaminant sources.

Primer Design Tools AutoPrime Primer design for real-time PCR measurement of eukaryotic gene expression. ExonPrimer Design intronic primers for PCR amplification of exons. Input needed: a cDNA and the corresponding genomic sequence. IDT AntiSense Design Antisense oligo design and selection tool. IDT Oligo Analyzer Online calculation of oligonucleotide parameters such as melting temperature. Shows self-dimers, hairpin, and performs Blast. IDT PrimerQuest Primer and probe design and selection. Oligonucleotide Analyzer Generates Tm, free energy, molecular weight and hairpin and dimer formation structures. Primer3 Utility for locating oligonucleotide primers for PCR amplification of DNA sequences. PrimerX Automated design of mutagenic primers for site-directed mutagenesis. Primo Pro PCR Primer Design. RNAi Design Design duplexed RNA oligos for RNA interference. SiteFind Design of oligonucleotide primers for site-directed- mutageneis that include a novel restriction for use as a marker of successful mutation.

Primer Design Tools MethPrimer (Long-Cheng Li, UCSF) A free online program for designing primers for methylation specific PCR (MSP) and bisulfite sequencing PCR. Primerfinder (Univ. of Texas-SW Med. Ctr) Easy to use, free, online primer design program Primo (Chang Bioscience) Primo online is a friendly PCR primer design tool. It reduces PCR noise by lowering the probability of random primering. The PCR Suite (Van Baren MJ, Heutink P, Erasmus Medical Center)

Primer3 http://frodo.wi.mit.edu/primer3/

Primer3 http://frodo.wi.mit.edu/primer3/

Primer3

Primer3

Primer3

Primer.exe